环状RNA hsa_circ_0067842作为乳腺癌预后标志物及在治疗靶点的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种乳腺癌预后标志物和治疗靶点及其应用。

背景技术

乳腺癌是全球女性最高发的恶性肿瘤之一，也是导致女性癌症死亡的主要原因，其发病率和死亡率均位居前列，且呈现逐年上升的趋势。2020年最新统计数据表明，乳腺癌已成为第一大癌症，全球新发病例数约230万人，死亡病例数约69万人，其发病率(11.7％)和死亡率(6.9％)均居女性恶性肿瘤的第一位，严重威胁女性生命健康。在我国，乳腺癌的现状同样严峻，在女性恶性肿瘤中乳腺癌发病率居首位且年龄标化率呈现上升的趋势，以30-59岁女性为高发，发病呈现年轻化趋势，对家庭和社会造成巨大的负担。乳腺癌是一种多因素共同作用的高度异质性疾病，引起乳腺癌的主要高危因素有遗传因素、生殖因素、高脂饮食等，此外转移的发生与乳腺癌患者的不良预后密切相关，90％以上的死亡病例都是由转移造成的。因此，乳腺癌及时精准的治疗，直接影响乳腺癌患者的预后。探究一种新型高灵敏性和高特异性的乳腺癌治疗靶点，改善乳腺癌患者的预后、提升远期生活质量，是近年来临床关注的焦点和难点。

环状RNA是一类呈现共价闭合环状结构的特殊非编码RNA分子，不具有5’帽结构和3’多聚腺苷酸尾，可以抵抗核酸外切酶的消化，较线性RNA更稳定存在于多种体液中，并且具有组织特异性或发育阶段特异性的表达方式，是一类较理想的分子标志物。近年来，研究表明环状RNA可以通过多种方式参与不同疾病的进展。环状RNA主要通过以下4种方式发挥生物学功能：(1)作为微小RNA的分子海绵，即竞争性内源RNA机制；(2)结合、锚定或隔离蛋白质的作用；(3)调控亲本基因的转录；(4)编码具有功能的肽段或蛋白质。

近年来，环状RNA与癌症的关系已经成为癌症研究领域的一个研究热点，越来越多的环状RNA被证明在包括乳腺癌在内的各种人类癌症中异常表达。已发现环状RNA与肿瘤细胞增殖、凋亡、上皮间质转化(EMT)、迁移、侵袭和血管生成等有关，即环状RNA在肿瘤生物学进程中发挥着重要作用，并逐渐成为肿瘤诊断、治疗及预后的分子标志物。因此，基于环状RNA在乳腺癌中的异常表达及生物学功能，探究发现新型环状RNA作为乳腺癌的分子治疗靶点和预后标志物，对提升乳腺癌患者五年生存率及改善乳腺癌的预后具有深远的临床意义。

发明内容

本发明针对传统乳腺癌治疗和预后中存在的问题提出一种新型的环状RNA hsa_circ_0067842作为乳腺癌预后标志物及在治疗靶点的应用。

为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：

本发明从组织标本库中选取6例乳腺癌及配对癌旁组织，质检合格后进行高通量芯片分析，利用生物信息学的方法进行差异表达的环状RNA分析，选择显著高表达的hsa_circ_0067842作为研究目标。另外，利用组织芯片技术于126例乳腺癌组织和59例正常组织样本中验证hsa_circ_0067842的表达量，发现hsa_circ_0067842在乳腺癌组织中表达显著上调，生存分析结果显示hsa_circ_0067842与较短的总生存期和无病生存期相关；体外功能实验表明，hsa_circ_0067842可以促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。

第一方面，本发明提供了一种环状RNA hsa_circ_0067842，其来源于人类的第3号染色体，由SMC4基因的第12-17号外显子环化而成，hsa_circ_0067842的脱氧核糖核苷酸序列SEQ ID NO.1为

>hsa_circ_0067842|NM_005496|SMC4

GGGGACTTAGGAGCCATTGATGAAAAATACGACGTGGCTATATCATCCTGTTGTCATGCACTGGACTACATTGTTGTTGATTCTATTGATATAGCCCAAGAATGTGTAAACTTCCTTAAAAGACAAAATATTGGAGTTGCAACCTTTATAGGTTTAGATAAGATGGCTGTATGGGCGAAAAAGATGACCGAAATTCAAACTCCTGAAAATACTCCTCGTTTATTTGATTTAGTAAAAGTAAAAGATGAGAAAATTCGCCAAGCTTTTTATTTTGCTTTACGAGATACCTTAGTAGCTGACAACTTGGATCAAGCCACAAGAGTAGCATATCAAAAAGATAGAAGATGGAGAGTGGTAACTTTACAGGGACAAATCATAGAACAGTCAGGTACAATGACTGGTGGTGGAAGCAAAGTAATGAAAGGAAGAATGGGTTCCTCACTTGTTATTGAAATCTCTGAAGAAGAGGTAAACAAAATGGAATCACAGTTGCAAAACGACTCTAAAAAAGCAATGCAAATCCAAGAACAGAAAGTACAACTTGAAGAAAGAGTAGTTAAGTTACGGCATAGTGAACGAGAAATGAGGAACACACTAGAAAAATTTACTGCAAGCATCCAGCGTTTAATAGAGCAAGAAGAATATTTGAATGTCCAAGTTAAGGAACTTGAAGCTAATGTACTTGCTACAGCCCCTGACAAAAAAAAGCAGAAATTGCTAGAAGAAAACGTTAGTGCTTTCAAAACAGAATATGATGCTGTGGCTGAGAAAGCTGGTAAAGTAGAAGCTGAGGTTAAACGCTTACACAATACCATCGTAGAAATCAATAATCATAAACTCAAGGCCCAACAAGACAAACTTGATAAAATAAATAAGCAATTAGATGAATGTGCTTCTGCTATTACTAAAGCCCAAGTAGCAATCAAGACTGCTGACAG该环状RNA hsa_circ_0067842在染色体中的位置如图2所示。

第二方面，本发明提出上述环状RNA hsa_circ_0067842作为乳腺癌分子生物学标志物的应用。检测来自可能患有乳腺癌对象的样品中hsa_circ_0067842的表达量，其中hsa_circ_0067842的较高表达量与所述对象患有乳腺癌的可能性增加以及预后不佳相关。

第三方面，本发明公开了特异性识别hsa_circ_0067842的引物对，引物序列为：前向CAAGGCCCAACAAGACAAACTTGA和反向ATGGCTCCTAAGTCCCCCTG。

第四方面，本发明提出上述环状RNA hsa_circ_0067842在制备乳腺癌预后试剂或试剂盒中的应用。hsa_circ_0067842分子标志物的检测方法，包括样品总RNA提取、RNA反转录、实时荧光定量PCR扩增。具体步骤包括，第一步：使用飞捷fast 2000试剂盒提取总RNA，第二步：使用Evo M-MLV RT Premix将RNA逆转录成cDNA，β-actin作为内源性参照，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS进行所有RT-qPCR反应。

第五方面，本发明提出了能够下调环状RNA hsa_circ_0067842表达水平的特异性小干扰RNA，并且提出了其在制备治疗乳腺癌药物中的应用，所述特异性小干扰RNA的序列为

si-hsa_circ_0067842#1：

正向UGCUGACAGGGGGACUUAGTT

反向CUAAGUCCCCCUGUCAGCATT；

si-hsa_circ_0067842#2：

正向GACUGCUGACAGGGGGACUTT

反向AGUCCCCCUGUCAGCAGUCTT。

下调环状RNA hsa_circ_0067842表达水平的特异性小干扰RNA在制备治疗乳腺癌药物中的应用，作用对象为MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株。

第六方面，本发明公开hsa_circ_0067842在乳腺癌细胞中的定位及发挥的生物学功能，探针序列为：

5’Cy3-CCTAAGTCCCCCTGTCAGCAGTCTT-3’Cy3。

本发明提供了环状RNA hsa_circ_0067842作为一种新型潜在的乳腺癌分子预后标志物和治疗靶点的应用，涉及hsa_circ_0067842的筛选、检测、功能分析及应用，设计并合成出用于实时荧光定量PCR的特异性引物及体外干扰hsa_circ_0067842的小干扰RNA(siRNA)。通过对6例乳腺癌及癌旁组织进行高通量芯片分析，筛选出在乳腺癌中显著高表达的环状RNA分子hsa_circ_0067842。通过组织标本检测验证，结果显示与正常组织相比，hsa_circ_0067842在乳腺癌患者组织样本中高表达，且与乳腺癌患者的预后相关。功能实验结果显示hsa_circ_0067842可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

1.本发明首次发现hsa_circ_0067842可作为乳腺癌的预后标志物和治疗靶点，为改善乳腺癌的预后和治疗提供新思路。

2.研究显示与正常组织相比，hsa_circ_0067842在乳腺癌患者肿瘤组织中显著上调，使用其作为分子标志物具有较好的临床意义。

3.本发明的结果表明hsa_circ_0067842在乳腺癌细胞的细胞核和细胞质中均存在。干扰hsa_circ_0067842可以抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，表明hsa_circ_0067842在乳腺癌的发生发展中发挥促进癌基因的作用，为临床治疗乳腺癌提供了新的思路，有望成为乳腺癌新的治疗靶点。

附图说明

图1为circRNA芯片数据挖掘分析的火山图，显示乳腺癌及癌旁组织中差异表达的circRNA的分布(fold change>4或<0.25，p<0.001)。

图2为hsa_circ_0067842在染色体上的位置示意图。

图3为乳腺癌组织中hsa_circ_0067842表达量检测的结果图。

图4为Kaplan-Meier分析hsa_circ_0067842与乳腺癌患者预后关系图。

图5为乳腺癌细胞系及正常乳腺上皮细胞中hsa_circ_0067842的表达量检测的结果图。

图6为RNA荧光原位杂交的结果图，鉴定出hsa_circ_0067842的亚细胞定位(原图中的，蓝色为细胞核DAPI，红色为环状RNA hsa_circ_0067842标记，调整成黑白图片后，颜色不显示)。

图7为hsa_circ_0067842小干扰RNA(siRNA)在MDA-MB-468细胞系中转染敲减效率的RT-qPCR验证图。si-NC代表阴性对照组；si-hsa_circ_0067842#1、si-hsa_circ_0067842#2分别代表转染两种靶向hsa_circ_0067842反向剪接位点的siRNA组。

图8为hsa_circ_0067842小干扰RNA(siRNA)在MDA-MB-231细胞系中转染敲减效率的RT-qPCR验证图。si-NC代表阴性对照组；si-hsa_circ_0067842#1、si-hsa_circ_0067842#2分别代表转染两种靶向hsa_circ_0067842反向剪接位点的siRNA组。

图9为敲减环状RNA hsa_circ_0067842后乳腺癌细胞MDA-MB-468迁移与侵袭能力变化的统计结果图。

图10为敲减环状RNA hsa_circ_0067842后乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移与侵袭能力变化的统计结果图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

实施例1

本实施例提供hsa_circ_0067842在乳腺癌组织中的表达及其与预后的关系。

1.实验材料与方法

1.1临床样本收集：收集乳腺癌及对应的癌旁正常新鲜组织，样本收集标准为：(1)病理学检查确诊为乳腺癌；(2)未合并其他恶性肿瘤或疾病；(3)术前未接受任何药物或放化疗等治疗。将术后组织用预冷的PBS清洗组织表面残余血液，在冰上分装，迅速置于液氮速冻30min，转存于-80℃超低温冰箱。

1.2差异circRNA表达谱：基于6例乳腺癌及癌旁正常组织进行高通量circRNA芯片分析，设置差异显著基因的默认阈值为：p≤0.001且Fold change≤0.25或≥4.0，得到差异circRNA表达谱，见图1。

1.3RNA提取及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)：采用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA.USA)提取组织的总RNA；采用RNA提取试剂盒fast2000提取细胞的总RNA(飞捷，上海)。逆转录试剂盒采用Evo M-MLV RT Premix Kit(AG，湖南)；实时荧光定量PCR试剂盒采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG，湖南)；采用β-actin作为内参；采用2

表1RT-qPCR使用的引物序列

1.4统计分析：使用SPSS 23.0软件对结果进行统计分析，使用GraphPad Prism9.0软件作图。根据需要采用t检验或者Wilcoxon符号秩和检验进行统计学分析。实验数据均来自三次独立实验，数据以均数±标准差的形式表示，所有p值均为双侧，p<0.05被认为具有统计学意义。

2.实验结果：

2.1在实施例1中，本发明通过对高通量circRNA芯片数据就行分析筛选，得到显著差异表达的circRNAs，见图1。

2.2在实施例1中，hsa_circ_0067842来源于3号染色体，见图2。

2.3在实施例1中，差异表达的环状RNA hsa_circ_0067842在乳腺癌组织中表达显著上调，见图3。并且其高表达与乳腺癌患者的不良预后相关，见图4。

实施例2

本实施例提供hsa_circ_0067842在乳腺癌细胞中的亚细胞定位及探讨干扰hsa_circ_0067842的表达对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。

1.实验材料与方法

1.1细胞系及细胞培养：人乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231，人正常乳腺上皮细胞MCF-10A，均购自中国科学院上海生命科学研究院。乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-231培养在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，MCF-10A培养在含有10％胎牛血清、胰岛素、氢化可的松的DMEM-F12K培养基中，添加100U/ml青霉素链霉素混合液，在37℃含有5％CO

1.2RNA荧光原位杂交：采用吉玛基因(上海)设计合成的荧光原位杂交探针及试剂盒，经过细胞固定-预杂交-杂交-封片完成，通过共聚焦显微镜观察荧光位置，进行拍照分析，原位杂交探针序列为5’Cy3-CCTAAGTCCCCCTGT CAGCAGTCTT-3’Cy3。

1.3转染：靶向hsa_circ_0067842反向剪接位点的特异性小干扰RNA(siRNA)及阴性对照(si-NC)由吉玛基因(上海)合成；利用Lipofectamine2000将siRNA转入结直肠癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231中；siRNA序列见表2,干扰效率见图7和图8。

表2siRNA序列

1.4Transwell迁移实验：用镊子将24孔细胞池放入24孔板中，使用200μl纯培养基重悬4×10

1.5Transwell侵袭实验：用镊子将24孔细胞池放入24孔板中。上室加入60μl稀释的基质胶，置于37℃，5％ CO

1.6RNA提取及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)：同实施例1。

1.7统计分析：同实施例1。

2.实验结果：

2.1在实施例2中，本发明通过RT-qPCR检测人乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中hsa_circ_0067842的表达，结果显示与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，hsa_circ_0067842在乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231中显著高表达，见图5。

2.2在实施例2中，本发明通过RNA荧光原位杂交实验探究hsa_circ_0067842在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的亚细胞定位，结果显示hsa_circ_0067842在细胞核和细胞质中均表达，见图6。

2.3在实施例2中，本发明在乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231中转染小干扰RNA si-hsa_circ_0067842#1和si-hsa_circ_0067842#2后，能显著沉默乳腺癌细胞中hsa_circ_0067842的表达水平，见图7和图8。

2.4在实施例2中，本发明使用转染hsa_circ_0067842小干扰RNA后的乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231进行功能实验，结果显示敲减hsa_circ_0067842显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力，见图9和图10。

上述结果表明hsa_circ_0067842在乳腺癌组织和细胞中高表达，并且与乳腺癌患者的不良预后相关；细胞定位显示hsa_circ_0067842同时表达于细胞核和细胞质中，体外实验显示下调hsa_circ_0067842的表达可以抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力，表明hsa_circ_0067842在乳腺癌中发挥促癌基因的作用。为乳腺癌的治疗和预后提供新的潜在分子靶点。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。