生物素化适配体、荧光生物探针、应用及解淀粉芽胞杆菌的检测方法

技术领域

本申请涉及解淀粉芽孢杆菌检测技术领域，特别是涉及一种生物素化适配体、广谱荧光探针、应用及解淀粉芽孢杆菌定量检测方法。

背景技术

芽胞杆菌是一类能产生内生孢子的革兰氏阳性细菌，在自然环境中广泛分布，如在土壤、污水、尘埃、食品原料等环境中。在白酒发酵过程中，芽孢杆菌可以产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等促进原料的降解，并参与吡嗪类风味物质的形成，对白酒酿造过程中起到关键作用，如解淀粉芽孢杆菌对后期发酵过程中的产品质量具有重要意义。因此，迫切需要一种快速、可靠的方法来鉴别检测发酵前期投入的原料中的解淀粉芽孢杆菌的数量。

传统解淀粉芽孢杆菌的检测方法主要包括平板培养、基因检测等，然而，这些技术的应用范围受到诸如耗时长、操作难度大和成本高等固有问题的限制。

因此，亟需一种对解淀粉芽孢杆菌快速准确的检测方法。

发明内容

本申请第一方面提供了一种生物素化适配体，生物素化适配体的序列如SEQ IDNO：1。

本申请第一方面提供的生物素化适配体中的生物素分子(biotin-5′)中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位，每个亲和素能结合4个生物素分子。链霉亲和素修饰的磁珠表面上的链霉亲和素与生物素化适配体间的作用是已知强度最高的非共价作用，亲和常数(K)为10

本申请第二方面提供一种适配体修饰磁珠，所述适配体修饰磁珠采用如权利要求1所述的生物素化适配体与链霉亲和素修饰的磁珠孵育而成。

本申请第二方面提供的适配体修饰磁珠可以特异性结合解淀粉芽孢杆菌，选择性好，受其他物质干扰小，适配体修饰磁珠可以在捕获解淀粉芽孢杆菌后通过磁性分离方式将解淀粉芽孢杆菌从待测样品中分离出来，有助于实现对解淀粉芽孢杆菌的特异性检测。

本申请第三方面为一种本申请第二方面提供的适配体修饰磁珠的应用，适配体修饰磁珠可用于捕获解淀粉芽孢杆菌。

本申请第四方面提供一种荧光探针NM5AN，荧光探针NM5AN为纳米级金属有机框架MIL-53(Al)-NH

将NH

将第二混合液转移至高压釜中，在150℃，反应12小时，得到乳黄色沉淀；

洗涤乳黄色沉淀，并在60℃真空下干燥6h，得到NM5AN。

本申请第五方面提供荧光生物探针FcMBL@NM5AN，荧光生物探针FcMBL@NM5AN采用以下方法制备得到，方法包括：

将荧光探针NM5AN和戊二醛加入缓冲液中，37℃下孵育3h，得到第一中间产物，洗涤第一中间产物，将洗涤后的第一中间产物与FcMBL溶液混合，37℃下孵育3h，得到粗产物，洗涤粗产物得到FcMBL@NM5AN。

本申请第六方面提供荧光生物探针FcMBL@NM5AN的应用，荧光生物探针FcMBL@NM5AN用于与待测细菌结合，并通过对结合后体系的荧光强度的检测得到待测细菌的浓度。

本申请第七方面提供一种解淀粉芽孢杆菌的检测方法，包括：

捕获解淀粉芽孢杆菌，在待测样液中加入本申请第二方面的适配体修饰磁珠，混合均匀后在第一温度下孵育第一预设时间，通过磁性分离去除上清，得到第一沉淀物，第一沉淀物包括与适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌；

洗涤第一沉淀物；

在洗涤后的第一沉淀物中加入包含荧光生物探针FcMBL@NM5AN的溶液，在第二温度下孵育第二预设时间，得到包含三明治型复合物的混液体系，三明治型复合物经由荧光生物探针FcMBL@NM5AN及与适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌结合得到；

混液体系经磁性分离后，去除上清，以将富余的荧光生物探针FcMBL@NM5AN去除，得到第二沉淀物；

用碱性溶液对第二沉淀物洗涤，以使三明治型复合物在适配体修饰磁珠与解淀粉芽孢杆菌表面结合处裂解，通过磁性分离方式去除裂解后脱出的适配体修饰磁珠，得到荧光待测液；

在423nm的发射波长处检测荧光待测液的荧光强度，根据已建立的解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度关联的预设定量模型，获得待测样液也中解淀粉芽孢杆菌浓度。

本申请第七方面提供一种解淀粉芽孢杆菌的检测方法，通过采用包括自主设计合成的适配体修饰磁珠以及FcMBL@NM5AN两种生物传感器实现对待测样品中解淀粉芽孢杆菌的定量检测，在提高检测效率以及检测准确性的同时，降低降低成本，提高检测便利性，促进解淀粉芽孢杆菌检测朝高灵敏度、易于读出、操作简单、非接触检测方向发展。

附图说明

图1为本申请实施例采用包括自主设计合成的适配体修饰磁珠以及FcMBL@NM5AN两种生物传感器实现对待测样品中解淀粉芽孢杆菌的定量检测的流程图；

图2为本申请实施例中荧光探针NM5AN的SEM扫描图；

图3为本申请实施例中荧光探针NM5AN的TEM扫描图；

图4为本申请实施例中荧光探针NM5AN的EDX元素映射图；

图5为本申请实施例中荧光探针NM5AN的XPS表征图；

图6为本申请实施例中荧光探针NM5AN、荧光探针UM5A以及荧光探针BM6A、软件模拟的MIL-53(AL)-NH

图7为本申请实施例中荧光探针NM5AN、荧光探针UM5A、荧光探针BM6A以及NH

图8为本申请实施例中生物荧光探针FcMBL@NM5AN放置不同时间后的稳定性探究实验的荧光谱图；

图9为本申请实施例中生物荧光探针FcMBL@NM5AN在不同PH值溶液中放置24h的峰值荧光强度对比图；

图10为本申请实施例生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的最佳浓度探究实验结果图；

图11为本申请实施例制备生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的最佳孵育时间探究实验结果图；

图12是本申请实施例中八组荧光待测液经检测后的荧光谱图；

图13是本申请实施例经回归分析后得出的解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度关联的预设定量模型图；

图14示出了a组实验、b组实验、c组实验及d组实验中四组荧光待测液经荧光检测后峰值荧光强度示意图；

图15示出了生物传感器通过平板菌落计数法对不同细菌选择性探究实验中b’组实验、c’组实验以及d’组实验平板菌落培养结果图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请第一方面提供了一种生物素化适配体，生物素化适配体的序列如SEQ IDNO：1。SEQ ID NO：1为

biotin-5′-agcactgtttctttatggcacagaggtcagatgggcgggtttggatctttggttggcgcacctatgcgtgctaccgtgaa-3′，是人工序列。

本申请第一方面提供的生物素化适配体中的生物素分子(biotin-5′)中咪唑酮环是与亲和素结合的主要部位，每个亲和素能结合4个生物素分子。链霉亲和素修饰的磁珠表面上的链霉亲和素与生物素化适配体间的作用是已知强度最高的非共价作用，亲和常数(K)为10

本申请第二方面提供一种适配体修饰磁珠，所述适配体修饰磁珠采用如权利要求1所述的生物素化适配体与链霉亲和素修饰的磁珠孵育而成。

本申请第二方面提供的适配体修饰磁珠可以特异性结合解淀粉芽孢杆菌，选择性好，受其他物质干扰小，适配体修饰磁珠可以在捕获解淀粉芽孢杆菌后通过磁性分离方式将解淀粉芽孢杆菌从待测样品中分离出来，有助于实现对解淀粉芽孢杆菌的特异性检测。

在本申请第二方面一些可选的实施例中，适配体修饰磁珠采用以下步骤孵育而成：

将链霉亲和素修饰的磁珠与本申请第一方面的生物素化适配体在37℃下孵育1h，得到孵育粗产物体系；

对粗产物体系进行磁分离，去上清，以去除孵育粗产物体系中冗余的生物素化适配体，取沉淀；

洗涤沉淀得到适配体修饰磁珠。

本申请第三方面为一种本申请第二方面提供的适配体修饰磁珠的应用，适配体修饰磁珠可用于捕获解淀粉芽孢杆菌。

本申请第四方面提供荧光探针NM5AN，荧光探针NM5AN为纳米级金属有机框架MIL-53(Al)-NH

将NH2-BDC溶液和AlCl

将第二混合液转移至高压釜中，在150℃，反应12小时，得到乳黄色沉淀；

洗涤乳黄色沉淀，并在60℃真空下干燥6h，得到NM5AN。

在本申请第四方面一些可选的实施例中，表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵。

在本申请第四方面一些可选的实施例中，荧光探针NM5AN的颗粒尺寸主要分布在70nm～100nm。

在本申请第四方面一些可选的实施例中，荧光探针NM5AN的颗粒尺寸主要为80nm±2nm。

本申请第五方面提供荧光生物探针FcMBL@NM5AN，荧光生物探针FcMBL@NM5AN采用以下方法制备得到，方法包括：

将本申请第四方面提供的荧光探针NM5AN和戊二醛加入缓冲液中，37℃下孵育3h，得到第一中间产物，洗涤第一中间产物，将洗涤后的第一中间产物与FcMBL溶液混合，37℃下孵育3h，得到粗产物，洗涤粗产物得到FcMBL@NM5AN。

FcMBL(碎片结晶甘露糖偶联凝集素)是一种工程蛋白，能够识别广谱的病原体，包括大多数的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。FcMBL与细菌细胞壁上分支低聚糖残基的末端甘露糖和岩藻糖结合。戊二醛可以共价结合FcMBL与NM5AN荧光探针表面的氨基，形成具有荧光特性的生物探针。

本申请第六方面提供荧光生物探针FcMBL@NM5AN的应用，荧光生物探针FcMBL@NM5AN用于与待测细菌结合，并通过对结合后体系的荧光强度的检测得到待测细菌的浓度。

在本申请第六方面一些可选的实施例中，待测细菌为解淀粉芽孢杆菌。

本申请第七方面提供一种解淀粉芽孢杆菌的检测方法，包括：

捕获解淀粉芽孢杆菌，在待测样液中加入本申请第二方面的适配体修饰磁珠，混合均匀后在第一温度下孵育第一预设时间，通过磁性分离去除上清，得到第一沉淀物，第一沉淀物包括与适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌；

洗涤第一沉淀物；

在洗涤后的第一沉淀物中加入包含荧光生物探针FcMBL@NM5AN的溶液，在第二温度下孵育第二预设时间，得到包含三明治型复合物的混液体系，三明治型复合物经由荧光生物探针FcMBL@NM5AN及与适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌结合得到；

混液体系经磁性分离后，去除上清，以将富余的荧光生物探针FcMBL@NM5AN去除，得到第二沉淀物；

用碱性溶液对第二沉淀物洗涤，以使三明治型复合物在适配体修饰磁珠与解淀粉芽孢杆菌表面结合处裂解，通过磁性分离方式去除裂解后脱出的适配体修饰磁珠，得到荧光待测液；

在423nm的发射波长处检测荧光待测液的荧光强度，根据已建立的解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度关联的预设定量模型，获得待测样液也中解淀粉芽孢杆菌浓度。

本申请第七方面提供一种解淀粉芽孢杆菌的检测方法，通过采用包括自主设计合成的适配体修饰磁珠以及FcMBL@NM5AN两种生物传感器实现对待测样品中解淀粉芽孢杆菌的定量检测，在提高检测效率以及检测准确性的同时，降低降低成本，提高检测便利性，促进解淀粉芽孢杆菌检测朝高灵敏度、易于读出、操作简单、非接触检测方向发展。

在本申请第七方面一些可选的实施例中，第一温度和第二温度为37℃，第一预设时间和第二预设时间分别为30min～60min。

在本申请第七方面一些可选的实施例中，第一预设时间和第二预设时间分别为30min。

FcMBL(碎片结晶甘露糖偶联凝集素)是一种工程蛋白，能够识别广谱的病原体，包括大多数的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。FcMBL与细菌细胞壁上分支低聚糖残基的末端甘露糖和岩藻糖结合。戊二醛可以共价结合FcMBL与NM5AN荧光探针表面的氨基，形成具有荧光特性的生物探针。

图1为本申请实施例采用包括自主设计合成的适配体修饰磁珠以及FcMBL@NM5AN两种生物传感器实现对待测样品中解淀粉芽孢杆菌的定量检测的流程图。如图1所示，先合成荧光探针NM5AN，再利用荧光探针NM5AN、戊二醛以及FcMBL合成生物FcMBL@NM5AN荧光探针。将合成的适配体修饰磁珠(图1中的Apt-MBs)加入到待测样液中，捕获解淀粉芽孢杆菌(图1中的)，待测样液中包含有解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)以及其他干扰细菌(Interfering bacteria)，磁性分离得到第一沉淀物，第一沉淀物包含与适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌。洗涤第一沉淀物；在洗涤后的第一沉淀物中加入包含荧光生物探针FcMBL@NM5AN的溶液，在第二温度下孵育第二预设时间，得到包含三明治型复合物的混液体系，三明治型复合物经由荧光生物探针FcMBL@NM5AN及与适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌结合得到。混液体系经磁性分离后，去除上清，以将富余的荧光生物探针FcMBL@NM5AN去除，得到第二沉淀物；用碱性溶液对第二沉淀物洗涤，以使三明治型复合物在适配体修饰磁珠与解淀粉芽孢杆菌表面结合处裂解，通过磁性分离方式去除裂解后脱出的适配体修饰磁珠，得到荧光待测液。如图1流程图中最后的小瓶内所示，荧光待测液中包含了解淀粉芽孢杆菌与荧光生物探针FcMBL@NM5AN的结合物。在423nm的发射波长处检测荧光待测液的荧光强度，根据已建立的解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度关联的预设定量模型，获得待测样液也中解淀粉芽孢杆菌浓度。

【具体实施例】

一、生物传感器的合成

1.1.1荧光探针NM5AN的合成

将NH

1.1.2其余荧光探针材料的合成

1.1.2.1荧光探针材料UM5A的合成

与荧光探针NM5AN的合成方法区别在于用尿素替代表面活性剂CTAB，其余的制备步骤相同。

1.1.2.2荧光探针材料BM5A的合成

与荧光探针NM5AN的合成方法区别不加入表面活性剂CTAB，其余的制备步骤相同，即采用普通水热法合成的荧光探针。

1.2生物荧光探针FcMBL@NM5AN的合成

将上述合成的荧光探针NM5AN(5mg)和戊二醛溶液(0.5mL，

50％wt)加入Tris-HCl缓冲液(4.5mL，pH＝7.4)中，在37℃的摇床上孵育3h。孵育结束后用Tris-HCl缓冲液冲洗5次后，将产物与FcMBL(10mg，分散在5mL Tris-HCl缓冲液中)混合，37℃孵育3h。

获得的生物荧光探针FcMBL@NM5AN用Tris-HCl缓冲液洗涤3次，在37℃下在冰箱中保存待用。

1.3适配体修饰磁珠的制备

将链霉亲和素修饰的磁珠(SA-MBs，10mg/mL，100μL)与本申请第一方面提供的生物素化适配体(100μM，13μL)在37℃下孵育1h。通过磁分离将上清液中多余的生物素适配体去除，取沉淀，用Tris-HCl缓冲液洗涤沉淀3次，用Tris洗涤3次后，将得到的Apt-MBs(适配体修饰磁珠)再次分散在100μL磷酸盐缓冲盐水(PBS，50mM，pH＝7.4)缓冲液中。

二、合成材料的表征

2.1对荧光探针NM5AN扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)表征-形貌表征

2.1.1 SEM表征方法

利用扫描电子显微镜(SEM)(Sigma 300,Zeiss,Germany)对荧光探针NM5AN的形态学特征进行了成像分析。

2.1.2 SEM表征结果

图2示出了荧光探针NM5AN的SEM扫描图。从图2可以看出荧光探针NM5AN成在纳米尺度上呈颗粒状，荧光探针NM5AN的颗粒尺寸主要为80nm±2nm。在一些例子中，荧光探针NM5AN的颗粒尺寸主要分布在70nm～100nm.相较于普通水热法合成的BM5A荧光探针材料颗粒尺寸要小，普通水热法合成的BM5A荧光探针材料颗粒尺寸约为1.8μm，因此荧光探针NM5AN与普通水热法合成的BM5A荧光探针材料在相同浓度下进行荧光强度对比时，荧光探针NM5AN的荧光强度是BM5A荧光探针材料的荧光强度的5.4倍，荧光强度的提高极大提高了解淀粉芽孢杆菌检测的灵敏度，降低了解淀粉芽孢杆菌的检测限。

2.2对荧光探针NM5AN透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)表征

2.2.1 TEM表征方法

利用透射电子显微镜(G2 F20,FEI Talos,USA)对荧光探针NM5AN的形态学特征进行了成像分析。

2.2.2 TEM表征结果

如图3所示，在TEM表征图像中，也可以清楚地观察到荧光探针NM5AN的颗粒状晶体形貌特征，能观察到荧光探针NM5AN的颗粒尺寸分布规律，NM5AN的颗粒尺寸分布规律为：NM5AN的颗粒尺寸主要在主要集中70nm～100nm范围内，荧光探针NM5AN的颗粒尺寸主要为80nm±2nm。

2.3对荧光探针NM5AN能量色散X射线光谱仪(Energy Dispersive X-RaySpectroscopy)表征

2.3.1 EDX表征方法

EDX表征通过在x射线光电子能谱仪(K-Alpha,Thermo Scientific,USA)上获得。

2.3.2 EDX表征结果

如图4所示，荧光探针NM5AN含有AL、C、O、N元素。

2.4 XPS(X射线光电子能谱技术)表征结果

2.4.1 XPS表征方法

XPS(X-ray Photoelectron Spectroscopy)光谱是在x射线光电子能谱仪(K-Alpha,Thermo Scientific,USA)上获得的。

2.4.2 XPS表征结果

如图5所示，XPS和EDX均显示荧光探针NM5AN含有AL、C、O、N元素，不含其他杂质。

2.5 X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)表征

2.5.1 XRD表征方法

x射线衍射(XRD)光谱是在x射线衍射仪((D2 Phaser,Bruker,Germany)上获得的。

2.5.2 XRD表征结果

图6为本申请实施例中荧光探针NM5AN、荧光探针UM5A以及荧光探针BM6A、软件模拟的MIL-53(AL)-NH

根据XRD的结果，NM5AN与使用传统普通水热合成方法制备得到的荧光探针材料BM5A(属于MIL-53(Al)-NH

2.6 FT-IR(Fourier Transform Infrared Spectoscopy，傅里叶变换红外)表征

2.6.1 FT-IR表征方法

FT-IR光谱使用(Nicolet iN 10,Thermo Fisher Scientific,USA)采集得到，溴化钾压片制样。

2.6.2 FT-IR表征结果

通过FT-IR分析进一步证实了NM5AN的合成。如图7所示，纯NH

三、生物传感器的性质探究

3.1生物荧光探针FcMBL@NM5AN放置不同时间后的稳定性探究

如图8所示，将制备的生物荧光探针FcMBL@NM5AN泡在水中检测其0-6天中每一天的荧光变化。将的FcMBL@NM5AN配置成相同浓度的溶液，且FcMBL@NM5AN溶液的PH均相同。图8中示出在第0天至第6天中FcMBL@NM5AN溶液在375nm～575nm波长范围内发出荧光，且在423nm附近，荧光强度达到峰值。在第0天至第6天中每一天的FcMBL@NM5AN溶液的荧光光谱峰位、峰数、峰形状基本保持不变，峰强度的变化较小，说明生物荧光探针FcMBL@NM5AN的荧光稳定性较好。

3.2生物荧光探针FcMBL@NM5AN在不同PH溶液中24小时的荧光稳定性探究

如图9所示，设置11组PH值各不相同的FcMBL@NM5AN溶液放置24h后检测各组FcMBL@NM5AN溶液的峰值荧光强度，各组FcMBL@NM5AN溶液除PH不同外其余均相同(例如FcMBL@NM5AN的浓度)，并将各组FcMBL@NM5AN溶液的峰值荧光强度做对比。发现当PH值为12时，FcMBL@NM5AN溶液的荧光强度最高。

3.3生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的最佳浓度探究

图10为本申请实施例生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的最佳浓度探究实验结果图。

如图10所示，设置五组不同浓度的生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液(浓度分别为0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml以及1.4mg/ml)，并分别检测上述五组不同浓度的生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的峰值荧光强度，做图比较得出生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的浓度为1.0mg/ml时具有最高的峰值荧光强度。因此，可以选定生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液最佳浓度为1.0mg/ml。

3.4制备生物荧光探针FcMBL@NM5AN时最佳孵育时间探究

图11为本申请实施例制备生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的最佳孵育时间探究实验结果图。

如图11所示，设置五组FcMBL与NM5AN孵育时间不同制备得到生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液(孵育时间分别为10min、20min、30min、40min、50min)，并检测该五组生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液的峰值荧光强度，做图比较得出FcMBL与NM5AN孵育时间为30min时制备得到生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液具有最高的峰值荧光强度，因此会优选FcMBL与NM5AN孵育时间为30min孵育时间制备生物荧光探针FcMBL@NM5AN，同时也使得生物荧光探针FcMBL@NM5AN溶液具有最高的峰值荧光强度。

四、解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度关联的预设定量模型的构建

将不同浓度的解淀粉芽孢杆菌液(10、1×10

与Tris-HCl缓冲液和适配体修饰磁珠Apt-MBs(10mg/mL，10μL)混合，37℃孵育30min。通过磁性分离去除上清，得到第一沉淀物，第一沉淀物为与所述适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌。

将第一沉淀物用PBS洗涤三次，以去除多余的细菌。然后将FcMBL@NM5AN溶液加入到第一沉淀物中，在37℃下孵育30min，得到包含三明治型复合物的混液体系，三明治型复合物经由所述荧光生物探针FcMBL@NM5AN及与所述适配体修饰磁珠结合的解淀粉芽孢杆菌结合得到。

对混液体系进行磁性分离以去除上清(以去除多余的FcMBL@NM5AN)，得到第二沉淀物。用氢氧化钠(0.025M，10μL)对第二沉淀物进行洗涤，以使所述三明治型复合物在所述适配体修饰磁珠与所述解淀粉芽孢杆菌表面结合处裂解，通过磁性分离方式去除裂解后脱出的所述适配体修饰磁珠，得到五组荧光待测液，五组荧光待测液与上述五组不同浓度的解淀粉芽孢杆菌液一一对应。最后，在423nm的发射波长处分别检测五组荧光待测液的荧光信号。图12是本申请实施例中五组荧光待测液经检测后的荧光谱图。从图12可知，本申请实施例中五组荧光待测液随着对应的解淀粉芽孢杆菌液浓度越高，在423nm的发射波长处的峰值荧光强度越大。

将本申请实施例中五组荧光待测液检测到的峰值荧光强度与对应的五组解淀粉芽孢杆菌液的蜡样芽孢杆浓度的进行回归分析，获得解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度关联的预设定量模型。

图13是本申请实施例经回归分析后得出的解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度关联的预设定量模型图。

从图13可以看出，解淀粉芽孢杆菌浓度与423nm的发射波长处荧光强度呈良好的线性相关，检出限为4CFU/mL。

生物荧光探针FcMBL@NM5AN合成简单。通过一锅溶剂热-简单交联法可获得凝集素功能化的高灵敏荧光生物传感器，不仅对解淀粉芽孢杆菌具有很强的亲和力，也大大降低了检测限。

五、生物传感器对于解淀粉芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的选择性探究

5.1生物传感器通过荧光检测对不同细菌选择性探究

5.1.1

a组实验：

S1a：将不同浓度的解淀粉芽孢杆菌(10、1×10

5.1.2

b组实验：

S1b：将不同浓度的解淀粉芽孢杆菌(10、1×10

5.1.3

c组实验：

S1c：将不同浓度的大肠杆菌(10、1×10

5.1.4

d组实验：

S1d：将不同浓度的金黄色葡萄球菌(10、1×10

a组实验中的S1a步骤之后、b组实验中的S1b步骤之后、c组实验中的S1c步骤之后以及d组实验中的S1d步骤之后均执行以下步骤：

将混合物孵育在37℃孵育30min，通过磁性分离去除上清，取沉淀物A。

将沉淀物A用PBS洗涤三次，以去除多余的细菌。然后将FcMBL@NM5AN溶液加入到沉淀物A中，在37℃下孵育30min，通过磁性分离得到沉淀物B，并去除上清(以去除多余的FcMBL@NM5AN)。

用氢氧化钠(0.025M，10μL)对沉淀物B进行洗涤，以对菌体表面结合的生物素化适配体修饰磁珠进行洗涤去除，通过磁性分离方式去除裂解后脱出的所述适配体修饰磁珠，得到四组荧光待测液(每组荧光待测液中包含有多种含有菌浓度不同的荧光待测液)。在423nm的发射波长处检测四组荧光待测液荧光信号。

图14示出了a组实验、b组实验、c组实验及d组实验中四组荧光待测液经荧光检测后峰值荧光强度示意图。

图14中B.amyloliquefaciens为解淀粉芽孢杆菌，E.coli为大肠杆菌，S.aureus为金黄色葡萄球菌。如图14所示，c组实验和d组实验中各种荧光待测液荧光检测后的基本未检出荧光信号，峰值荧光强度趋于零，说明E.coli大肠杆菌和S.aureus金黄色葡萄球菌未被生物素化适配体修饰磁珠Apt-MBs所捕获，因此未有E.coli大肠杆菌或S.aureus金黄色葡萄球菌在后续与FcMBL@NM5AN孵育步骤中与生物荧光探针FcMBL@NM5AN结合。

a组实验和b组实验中各种荧光待测液荧光检测出均检出荧光信号，且a组实验中各荧光待测液的峰值荧光强度与b组实验中对应的各荧光待测液的峰值荧光强度基本一致(指在解淀粉芽孢杆菌添加浓度上对应一致的荧光待测液)。由此说明，生物素化适配体修饰磁珠Apt-MBs对解淀粉芽孢杆菌具有优异地捕获选择性，可以在多菌环境中特异性捕获解淀粉芽孢杆菌，受其他杂菌干扰小，有助于实现对解淀粉芽孢杆菌的特异性检测。

5.2生物传感器通过平板菌落计数法对不同细菌选择性探究

5.2.1

a’组实验：

S1a’：将解淀粉芽孢杆菌(浓度为X CFU/mL，10μL)与Tris-HCl缓冲液和生物素化适配体修饰磁珠Apt-MBs(10mg/mL，10μL)混合得混合原始菌液。

5.2.2

b’组实验：

S1b’：将解淀粉芽孢杆菌(浓度为X CFU/mL与a’组实验中的相同，10μL)加入大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(浓度统一分别为2×10

5.2.3

c’组实验：

S1c’：将大肠杆菌(1×10

5.2.4

d’组实验：

S1d’：将金黄色葡萄球菌(1×10

a’组实验中的S1a’步骤之后、b’组实验中的S1b’步骤之后、c’组实验中的S1c’步骤之后以及d’组实验中的S1d’步骤之后均执行以下步骤：

将混合原始菌液在37℃孵育30min，通过磁性分离得上清液和沉淀物A’。

在a’组实验中的S1a’步骤之后、b’组实验中的S1b’步骤之后、c’组实验中的S1c’步骤之后以及d’组实验中的S1d’步骤取各组的混合原始菌液进行平板菌落培养，以采用平板菌落计数法计算各组的混合原始菌液中各菌种对应的菌数。

分别取a’组实验、b’组实验、c’组实验以及d’组实验中磁性分离得上清液进行平板菌落培养，以采用平板菌落计数法计算各组的分离得的上清液中各菌种对应的菌数。

分别取a’组实验、b’组实验、c’组实验以及d’组实验中磁性分离得的沉淀物A’进行平板菌落培养，以采用平板菌落计数法计算各组的分离得的沉淀物A’各菌种对应的菌数。

图15示出了生物传感器通过平板菌落计数法对不同细菌选择性探究实验中b’组实验、c’组实验以及d’组实验平板菌落培养结果图。

图15中，Bacteria@Apt-MBs为被生物素化修饰磁珠Apt-MBs捕获的细菌，Supernatant为上清液，Original-solution为混合原始菌液。如图15所示，生物素化修饰磁珠Apt-MBs对解淀粉芽孢杆菌具有特异性捕获作用，可以在混菌溶液中特异性捕获解淀粉芽孢杆菌，而使得b’组实验中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在磁性分离后留于上清液中，生物素化修饰磁珠Apt-MBs不能捕获大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌。该5.2部分的实验与上述5.1部分的实验结论相同，均证明生物素化修饰磁珠Apt-MBs对解淀粉芽孢杆菌具有优良的选择性，生物素化修饰磁珠Apt-MBs能特异性捕获解淀粉芽孢杆菌。

对a’组实验中磁性分离得到的沉淀物A’进行平板菌落培养，以采用平板菌落计数法计算a’组实验中的分离得的沉淀物A’中解淀粉芽孢杆菌对应的菌数，并将用平板菌落计数法计算得到的解淀粉芽孢杆菌菌数与a’组实验中加入的解淀粉芽孢杆菌菌数进行比较，计算得出生物素化修饰磁珠Apt-MBs在缓冲溶液中对解淀粉芽孢杆菌的捕获效率约为85％。

六、生物素化修饰磁珠Apt-MBs和生物荧光探针FcMBL@NM5AN双重生物传感器检测实际样品中的解淀粉芽孢杆菌

为进一步验证生物素化修饰磁珠Apt-MBs和生物荧光探针FcMBL@NM5AN在实际样本中的定量检测解淀粉芽孢杆菌的能力，挑选了容易滋生解淀粉芽孢杆菌的食品样本作为检测基质。食品样本包括牛奶、米饭、鸡肉、鸡蛋和大曲。

6.1样品前处理。

在实验前，将牛奶、米饭、鸡肉、鸡蛋和大曲在高压釜中加热到121℃，并保存10min，以对食品样本进行灭菌处理。

对经上述灭菌处理的牛奶、米饭、鸡肉、鸡蛋和大曲分别执行一下步骤：

称取50g样品放入无菌搅拌罐中。

在无菌搅拌罐中添加磷酸盐缓冲盐水450mL(PBS，50mM，pH＝7.4)，缓冲液(1:10稀释)，并高速混合2min(10,000-12,000rpm)，得到均质样品。通过将10mL均质样品转移到90mL缓冲液中进行1:10稀释，充分混合得到实际样品待接菌液。

6.2.检测实际样品中的解淀粉芽孢杆菌。

a组：将不同浓度的解淀粉芽孢杆菌(10、1×10

b组：将不同浓度的解淀粉芽孢杆菌(10、1×10

分别将上述a组中得到的多个第一菌混合液和b组中得到的多个第二菌混合液执行以下步骤：

在37℃孵育30min，通过磁性分离去除上清，取沉淀物A。

将沉淀物A用PBS洗涤三次，以去除多余的细菌。然后将FcMBL@NM5AN溶液加入到沉淀物A中，在37℃下孵育30min，通过磁性分离得到沉淀物B，并去除上清(以去除多余的FcMBL@NM5AN)。

用氢氧化钠(0.025M，10μL)对沉淀物B进行洗涤，以对菌体表面结合的生物素化适配体修饰磁珠进行洗涤去除，通过磁性分离方式去除裂解后脱出的所述适配体修饰磁珠，得到a大组荧光待测液和b大组荧光待测液。a大组荧光待测液中包含有五小组(分别对应牛奶、米饭、鸡肉、鸡蛋和大曲五种实际样品的)荧光待测液，各小组荧光待测液中包含有8种含有解淀粉芽孢杆菌浓度不同的荧光待测液。b大组荧光待测液中包含有五小组(分别对应牛奶、米饭、鸡肉、鸡蛋和大曲五种实际样品的)荧光待测液，各小组荧光待测液中包含有8种含有解淀粉芽孢杆菌浓度不同而大肠杆菌和金黄色葡萄糖菌浓度相同的荧光待测液。在423nm的发射波长处检测a大组荧光待测液和b大组荧光待测液荧光信号。

第六部分的实验探究中荧光检测后的结果如表1所示。表1中Spiked一列表示实际放入的菌浓度，Detected一列表示通过荧光检测得到的放入的菌浓度，Recovery一列表示解淀粉芽孢杆菌捕获回收率，RSD一列表示相对标准偏差。

表1

从表1可以看出，本申请实施例提供的解淀粉芽孢杆菌的检测方法可以在不同的食品样品中准确、高效快速地对解淀粉芽孢杆菌进行特异性定量检测，定量检测过程中受到的其他杂菌干扰较小。本申请实施例提供的双重生物传感器中生物素化修饰磁珠Apt-MBs可以实现对解淀粉芽孢杆菌特异性捕获。生物荧光探针FcMBL@NM5AN的尺寸达到纳米级，相较于其他大尺寸的MOFs材料(例如是微米级的)具有超高的荧光亮度，比传统有机荧光分子高3个数量级，是商用无机量子点的15倍左右，提高检测的灵敏性，对解淀粉芽孢杆菌具有极佳的亲和力，减低检测限。生物荧光探针FcMBL@NM5AN的光稳定性好，生物相容性良好等优点，在生物传感检测方面展现出巨大的优势。整体而言，本申请实施例提供的解淀粉芽孢杆菌的检测方法操作简单，耗时短，成本低廉，结果可靠。

上述具体实施方式，并不构成对本申请保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，根据设计要求和其他因素，可以进行各种修改、组合、子组合和替代。任何在本申请的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请保护范围之内。