一种具有双期释放活性因子功能的骨缺损修复支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料领域，具体涉及一种具有双期释放活性因子功能的骨缺损修复支架。

背景技术

骨组织缺损多由于肿瘤、外伤、炎症等机体无法自行愈合、再生以及修复的因素造成，其典型的临床表现为机体原始组织结构完整性的破坏，最终导致不可逆的支持骨组织缺损，严重破坏了机体内自行进行促进成骨、骨改建、骨平衡的过程，进而导致了患者整体组织功能障碍、破坏性缺陷和生活质量的下降。

肿瘤、外伤、感染等原因造成的骨组织缺损通常面积较大，且形态不规则，而伴随的炎症感染严重影响骨再生修复，目前尚无行之有效的治疗手段。

传统的骨组织缺损修复方法(自体骨移植、同种异体骨移植、异种骨移植)和人工替代性材料移植(金属合金、钛网、陶瓷、大分子聚合物)可以重建与原始周围骨组织较为匹配的骨缺损，甚至一定程度上修复机体的临界性骨缺损部位，但是对于面积以及复杂程度远远超出临界性骨缺损纤维性愈合的修复，机体临床免疫反应等诸多问题仍有许多局限性。尤其是尚无法达到内源性骨愈合的效果，天然骨组织缺损修复仍然面临巨大的困难和挑战。

现有支架材料难以适配不规则骨缺损形态，且其功能较为单一，无法同时实现抗炎和促神经血管化的效果，促骨再生效果有限。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种具有双期释放活性因子功能的骨缺损修复支架。

本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：

一种具有双期释放活性因子功能的骨缺损修复支架，其原料包括：

I期材料--含有Nell-1的磷酸钙糊状物

CPC粉末：包括磷酸四钙和无水磷酸氢钙，两者的质量比为磷酸四钙：无水磷酸氢钙(2-4):1

水：CPC粉末和水的质量比为(1.5-2.5):1；

Nell-1：在水中的浓度为100ng/ml-1000ng/ml；

CPC粉末和水形成糊状物；

II期材料--生物墨水

藻酸盐溶液：1％-5％

Nell-1：为100ng/ml-1600ng/ml生物墨水总体积

种子细胞：1x 10

I期材料总质量和II期材料总质量的比例范围为：1mg-10mg含有Nell-1的磷酸钙糊状物:1-10μl生物墨水。

进一步地，所述种子细胞包括hPDLSCs人牙周膜干细胞、牙髓干细胞、多功能干细胞骨髓干细胞等MSC系列种子细胞中的至少一种。

进一步地，所述藻酸盐为采用高碘酸钠进行化学改性产生的可降解的氧化藻酸盐。

进一步地，在生物墨水中，还含有纤维蛋白原，其加入藻酸盐溶液中，终浓度为0.1％-1％。

本发明的另一目的，在于提供一种具有双期释放活性因子功能的骨缺损修复支架的制备方法，包括如下步骤：

步骤一：磷酸四钙和无水磷酸氢钙组成CPC粉末；

配置Nell-1溶液；

将CPC粉末加入Nell-1溶液中，搅拌成为含有Nell-1的磷酸钙糊状物；

步骤二：配置藻酸盐溶液；

再加入种子细胞和Nell-1，形成1x 10

步骤三：步骤一的含有Nell-1的磷酸钙糊状物和步骤二的生物墨水进行混合，得到所述具有双期释放活性因子功能的骨缺损修复支架。

进一步地，步骤一中，磷酸四钙和无水磷酸氢钙的质量比范围为(2-4):1。

进一步地，步骤一中，生物活性因子Nell-1浓度大于100ng/ml。优选为100ng/ml-1000ng/ml。如果小于100ng/ml，效果变差，如果高于1000ng/ml，价格过高。在100ng/ml-1000ng/ml范围内，浓度越高效果越好。

进一步地，步骤一中，CPC粉末加入Nell-1溶液中，两者的质量比为(1.5-2.5):1。

进一步地，步骤二中，藻酸盐溶液浓度范围为1％-5％。

进一步地，步骤二中，纤维蛋白原的浓度范围为0.1-1％。

进一步地，步骤二中，Nell-1：含量为大于100ng/ml。优选100ng/ml-1600ng/ml生物墨水总体积。如果小于100ng/ml，效果变差，如果高于1000ng/ml，价格过高。在100ng/ml-1600ng/ml范围内，浓度越高效果越好。

进一步地，步骤三中，混合比例为1mg-10mg磷酸钙糊状物:1μl-10μl生物墨水。

本技术方案与背景技术相比，具有如下优点：

1、本发明材料为糊状，可通过注射方式注入骨组织缺损部位，因此同现有的固体支架相比，能够适用于面积以及复杂程度远远超出临界性骨缺损纤维性愈合的修复。

2、通过控制骨修复支架的降解时间，来精准调控细胞因子的缓释和控释。

3、复合支架通过双期释放的方式调节生物活性因子的释放时长；通过双期释放，使得生物活性因子的释放开始于第1天，并持续2-3周。生物活性因子的一期释放将来自支架基质部分。释放开始于第1天，可维持大约1周。一期的生物活性因子刺激能够控制炎症并早期募集周围组织的相关细胞和细胞因子；二期的生物活性因子释放来自微纤维aMF，可以在支架基质内部发生降解，提供第二阶段的生物活性因子释放，进一步达到刺激种子细胞释放内源性活性因子，并抑制炎症和促进神经血管化骨再生的作用。

4、藻酸盐是最常见的用于封装和输送干细胞的天然聚合物之一，因为它成本低且在生理条件下具备良好的胶凝能力、生物相容性、低免疫原性。人体内缺乏藻酸盐降解酶，限制了海藻酸盐的降解性，但人体内含有纤溶酶能够降解纤维蛋白，因此添加了纤维蛋白的aMF表现出更快的降解率。

5、本发明采用藻酸盐可以用氧化剂如高碘酸钠进行化学改性，产生可降解的氧化藻酸盐，将生物活性因子封装在7.5％氧化度的藻酸盐中，可以使得aMF从注射入体内3-4天降解，持续2-3周。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明复合支架系统制作方法示意图。

图2为复合支架包裹的生物活性因子双期释放情况。

图3为实施例2的结果。在复合支架系统表面的hPDLSCs活死细胞荧光染色结果。hPDLSCs均呈现良好的增殖状态。(A)1天；(B)4天；(C)7天；(D)14天；

图4为实施例3的结果，在第21天时aMF+Osteo组和aMF+Nell-1+Osteo组中hPDLSCs的成骨分化较对照组明显增加。

具体实施方式

实施例1材料制备

步骤一：I期材料：

磷酸四钙(tetracaicium phosphate,TTCP)和无水磷酸氢钙(dicalciumphosphate-anhydrous,DCPA)组成CPC粉末，两者的质量比为3:1。

用蒸馏水和不同剂量的Nell-1配置双重/多重给药系统。生物活性因子Nell-1在蒸馏水中的浓度为100ng/ml。

根据粉液质量比为2：1的比例，将Nell-1溶液和CPC粉末混合形成糊状物。

步骤二：II期材料：

在37℃下将藻酸盐溶解在155mM的氯化钠溶液中来制备2％(w/w)的藻酸盐溶液。所述藻酸盐用氧化剂高碘酸钠进行化学改性，产生可降解的氧化度为7.5％的氧化藻酸盐，该改性方法可参见本申请人已发表文章：

1.doi:10.1016/j.jdent.2019.103220.

2.doi:10.3390/ijms222212363.

3.doi:10.3390/ijms232415905.

4.doi:10.1016/j.msec.2017.02.158。

hPDLSCs和Nell-1加入氧化度为7.5％的氧化藻酸盐溶液中，形成1x 10

步骤三：将步骤一I期含有Nell-1的磷酸钙糊状物与步骤二II期aMF复合支架系统以100mg磷酸钙糊状物混合100ul水凝胶微纤维的比例均匀混合。

将生物墨水和磷酸钙糊状物的混合物添加到配有27G针头的5mL注射器中。然后一次性全部从注射器注射出来，在含有0.1％高浓度CaCl

将制备好的复合支架系统平铺于24孔板的孔洞底部：1个复合支架系统/每孔，并压平其表面。在37℃培养箱培养条件下，将孔板放置4小时。然后，向孔洞中分别加入500μl磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在相同37℃培养箱培养条件下放置0天、1天、2天、3天、5天、7天、10天、14天、17天和21天，重复上述操作，即收集析出的PBS溶液并加入新的PBS溶液，收集所有不同培养阶段的PBS溶液。将收集的PBS溶液离心后，用紫外分光光度计测试，确定不同时间点收集的PBS样本中Nell-1的浓度。最终计算并确定不同时间点Nell-1累积释放量，绘制药物释放曲线。进行对比，观察不同时期Nell-1释放量的关系。

图2是nell-1测试释放实验，其中，

CPC(+)/aMF(+)：双期释放组

CPC(-)/aMF(+)：是单独测试II期材料组。

CPC(+)/aMF(-)：是单独测试1期材料组。

CPC(-)/aMF(-)：是测试空白对照组，不含Nell-1生长因子。

从图2可以看出：

I期给药途径为：将一部分生物活性因子负载在骨修复支架上。支架降解实现一期给药，将生物活性因子快速释放到周围组织中，达到抑制炎症以及募集周围组织相关成骨成血管细胞的目的，一期释放约从1天开始，持续约1周。

II期给药途径为：将另一部分生物活性因子包裹在支架内部微纤维(aMF)中。aMF降解实现二期给药，达到持续抑炎和促进共同包裹于aMF中的种子细胞增殖及成骨分化，同时促进种子细胞分泌血管前体细胞募集因子和神经轴突诱导因子，实现新生骨的神经血管化的目的。通过调整藻酸盐水凝胶的氧化度，控制aMF在注射入体内后降解的时间(约开始于3-4天，持续2-3周)。由于人体内本身含有纤维蛋白相关纤溶酶，纤溶酶使得aMF快速降解，促进复合支架系统对细胞和细胞因子的释放。

由于成骨基因表达升高和成骨相关蛋白合成需要1-2周，而大量矿物质沉积需要2-3周完成，双期给药能够在此阶段提供稳定的细胞因子，支持骨组织的再生和矿化。双期释放给药可以使体内从注射第一天起开始释放生物活性因子，并维持生物活性因子释放长达2-3周，对于骨的修复和再生起到长期的促进作用。

生物安全性检测

(1)细胞毒性检测

细胞流式检测

CCK-8检测：将含有Nell-1的hPDLSCs的复合支架系统培养24,48,72h。采用CCK-8试剂盒评估各时间点细胞活性。用酶标仪在450nm处检测反应液吸光度。阴性对照为不加细胞组，阳性对照为未加材料组。并计算细胞活性。

坏死凋亡MTT染色：将含有Nell-1的hPDLSCs的复合支架系统培养24,48,72h。随后根据坏死凋亡染色试剂盒进行染色，使用流式细胞分析仪进行分选，并计算正常细胞，早期凋亡细胞，晚期凋亡细胞和坏死细胞各所占的百分比，以分析材料的细胞毒性。

(2)生物安全性检测

按照ISO10993.1.3.4.5.10.11国际标准对复合支架系统进行溶血实验、皮肤刺激实验、肌肉埋植实验、和急性全身毒性实验以检测材料的生物安全性。

结果如下：具有双期释放能力的支架具有较好的生物安全性。其上负载的种子细胞增殖能力可。

其结果见图3。

成骨分化能力评估

1)采用MTT、Brud及TUNEL染色、流式细胞技术等方法检测hPDLSCs细胞黏附、增殖及凋亡情况。

(2)于第7天采用ALP染色法；第21天采用茜素红、Von Kossa染色、扫描电镜结合能谱分析等检测各组细胞成骨分化、矿化结节形成情况。

(3)采用PCR、Westernblot以及免疫荧光染色等检测成骨相关基因及蛋白表达情况结果见图4：支架中释放的生物活性因子Nell-1可以有效促进矿化结节的形成。

实施例4大鼠牙槽骨骨开窗缺损模型的建立和复合支架系统的植入

遵照动物实验伦理及福利原则，选取8周龄、雄性、体重200-250g的无特定病原体specific-pathogen-free(SPF)的Sprague Dawley(SD)大鼠。进行随机分组，构建4组3D打印-双重给药系统可注射复合支架，分别为阴性对照组(仅CPC-aMF支架，未搭载hPDLSCS及Nell-1)，阳性对照组(CPC-aMF支架搭载最适浓度Nell-1，未搭载hPDLSCs)细胞对照组(CPC-aMF支架搭载hPDLSCs，未搭载Nell-1)、实验组(CPC-aMF支架搭载hPDLSCS及最适浓度Nell-1)每组36只，共计144只。

建立大鼠牙槽骨骨开窗缺损模型，麻醉下沿大鼠磨牙牙槽嵴顶切开粘膜至骨面，翻瓣，使用骨凿沿牙长轴去除牙槽骨表面骨骼，使之为V字型缺损。注意在实验操作过程中勿伤及牙根。双侧下颌骨对照测相同操作，建立牙槽骨骨开窗模型。三周后将各组支架注射至大鼠的骨组织缺损处，分别在此后4、8和12周后处死。

实验结果表明：双期释放的支架对于大鼠颅骨缺损的修复效果更好。

实施例2

材料制备

步骤一：I期材料：

磷酸四钙(tetracaicium phosphate,TTCP)和无水磷酸氢钙(dicalciumphosphate-anhydrous,DCPA)组成CPC粉末，两者的质量比为3:1。

用蒸馏水和不同剂量的Nell-1配置双重/多重给药系统。生物活性因子Nell-1在蒸馏水中的浓度为100ng/ml、500ng/ml和1000ng/ml。

根据粉液质量比为2：1的比例，将Nell-1溶液和CPC粉末混合形成糊状物。

步骤二：II期材料：

在37℃下将藻酸盐溶解在155mM的氯化钠溶液中来制备2％(w/w)的藻酸盐溶液。然后加入纤维蛋白原，终浓度为0.4％(w/w)。所述藻酸盐用氧化剂高碘酸钠进行化学改性，产生可降解的氧化度为7.5％的氧化藻酸盐，该改性方法见本申请人已发表文章。

hPDLSCs和Nell-1加入藻酸盐溶液中，形成1x 10

步骤三：将步骤一I期含有Nell-1的磷酸钙糊状物与步骤二II期aMF复合支架系统以100mg磷酸钙糊状物混合100ul水凝胶微纤维的比例均匀混合。

将生物墨水和磷酸钙糊状物的混合物添加到配有27G针头的5mL注射器中。然后一次性全部从注射器注射出来，在含有0.1％高浓度CaCl

结果：在本实施例中，由于加了终浓度为0.4％(w/w)的纤维蛋白原，相对于实施例1，aMF降解更快。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。