人工标志物等位基因

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种制备用于鉴定生物体中感兴趣的核酸的人工标志物等位基因的方法。本发明还涉及确定混合群体中感兴趣的核酸的存在，以及将感兴趣的核酸渗入群体中的方法。本发明还涉及包含人工标志物等位基因的生物体，特别是植物和种子，并且涉及人工标志物等位基因的多种用途。

背景技术

一个多世纪以来，植物育种在增加作物产量方面取得了显著进展。但植物育种者不断面临新的挑战。农业方式的变化导致需要开发具有新农艺性状的基因型。新的真菌和害虫不断进化，并克服现有的寄主植物抗性。新的土地区域经常被用于耕种，使植物暴露于变化的生长条件下。最后，全球人口的增加将需要增加粮食作物。因此，增加作物产量的任务对植物育种者和农业科学家提出了前所未有的挑战。

植物育种将在协调解决上述问题的努力中发挥关键作用。考虑到当前的产量趋势、预计人口增长和对环境的压力，与产量稳定性和可持续性有关的性状是植物育种工作的主要重点。这些性状包括持久抗病性、非生物胁迫耐受性，以及养分利用效率和水分利用效率。

尽管对常规育种来持续提高产量感到乐观，将需要新的生物技术解决方案来最大化成功的机率。生物技术的一个领域，即DNA标志物技术，源于分子遗传学和基因组学的研究，为植物育种提供了广阔的前景。由于遗传连锁，DNA标志物可用于检测潜在于期望性状的基因中等位基因变异的存在。通过使用DNA标志物辅助植物育种，效率和精度可以大大提高。DNA标志物在植物育种中的使用称为标志物辅助选择(MAS)，并且是‘分子育种’新学科的组成部分。

在过去的二十年中，DNA标志物技术在植物育种中的使用显著增加。但是，使用标志物辅助育种和鉴定合适的标志物是一个费力且费时的过程。此外，标志物辅助育种是有限的，因为植物基因组广泛分布着重复序列，其严重阻碍了诊断标志物的开发和使用的可能性。特别是对于基因组大小较大的农作物而言，低拷贝数DNA片段的鉴定可能具有高挑战性。此外，在许多情况下，只有与性状基因具有极其紧密连锁的DNA多态性或甚至是因果多态性本身，才能被开发用于转化为有用的DNA标志物。

EP 2 342 337 B1描述了一种在靶区域引入唯一的、人造的和选择性的标志物，而不是鉴别和开发自然存在的多态性的方法。所述策略基于鉴别和选择与感兴趣的性状紧密连锁的DNA片段，并通过将单核苷酸多态性(SNP)插入该DNA片段的基本保守核苷酸组成中而将该片段转化为选择性标志物。然而，EP 2 342 337 B1中描述的方法例如具有耗时且费力并且产生灵敏度和可靠性低的标志物的缺点，使得所得的标志物不适用于质量控制的目的。

因此，提供克服上述问题的人工标志物等位基因及其制备方法是有利的。

发明内容

本发明通过提供尤其可以用于质量控制应用的具有升高的灵敏度和可靠性的人工InDel标志物等位基因，而克服了这些问题。

根据本发明的第一方面，提供了一种制备用于鉴定生物体中感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的人工标志物等位基因的方法，所述方法包括：

(a)鉴定生物体的基因组中与感兴趣的核酸遗传上连锁的至少一个基因组基因座，以及

(b)将至少一个InDel引入所述至少一个基因组基因座中，

从而制备可随感兴趣的核酸一起遗传给所述生物体后代的标志物等位基因。

根据本发明的第二方面，提供了一种用于在含感兴趣的核酸的个体和不含感兴趣的核酸的个体的混合群体中确定感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的存在的方法，所述方法包括使用对人工标志物等位基因具有特异性的至少一个分子标志物和/或对野生型基因组基因座具有特异性的至少一个分子标志物来检测本发明的第一方面所述的人工标志物等位基因。

根据本发明的第三方面，提供了一种用于评估包含感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的个体的群体的同质性的方法，所述方法包括使用对人工标志物等位基因具有特异性的至少一个分子标志物和/或对野生型基因组基因座具有特异性的至少一个分子标志物来检测本发明的第一方面所述的人工标志物等位基因并确定群体中的同质性，其中检测出野生型基因组基因座指示群体中包含感兴趣的核酸的个体的异质性分布。

根据本发明的第四方面，提供了一种用于将感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)渗入个体的群体中的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在包含感兴趣的核酸的供体生物体中制备根据本发明的第一方面的人工标志物等位基因；

(ii)将所述供体生物体与不含感兴趣的核酸的同一物种的受体生物体杂交，以产生异质遗传组成的后代；

(iii)回交/自交和选择人工标志物等位基因的存在以得到纯合遗传组成的后代，其包含受体生物体背景中的感兴趣的核酸，

(iv)任选地，重复步骤(iii)至少一次，优选重复多次。

所述方法的步骤(iii)基于使用专门用于检测子代中存在人工标志物等位基因的至少一个分子标志物和/或专门用于检测后代中不存在人工标志物等位基因的至少一个分子标志物进行的检测。

受体生物体可以是植物、动物、微生物或真菌，优选为植物，更优选为优良品系植物、野生型植物、突变植物、基因编辑的或碱基编辑的植物，或转基因植物。

根据本发明的第五方面，提供了一种制备人工标志物等位基因的方法，所述方法包括设计一个或多个基因型特异性InDel，并将所述InDel引入生物体基因组中的基因组基因座中，其中所述基因组基因座与感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)遗传上连锁。还提供了一种可通过此方法得到的包含至少一个基因型特异性InDel的人工标志物等位基因。

根据本发明的第六方面，提供了根据第五方面所述的人工标志物等位基因或可通过根据本发明的第一方面所述的方法得到的人工标志物等位基因在标志物辅助育种中的用途。

还提供了可编程核酸酶用于产生用于鉴定生物体基因组中感兴趣的核酸的根据本发明的第一方面所述的人工标志物等位基因的用途。所述可编程核酸酶可以选自CRISPR核酸酶系统、锌指核酸酶、TALEN、大范围核酸酶或碱基编辑器。

根据本发明的第七方面，提供了一种包含可通过根据第一方面所述的方法得到的人工标志物等位基因的生物体，优选为植物或其种子或包含根据第五方面所述的人工标志物等位基因的生物体，优选为植物或其种子。

发明详述

本发明的第一方面提供了一种制备用于鉴定生物体中感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的人工标志物等位基因的方法，所述方法包括：

(a)鉴定生物体基因组中与感兴趣的核酸遗传上连锁的至少一个基因组基因座，以及

(b)将至少一个InDel引入所述至少一个基因组基因座中，

从而制备可随感兴趣的核酸一起遗传给所述生物体后代的标志物等位基因。

感兴趣的核酸优选地编码编码感兴趣的性状的多肽。所述性状可以是表型性状，并且可以例如通过肉眼或通过其它方式(例如，显微镜、通过生物化学分析、基因组分析、转录图谱等)在表型上观察到。所述表型可归因于单个基因或遗传基因座，或可归因于多个基因的作用。具有经济重要性的植物的基因组中的典型性状包括产量相关性状，包括抗倒伏性、花期、抗裂荚性、粒色、胚乳组成、营养含量、除草剂抗性(包括草甘膦抗性、草铵膦/草丁膦抗性、潮霉素(hyg)抗性、原卟啉原氧化酶(PPO)抑制剂抗性、ALS抑制剂抗性和麦草畏抗性)、抗病性(包括抗病毒性、抗真菌性、抗细菌性、抗虫性)、非生物胁迫(包括干旱胁迫、渗透胁迫、热胁迫、冷胁迫、氧化胁迫、重金属胁迫、氮缺乏、磷缺乏、盐胁迫或渍水、和营养利用效率及水分利用效率、雄性不育)抗性或耐受性。在本发明的优选实施方案中，可以基于通过可编程核酸酶或切口酶进行的基因编辑(GE)、基于通过基因编辑器进行的碱基编辑，或基于其组合，通过基于基因编辑(GE)的基因修饰或基于碱基编辑器的基因修饰，将感兴趣的性状人工引入感兴趣的核酸中。

本文所使用的“等位基因”是指特定基因组基因座上的核酸序列或基因的变体形式，且本文所使用的术语“人工标志物等位基因”是指通常在自然界中相关生物体中找不到的人工创造的唯一等位基因。在本发明的上下文中，“人工标志物等位基因”与期望的性状相关的感兴趣的核酸遗传上连锁。因此，本文所使用的“人工标志物等位基因”是指可用于鉴定生物体基因组中与感兴趣的性状相关的感兴趣的核酸的核苷酸多态性。

用于制备人工标志物等位基因的方法的第一步骤包括鉴定生物体基因组中与感兴趣的核酸遗传上连锁的至少一个基因组基因座。这样的基因组基因座是在生物体基因组内唯一，且在生物体的不同基因型之间高度保守的基因组基因座。动物或植物育种领域的技术人员将理解在本发明的上下文中术语“高度保守的”的含义。特别地，本文所使用的术语“高度保守的”是指这样的基因组序列(优选地长度在100bp至200bp之间)，其在生物体不同基因型之间共有至少90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％序列相同性。如本文所使用的，“基因型”是指个体或个体群组在一个或多个遗传基因座上的基因组成。个体或个体群组的基因型是全部基因的总和，并决定其表型。当提到生物体不同基因型之间的保守性时，这可能是生物体特定物种、栽培种或种族群体中不同个体之间的保守性。“栽培种”和“品种”在本文中可互换使用，用于指一个物种(例如，甜菜(B.vulgaris))中的一组植物，其共有某些遗传性状使得产生将其与所述物种内的其它可能的品种区分开的相同表型。栽培种可以是自交系或杂交体，这适用于相关农作物。

为了鉴定在不同基因型之间高度保守的基因组基因座，在一组个体中进行详细的序列分析以鉴定约100-200个碱基对(bp)的区域。所鉴定的区域在靶基因组中必须是唯一的，以允许通过基因组编辑或碱基编辑来特异性插入InDel。然后，高度保守的基因组基因座允许在基因型和遗传背景的最宽可能范围内普遍使用所述标志物。

所述基因组基因座理想地位于感兴趣的核酸的任何编码区域(例外情况下，可能有理由选择编码区域)、剪接信号或调控元件，3’UTR，5’UTR，内含子，miRNA，非编码RNA和任何其它可能特征之外。采取这些预防措施是因为不能排除基因组相互作用。基因的启动子区域通常不能很好地表征，因此靶基因3’方向的位置是优选的。但是，如果基因5’区域的位置是有利的，则假定启动子长度为1000bp，并且将不会选择所述启动子用于引入所述至少一个InDel。

此外，基因组基因座应优选与感兴趣的核酸物理邻近，并且与感兴趣的核酸完全连锁不平衡(LD)，以避免在重组过程中人工标志物等位基因与感兴趣的核酸分离。术语“连锁不平衡”(LD)是指遗传基因座或性状(或二者)的非随机分隔，并且表示，相关基因座沿染色体的长度在足够的物理和/或遗传接近内，使得它们以大于随机频率(即，非随机频率)分隔在一起。

基因组基因座与感兴趣的核酸紧密连锁，因此，当将InDel引入基因组基因座中以创建人工标志物等位基因时，所述标志物等位基因可与感兴趣的核酸一起遗传给所述生物体的后代。基因组基因座理想地位于感兴趣的核酸侧翼的区域中，并且优选位于感兴趣的核酸的3’端处。感兴趣的核酸侧翼的区域优选与所述感兴趣的核酸相距至少2cM、至少1cM、至少0.5cM、至少0.1cM、至少0.09cM、至少0.08cM、至少0.07cM、至少0.06cM、至少0.05cM、至少0.04cM、至少0.03cM、至少0.02cM、至少0.01cM、至少0.009cM、至少0.008cM、至少0.007cM、至少0.006cM、至少0.005cM、至少0.004cM、至少0.003cM、至少0.002cM、至少0.001cM、至少0.0009cM、至少0.0008cM、至少0.0007cM、至少0.0006cM、至少0.0005cM、至少0.0004cM、至少0.0003cM、至少0.0002cM或至少0.0001cM，或相距上述值之间的任意处。本文所使用的“cM”定义了染色体上两个基因座之间的距离，并且是本领域众所周知的重组频率的量度。

术语“侧翼区域……”或“位于……侧翼的区域”在本文中可互换使用，并且是指与其中插入至少一个InDel以产生人工InDel标志物等位基因的感兴趣的核酸遗传上连锁的预定基因组基因座的核酸序列。

可选地，基因组基因座可以在感兴趣的核酸本身内。当基因组基因座位于感兴趣的核酸内时，所述基因组基因座应优选位于感兴趣的核酸的任何编码区域、剪接信号或调控元件，3’UTR，5’UTR，内含子，miRNA，非编码RNA等之外，因此，在将所述至少一个InDel引入基因组基因座时，不会导致功能丧失。

就可以确定的而言，插入所述至少一个InDel之后得到的基因组基因座的核苷酸序列，即所得的人工标志物等位基因，在所述生物体的基因组中是唯一的，这意味着它不会发生或极少发生在有关生物体的种质(germplasm)中。因此，所得的生物体在其与感兴趣的核酸紧密连锁的基因序列中包含特定引入的改变，所述感兴趣的核酸优选编码赋予感兴趣的性状的多肽。现在可以在标志物辅助育种中以任何常规方式使用和分析这种特定引入的InDel(其产生人工标志物等位基因)，并如在本文中进一步描述的。

如本文所使用的，术语“种质”是指具有特定分子组成的遗传物质，其提供了生物体或细胞培养物和所述物质集合的某些或全部遗传品质。育种者使用术语“种质”来表示来自例如野生型物种、优良或家养育种系的遗传物质的集合，从中可以提取它们以创建品种或种族。如本文所使用的，“种质”可以是任何有生命的遗传资源，包括但不限于从其可以生长新植物的细胞、种子或组织，或植物部分(例如可培育为整株植物的叶、茎、花粉、胚珠、或细胞)。

“生物体”优选地为植物，但也可以是动物、真菌或微生物。本文所使用的术语“植物”是指整株植物、其祖先及其后代，以及指植物部分。植物部分可包括种子、组织、细胞、器官、叶、茎、根、新生胚根、花、花器部分、花瓣、果实、花粉、花粉管、花药丝、胚珠、胚囊、卵细胞、子房、接合子、胚胎、合子胚、体细胞胚、顶端分生组织、维管束、中柱鞘、配子体、孢子和插枝。本文所使用的术语“植物”还包括可以培育为整株植物或植物部分的植物种质。后代和祖先植物可以来自任何后代(filial generation)(例如，P、F1、F2、F3等)以及因其回交而产生的任何植物。

所述植物可以是任何植物，并且可以例如选自大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉米(Zea mays)、谷子(Setaria italica)、小粒野生稻(Oryza minuta)、水稻(Oriza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、小麦(Triticumaestivum)、黑麦(Secale cereale)、苹果(Malus domestica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucusglochidiatus、甜菜(Beta vulgaris)、Daucus pusillus、Daucus muricatus、野胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitisvinifera)、Erythrante guttata、黄花螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumissativus)、川桑(Morus notabilis)、Arabidopsis arenosa、琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、须弥芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、硬毛南芥(Arabis hirsute)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、Brassica oeleracia、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassicanigra)、芝麻菜(Eruca vesicaria subsp.sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、麻疯树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Cicer yamashitae、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、Cicer reticulatum、Cicer judaicum、木豆(Cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、夏堇(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、大葱(Alliumfistulosum)、大蒜(Allium sativum)和韭菜(Allium tuberosum)。

用于制备人工标志物等位基因的方法中的第二步骤包括将至少一个InDel引入至少一个基因组基因座中。

本文所定义的“InDel”或“InDel标志物”是指生物体基因组内基因组基因座中的至少一个核苷酸插入和/或至少一个核苷酸缺失。所述至少一个核苷酸插入在本文中也称为“插入标志物”，且所述至少一个核苷酸缺失在本文中也称为“缺失标志物”。

在本发明的上下文中，“InDel”是指在预定基因组基因座的核苷酸序列中插入和/或缺失至少一个核苷酸，从而通过至少一个核苷酸改变基因组基因座的核苷酸序列的长度。因此，在本发明的上下文中，“InDel”是指向内源性核苷酸序列中并入至少一个额外的核苷酸，或从内源性核苷酸序列中去除至少一个核苷酸。与InDel相反，“单核苷酸多态性”(SNP)表示在基因组序列中的单核苷酸(A、C、T或G)发生改变时发生的序列变异。SNP是取代或替换给定核苷酸序列内的单核苷酸，从而使核苷酸序列的长度保持不变。

在本发明的优选实施方案中，所述至少一个InDel包含一个以上核苷酸插入和/或一个以上核苷酸缺失。所述至少一个InDel可包含插入1-60个碱基对的序列，所述序列与其中待引入所述至少一个InDel的生物体基因组非同源。任选地，InDel可包含插入超过60个碱基对的序列，所述序列与其中待引入所述至少一个InDel的生物体基因组非同源的。所述插入可以任选地包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碱基对的序列或由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碱基对的序列组成，所述序列与其中引入所述至少一个InDel的生物体基因组非同源。优选地，所述插入包含至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对的序列的核苷酸序列或由至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对的序列的核苷酸序列组成，所述序列与其中引入所述至少一个InDel的生物体基因组非同源。在本文中，术语“非同源”是指，所述插入物在生物体基因组中是唯一的，并且与生物体基因组中的核酸序列不具有同源性，所述同源性可能导致由于同源性定向修复而将所述插入物并入不期望的基因组位置中。在本文中，术语“非同源”还指，插入物在引入基因组基因座中时，会产生人工标志物等位基因，其在相关生物体的基因组内是唯一的。

在制备人工标志物等位基因的方法中，需要评估和选择预定基因组基因座中的插入物及其侧翼区域，以进行最佳测定设计，这意味着它们在给定生物体的基因组中必须是单一且不重复的。此外，所述插入物及其侧翼区域应显示出以下特征中的一项或多项：GC含量为约50％、G/C和A/T碱基之间分布平衡、二级结构(secondary structure)的机率降低。在预定基因组基因座的侧翼区域中插入至少一个核苷酸应产生在生物体不同基因型之间呈单态(即，唯一)的插入标志物等位基因。利用标准生物信息学工具和测序方法，通过对短序列进行迭代和重复分析来进行此项分析。

此外，侧翼区域在生物体的基因库中应该是单态的，这意味着它在生物体的不同基因型之间是高度保守的。

在本发明的另一个实施方案中，所述至少一个InDel可以额外地或可选择地包含在生物体基因组中基因组基因座中缺失1-60个碱基对的序列或由在生物体基因组中基因组基因座中缺失1-60个碱基对的序列组成。任选地，所述缺失是生物体基因组中基因组基因座中超过60个碱基对的序列的缺失。所述缺失可以是缺失至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碱基对。优选地，所述缺失包含至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对的核苷酸序列或由至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对的核苷酸序列组成。

所选择的缺失是不会导致基因或基因组区域内功能丧失的缺失。例如，缺失标志物优选位于与期望的感兴趣的性状相关的基因之外和/或位于非编码区域中，以避免任何功能丧失。在设计合适的缺失标志物时，本领域技术人员将容易理解要避免哪些基因组区域。

此外，需要选择预定基因组基因座中的缺失及其侧翼区域，以进行最佳测定设计，这意味着它们在给定生物体的基因组中必须是单一且不重复的，并表现出以下特征中的一项或多项：GC含量为约50％、G/C和A/T碱基之间分布平衡、二级DNA结构的机率降低。在预定基因组基因座的侧翼区域中缺失至少一个核苷酸应产生在生物体不同基因型之间呈单态的缺失标志物等位基因。利用标准生物信息学工具，通过对短序列进行迭代和重复分析来进行此项分析。

“G/C和A/T碱基之间分布平衡”是指GC含量为40％-55％，且相应的A/T具体取决于实际的GC含量即为60％-45％。所述分布可能是40％G/C和60％A/T、41％G/C和59％A/T、42％G/C和58％A/T、43％G/C和57％A/T、44％G/C和56％A/T、45％G/C和55％A/T、46％G/C和54％A/T、47％G/C和53％A/T、48％G/C和52％A/T、49％G/C和51％A/T、50％G/C和50％A/T、51％G/C和49％A/T、52％G/C和48％A/T、53％G/C和47％A/T、54％G/C和46％A/T，和/或55％G/C和45％A/T。G/C和A/T碱基之间的平衡分布会影响预定基因座处或邻近预定基因座的DNA的二级结构的产生，由此这种二级结构会影响分子标志物的退火。本领域技术人员充分意识到这一事实，并且能够预测特定序列对于最佳测定设计的适用性的计算。

此外，侧翼区域在生物体的基因库中应该是单态的(即，高度保守的)，这意味着它在生物体的不同基因型之间是高度保守的。

插入和/或缺失的大小可以根据待开发的标志物测定法而发生变化。

在本发明的含义中，“引入”包括通过以下方式进行稳定或瞬态整合：转化(包括农杆菌介导转化)、转染、显微注射、基因枪轰击、使用如CRISPR系统(例如，CRISPR/Cas，特别是CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1、CRISPR/CasX或CRISPR/CasY)、TALEN、锌指核酸酶或大范围核酸酶的基因编辑技术进行插入、任选地通过以下提及的基因编辑技术(包括优选地修复模板)之一进行同源重组、使用随机或靶向诱变(如TILLING或所述基因编辑技术)进行基因组基因座修饰等。

优选地，可以使用用于引入核苷酸插入和/或缺失的任何已知的合适诱变方法将所述至少一种InDel引入基因组基因座中。

例如，可以使用可编程核酸酶或切口酶引入所述至少一个InDel。可编程核酸酶或切口酶可选自任何已知的基因编辑(GE)工具，例如，定点核酸酶(SDN)，包括CRISPR核酸酶系统，包括CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cfp1系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统，锌指核酸酶、TALEN、大范围核酸酶和/或其任何组合、变体或催化活性片段。

定点核酸酶(SDN)或切口酶使用DNA切割酶(核酸酶)来产生靶向(或定点)DNA断裂。SDN应用的变体通常分为SDN-1(无修复模板)、SDN-2(通过使用DNA修复模板进行基因编辑)和SDN-3(通过使用DNA修复模板引入较大的插入/缺失)，取决于DNA双链断裂修复或DNA单链断裂修复的结果。

任何可编程核酸酶或切口酶均可用于将点突变、插入或缺失引入生物体基因组中。本领域技术人员能够很容易地基于基因组序列和期望的效率来选择合适的技术。

例如，可以通过经典的SDN-1方法来产生点突变(即，非同源性末端接合(NHEJ)以随机插入/缺失一个或多个碱基，从而引起点突变)。在待产生点突变的位置(或与其紧密接近的位置)处，切割双链。然后NHEJ途径修复双链断裂，从而随机产生期望的点突变。选择一个特定的点突变是困难的，因为需要筛选大量的植物，因此，优选SDN-2方法(如下所述)将特定的点突变引入预定基因组位置处(即，使用修复模板进行同源性定向修复(HDR))。

对于SDN-2方法，在待引入点突变的预定基因组位置(或与其紧密接近的位置)处，切割DNA双链。通过在切割位点上游和下游添加具有同源侧翼区域的“修复模板”，可以通过HDR引入期望的点突变。这增加获得期望的突变的可能性。

通常而言，用于产生点突变的所述方法也可以用于产生缺失。除上述方法外，可能通过在待缺失序列的上游和下游产生两个双链断裂而缺失期望的序列。然后在选择步骤中，重要的是要确保发生精确的切割。

用于产生点突变的所述方法也可用于产生插入。优选SDN-2方法来产生插入，但在某些情况下SDN-1方法也可以是有用的。

本上下文中的CRISPR核酸酶系统描述了一种分子复合物，所述分子复合物包含至少一个小的且个体的向导RNA与Cas核酸酶或另一种CRISPR核酸酶(如Cpf1核酸酶)组合的分子复合物(Zetsche等(2015)；“Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of aclass 2CRISPR-Cas system”，Cell 163(3):759-771)，其可产生特定的DNA双链断裂。术语“CRISPR多肽”、“CRISPR核酸内切酶”、“CRISPR核酸酶”、“CRISPR蛋白”、“CRISPR效应子”或“CRISPR酶”在本文中可互换使用，并且是指作为位点特异性DNA核酸酶或切口酶的任何天然存在或人工的氨基酸序列，或编码其的核酸序列，其中“CRISPR多肽”源自任何生物体的CRISPR系统，其可以被克隆并用于靶向的基因组工程化。术语“CRISPR核酸酶”或“CRISPR多肽”还包括天然存在的CRISPR效应子序列或编码其的各个序列的突变体或催化活性片段或融合体。因此，“CRISPR核酸酶”或“CRISPR多肽”也可例如是指在其天然环境中具有内切核苷酸功能的CRISPR切口酶或甚至CRISPR多肽的核酸酶缺陷型变体。

术语“向导RNA”、“gRNA”、“单向导RNA”或“sgRNA”在本文中可互换使用，并且是指CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的合成融合体，或者所述术语是指仅由crRNA和/或tracrRNA组成的单RNA分子，或者所述术语是指单独包含crRNA或tracrRNA部分的gRNA。因此，tracr和crRNA部分(如果按照相应的CRISPR多肽的要求存在的话)不一定必须存在于一个共价连接的RNA分子上，但是它们也可以包含两个单独的RNA分子，其可以缔合或可以通过非共价或共价相互作用而缔合以提供根据本公开的gRNA。例如，在诸如Cpf1的单RNA向导的核酸内切酶的情况下(参见Zetsche等，2015，同上)，作为单向导核酸序列的crRNA可能足以介导DNA靶向。

如本文所使用的，术语“锌指核酸酶”是指包含核酸切割结构域的核酸酶，所述核酸切割结构域与含锌指阵列的结合结构域连接。切割结构域可以是II型限制性核酸内切酶Fokl的切割结构域。锌指核酸酶可以设计为虚拟靶向给定核酸分子中的任何期望序列以进行切割，并且设计锌指结合结构域以结合复杂基因组背景下唯一位点的这种可能性允许在活细胞中对单个基因组位点的靶向切割。将双链断裂靶向期望的基因组基因座可用于将InDel引入期望的基因组基因座的核苷酸序列中。可以通过本领域技术人员众所周知的方法产生锌指核酸酶以靶向感兴趣的位点。例如，可以通过结合已知特异性的各个锌指基序来设计具有期望的特异性的锌指结合结构域。与DNA结合的锌指蛋白Zif268的结构为这一领域的许多工作提供信息，并且已描述了为64个可能的碱基对三联体中的每一个获取锌指，并然后混合并匹配这些模块化锌指以设计具有任何期望的序列特异性的蛋白的概念(Pavletich NP，Pabo CO(1991)；“Zinc finger-DNA recognition:crystal structure ofa Zif268-DNA complex at 2.1A”，Science 252(5007):809-17)。

本文所使用的术语“TAL效应子核酸酶”(TALEN)是指序列特异性核酸酶或编码其的核酸。TAL效应子是植物病原细菌的蛋白质，且被病原体注入到植物细胞中，在这里它们到达细胞核，并作为转录因子发挥作用以启动特异性植物基因。TAL效应子的主要氨基酸序列决定其所结合的核苷酸序列。因此，可以预测TAL效应子的靶位点，并且还可以工程化和产生TAL效应子用以结合特定核苷酸序列的目的。特异性取决于不完整的效应子可变数目，通常是34个氨基酸重复(Schornack et al.(2006)J.Plant Physiol.163:256)。多态性主要在重复位置12和13处，其在本文中称为重复可变双残基(RVD)。TAL效应子的RVD以直接、线性的方式对应于其靶位点中的核苷酸，一个RVD对应一个核苷酸，具有一些简并性且没有明显的背景依赖性。这一发现为蛋白质-DNA识别提供一种有价值的机制，其使得能够预测新的靶特异性TAL效应子的靶位点。TAL效应子本身并不包含核酸酶结构域。因此TAL效应子核酸酶或TALEN表示其中TAL效应子编码核酸序列与编码核酸酶或核酸酶的一部分的序列融合的融合构建体，所述核酸酶的一部分通常是来自II型限制性核酸内切酶(例如，FokI)的非特异性切割结构域(Kim et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160)。可以与效应子结构域融合的其它有用的核酸内切酶可包括，例如，HhaI、HindIII、Nod、BbvCI、EcoRI、BglI和AlwI。可以利用某些核酸内切酶(例如，FokI)仅用作二聚体的事实来增强TAL效应子的靶特异性。例如，在某些情况下，每个FokI单体都可以与识别不同DNA靶序列的TAL效应子序列融合，并且只有当两个识别位点紧密接近时，非活性单体聚在一起形成功能性酶。通过要求DNA结合来激活核酸酶，可以产生高位点特异性的限制性酶。

如本文所使用的，术语“大范围核酸酶”是指以大于12个碱基对的识别序列结合双链DNA的核酸内切酶。天然存在的大范围核酸酶可以是单体(例如，I-SceI)或二聚体(例如，I-CreI)。本文所使用的术语大范围核酸酶可用于指单体大范围核酸酶、二聚体大范围核酸酶，或指缔合以形成二聚体大范围核酸酶的单体。术语“归巢核酸内切酶”与术语“大范围核酸酶”同义。由于大范围核酸酶的识别位点大，该位点在任何给定基因组中通常只出现一次。因此，大范围核酸酶可用于在哺乳动物细胞和植物中实现非常高水平的基因靶向效率(Rouet et al.,MoI.Cell.Biol.,1994,14,8096-106；Choulika et al.,MoI.Cell.Biol.,1995,15,1968-73)。在大范围核酸酶中，归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族在过去几年中已成为研究基因组和的重要工具。术语“LAGLIDADG大范围核酸酶”是指包括单个LAGLIDADG基序的大范围核酸酶(其为天然二聚体)，或者是指包括两个LAGLIDADG基序的大范围核酸酶(其为天然单体)。

例如，也可以使用可编程碱基编辑器，任选地与可编程核酸酶结合，而引入所述至少一个InDel。本文所使用的可编程“碱基编辑器”是指具有与其衍生的蛋白质相同的催化活性的蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段(单独或作为分子复合物提供在本文中称为碱基编辑复合物时)具有介导靶向碱基修饰(即，转化感兴趣的碱基而产生感兴趣的点突变)的能力。优选地，在本发明的上下文中，至少一个碱基编辑器暂时性或永久性地连接至至少一个位点特异性的可编程效应子，或任选地连接至至少一个位点特异性的、可编程效应子复合物的组分。所述连接可以是共价的和/或非共价的。多个出版物已表明，使用与胞苷脱氨酶结构域载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽(APOBEC1)(例如，衍生自大鼠的APOBEC)连接的CRISPR/Cas9切口酶或非功能性核酸酶，进行靶向碱基转化，主要是胞苷(C)转化为胸腺嘧啶(T)。胞苷脱氨酶催化胞嘧啶(C)的脱氨基反应，并产生尿嘧啶(U)，其具有胸腺嘧啶(T)的碱基配对特性。大多数已知的胞苷脱氨酶在RNA上起作用，并且为数不多的接受DNA的实例需要单链(ss)DNA。对dCas9靶DNA复合物的研究表明，在形成Cas9向导RNA-DNA‘R-环’复合物后，替换的DNA链的至少九个核苷酸(nt)是不成对的(Jore et al.,Nat.Struct.Mol.Biol.,18,529-536(2011))。事实上，在Cas9 R-环复合物的结构中，替换的DNA链上的前间区序列的前11个nt是无序的，这表明它们的运动不是高度受限的。还已推测，Cas9切口酶诱导的非模板链中的胞嘧啶处的突变可能是由细胞胞嘧啶脱氨酶对它们的可及性引起的。有理由认为，R-环中此ssDNA片段的一个子集可以充当dCas9系胞苷脱氨酶(dCas9-tethered cytidine deaminase)的有效底物，以实现将DNA中的C直接、可编程转化为U(Komor等，同上)。近期，Goudelli等((2017).Programmable base editing of A·T toG·C in genomic DNA without DNA cleavage.Nature,551(7681),464.)描述了介导基因组DNA中A·T转化为G·C的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。

因此，根据本发明的任何碱基编辑复合物可以包含至少一种胞苷脱氨酶或其催化活性片段。所述至少一种碱基编辑复合物可包含胞苷脱氨酶或其催化活性片段形式的结构域，作为碱基编辑器。

在本发明的一个实施方案中，可以修饰包含期望的性状的供体植物，例如通过使用可编程核酸酶将InDel引入本文所述的合适的基因组基因座中以产生人工InDel标志物等位基因。在人工InDel标志物等位基因包含缺失的情况下，设计对缺失的序列具有特异性的引物。本领域技术人员将容易地设计合适的引物。

本文所使用的“引物”是指寡核苷酸(合成的或天然存在的)，当置于互补链的合成由聚合酶催化的条件下时，所述寡核苷酸能够作为沿互补链的核酸合成或复制的起始点。通常，引物的长度为约10-30个核苷酸，但是可以更长或更短。引物可以以双链形式提供，但更常使用单链形式。引物还可包含可检测标记，例如5’端标记。

在将供体植物与野生型植物杂交后，通过例如(q)PCR或其它合适的技术分析后代样品中存在或不存在缺失标志物等位基因。本文所定义的“野生型”植物/生物体是指与其中已引入至少一个InDel的供体植物相同物种或品种的未修饰植物。

对缺失的序列具有特异性的引物获得的信号指示子代植物具有野生型基因型，其缺乏感兴趣的供体性状，或者至少感兴趣的性状没有被子代植物以纯合的方式遗传。相反，没有对于引物1+2的信号(见图1A)可以表明供体性状的同质繁殖(homogenousmultiplication)。然而，仍然不确定没有信号是否确实由于缺乏供体性状，或者是否其它因素(例如，引物退火不足等)是有责任的。为了提高引物特异性，缺失的长度优选为至少约10bp，优选长度为约20bp。

在人工InDel标志物等位基因包含插入和缺失的组合时，可以使用本文定义的可编程核酸酶，在感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的侧翼区域内的预定基因组基因座插入与期望的性状连锁的插入和缺失。对插入具有特异性的引物(见以下说明中的引物3+4)可用于检测供体性状。由于在野生型中不存在插入，阳性信号可靠地指示后代植物中存在供体性状，使得存在或不存在期望的性状的评估具有高度特异性并且更加准确。此外，对缺失标志物具有特异性的引物可用于鉴定的确含有期望的性状的子代植物(对引物1+2无信号)。

因此，在确定期望的性状存在与否时，插入与缺失的组合更为可靠，因为存在/不存在由阳性PCR信号确定。所述方法允许评估供体植物和野生型植物杂交获得的子代样品的基因组中是否存在期望的性状，以及供体性状是以纯合还是杂合方式繁殖的。

因此，根据优选实施方案，本发明的方法包括引入包含插入和缺失的InDel。插入和/或缺失优选为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对。

如图1B所示，在此优选实施方案中，引物1+2可以完全位于缺失区域中，因此仅检测到野生型基因型。即使引物之一位于缺失之外(或两个引物部分地位于缺失之外)，标志物系统仍具有特异性，因为将只有对于野生型基因型才会得到PCR产物。因此，只要引物的大部分(例如10bp)位于缺失区域内，就可以确保标志物系统的特异性。

除了对缺失具有特异性的引物1+2之外，还可以使用对插入具有特异性的额外的引物。例如，引物3+4可以完全位于插入区域中，使得仅检测到供体基因型。即使其中引物之一位于插入之外(或两个引物部分地位于插入之外)，标志物系统仍具有特异性，因为只要有至少一个引物位于插入区域中，将只有对于供体基因型得到PCR产物。

因此，本文所述的本发明方法中的插入和缺失的组合以及使用对所插入的InDel具有特异性的引物，提供了确定存在或不存在期望的性状的可靠策略，因为通过阳性PCR信号确定存在/不存在显著降低“假阳性”或“假阴性”的可能性。

在本文所述的本发明方法的另一个实施方案中，在育种过程开始时，即在供体与期望的优良品系杂交之前，将至少一个InDel有利地引入供体植物基因组(其包含感兴趣的核酸，其优选地编码赋予感兴趣的性状的多肽)中的基因组基因座中。“优良品系”是指经过育种和选择优异农艺性状而得到的任何品系。许多优良品系是本领域技术人员可获得和已知的。

上述方法确保所有与供体杂交的优良品系都能很容易地针对InDel标志物等位基因进行筛选。通过基于给定供体基因组背景下产生的InDel标志物等位基因设计一种筛选测定法，可以对不同优良品系使用一个已建立的筛选系统，来评估此优良品系是否已经遗传期望的性状。这种方法避免了费力且耗时地开发针对通过使优良品系与供体品系杂交而在其中插入InDel标志物等位基因的给定优良品系的遗传背景而设计的标志物测定法。因此，使用上述方法，可以通过使用针对性状供体的基因组背景而设计的一种已建立的筛选方法来评估不同优良品系中是否包含供体的期望的性状。此外，可以并行测试由于基因组编辑而对于表型的副作用(例如，多效性作用)。

此外，如果已经在育种过程中使用InDel标志物等位基因，则可以对一个或几个优良供体进行编辑，以产生适合于标志物辅助育种和质量控制概念的第二供体世代(见图1C)。

图2示出示例性的上述育种过程。包含期望的性状(星号)的纯合供体与人工InDel标志物等位基因(灰色填充)连锁。通过可编程核酸酶将InDel多态性引入与期望的性状相关的感兴趣的核酸的合适侧翼区域的基因组基因座中。在普通的育种过程中，将纯合供体与数个优良品系杂交以得到(在回交/自交和选择后)包含与期望的性状相关的感兴趣的核酸的纯合优良品系。由于开发对供体品系的基因组背景具有特异性的InDel标志物等位基因，可以通过使用一种专为供体基因型的InDel标志物等位基因的侧翼区域设计的单一筛选测定法，来针对与期望的性状相关的InDel标志物等位基因筛选优良品系。因此，根据所述方法，不需要专为不同优良品系的不同基因型侧翼区域开发筛选测定法。因此，在育种为优良品系的过程(渗入过程)的最开始就将所述至少一个InDel插入与供体性状遗传上连锁的基因组基因座中，提供一种针对独立于其各自的基因组背景而插入的期望的性状，来筛选不同优良品系的方法。

本文所述的术语“回交”是指后代植物反复回交其亲本之一的过程。“供体”包含与InDel标志物等位基因连锁的与期望的性状相关的感兴趣的核酸序列，其被渗入受体品系。“受体”可以是感兴趣的核酸待渗入的优良品系或任何其它植物。如本文所定义的“渗入”是指遗传基因座的期望的等位基因从一个遗传背景传递到另一个遗传背景。初始杂交产生F1代。如图2所示，在多个世代之间重复进行回交(每个连续回交代的后代个体自身回交至相同的亲本基因型)，直到得到包含与InDel标志物等位基因连锁的感兴趣的性状的纯合优良品系。

如本文所使用的，在标志物辅助选择或育种的上下文中，“选择(selecting)”或“选择(selection)”是指基于某些预定标准挑选或筛选期望的个体(正常是从群体中)的行为。合适的选择技术是众所周知的，并且是植物育种领域中任何技术人员的实验设置的常规部分。

将InDel引入基因组基因座中，得到可与感兴趣的核酸一起遗传给所述生物体的后代的人工标志物等位基因。人工标志物等位基因(一旦将InDel引入基因组区域)可以根据其多核苷酸长度和/或序列进行检测和区分。

因此，可以使用用于检测基因组DNA样品中多态性的任何可用的方法，来检测人工标志物等位基因，此类检测工具和方法在本文中是指“分子标志物”。基因组DNA样品可以是直接从植物中分离的基因组DNA、克隆基因组DNA或扩增基因组DNA。

基于PCR的方法优选用于检测人工标志物等位基因，但可以可替代地使用带有特异性探针的各种杂交技术中的任一种，包括Southern印迹杂交法(Southern blotting)、原位杂交法和比较基因组杂交法。此外，DNA消化和高效毛细管电泳可用于检测人工标志物等位基因。其它合适的检测方法包括微阵列、基于质谱的方法和/或核酸测序方法。

在本发明的优选实施方案中，分子标志物定义为对人工标志物等位基因具有特异性的一对引物，即，包含至少一个InDel的预定基因组基因座，或野生型基因组基因座。引物的长度优选为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对。

靶基因的标志物测定法也大多可用。但是，这些测定法并不总是完全诊断的/唯一的。完全诊断的标志物等位基因在每种情况下都是功能多态性。然而，由于感兴趣的核酸/感兴趣的性状的侧翼区域的特征，并非总是可以设计用于标志物辅助选择的合适的标志物测定法。此外，在功能性SNP标志物等位基因的情况下，不可能开发出适用于对育种过程中的新性状进行可靠质量控制测定的高灵敏度测定法。InDel标志物等位基因(与本文所述的一种类似)可以用于靶性状的标志物辅助选择中，并且可以应用于高灵敏度的质量控制测定中。例如，本发明的标志物等位基因可用于确保与相应目标性状相关的种子繁殖的纯度，并避免包含不期望的性状或缺乏期望的感兴趣的性状的种子受到污染。尽管原则上可以基于SNP多态性开发灵敏的测定法，SNP检测的灵敏度在技术上受到限制，并且灵敏度显著低于本文所述的人工InDel标志物等位基因，因为多态性的检测仅基于一个单碱基对错配，可很容易导致假阳性和假阴性的检测。在本文所述的InDel多态性的情况下，可以在数千个样品中检测一个(不期望的)等位基因，而SNP多态性只可以允许在几十个样品中检测(不期望的)等位基因。

根据本发明的第二方面，提供一种用于确定含感兴趣的核酸的个体和不含感兴趣的核酸的个体的混合群体中存在感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的方法，所述方法包括使用对人工标志物等位基因具有特异性的至少一个分子标志物和/或对野生型基因组基因座具有特异性的至少一个分子标志物，检测本发明的第一方面所定义的人工标志物等位基因。

所述至少一个分子标志物如本文在本发明的第一方面中所定义的，并且优选为与野生型基因组基因座或人工标志物等位基因退火的一对引物。优选地，所述引物允许检测包含插入和缺失标志物的人工标志物等位基因。所述引物可对基因组基因座中插入或缺失的序列具有特异性。引物的长度优选为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对。

植物的“群体”是指包括任何数量的自然个体或从中获取的用于评估的样品或数据的集合。

根据本发明的第三方面，提供了一种评估包含感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的个体的群体的同质性的方法，所述方法包括使用对人工标志物等位基因具有特异性的至少一个分子标志物和/或对野生型基因组基因座具有特异性的至少一个分子标志物来检测本发明的第一方面所述的人工标志物等位基因并确定群体中的同质性，其中检测出野生型基因组基因座指示群体中包含感兴趣的核酸的个体的异质性分布。

优选地，所述至少一个分子标志物是与野生型基因组基因座或人工标志物等位基因退火的一对引物。优选地，所述引物允许检测包含插入和缺失标志物的人工标志物等位基因。引物可对基因组基因座中插入或缺失的序列具有特异性。引物的长度优选为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对。

根据本发明的第四方面，提供了一种将感兴趣的核酸(其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)渗入个体的群体中的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)在包含感兴趣的核酸的供体生物体中制备根据本发明的第一方面的人工标志物等位基因；

(ii)将所述供体生物体与不含感兴趣的核酸的同一物种的受体生物体杂交，以产生异质遗传组成的后代；

(iii)回交/自交和选择人工标志物等位基因的存在以得到纯合遗传组成的后代，其包含受体生物体背景中的感兴趣的核酸，

(iv)任选地，重复步骤(iii)至少一次，优选重复多次。

所述方法的步骤(iii)基于使用专门用于检测后代中存在人工标志物等位基因的至少一个分子标志物和/或专门用于检测后代中不存在人工标志物等位基因的至少一个分子标志物进行的检测。优选地，所述至少一个分子标志物是与野生型基因组基因座或人工标志物等位基因退火的一对引物。优选地，所述引物使得可以检测包含插入和缺失标志物的人工标志物等位基因。引物可对基因组基因座中插入或缺失的序列具有特异性。引物的长度优选为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基对。

受体生物体可以是优良品系、野生型生物体或转基因生物体。术语“野生型”和“优良”如本文所定义。术语“转基因”是指这样的生物体，其中基因或遗传物质已从一个生物体转移到另一个生物体(通常通过多种基因工程技术中的任何一种)，或从同一个生物体转移，但遗传物质不在其基因组中的天然基因座。

根据本发明的第五方面，提供一种制备对感兴趣的核酸具有特异性的人工标志物等位基因的方法，所述方法包括设计一个或多个基因型特异性InDel，并将所述InDel引入生物体基因组中的基因组基因座中，其中所述基因组基因座与感兴趣的核酸连锁。生物体可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个单独的InDel，其产生用于检测和跟踪目的的各种指纹。

还提供一种包含可通过上述方法得到的至少一个基因型特异性InDel的人工标志物等位基因。

根据本发明的第六方面，提供根据第五方面所述的人工标志物等位基因或可通过根据本发明的第一方面所述的方法得到的人工标志物等位基因在标志物辅助育种中的用途。

本发明的另一个方面涉及InDel标志物等位基因与感兴趣的内源基因的修饰的组合的用途。感兴趣的基因的修饰可通过众所周知的基因编辑方法(例如，定点核酸酶，包括CRISPR核酸酶系统、锌指核酸酶、TALEN、大范围核酸酶等)实现，以产生感兴趣的“人工性状”。基于GE的基因修饰和本文所述的人工InDel标志物等位基因的组合使用容易地允许可以对再生的修饰的植物(来自基因编辑的植物材料)或其修饰的后代的直接且可靠的检测。

本文中提及的“内源”基因不仅是指以天然形式(即，没有任何人为干预)在植物中发现的相关基因，而且还指以分离形式随后(重新)引入植物(转基因)中的相同基因(或基本同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可能遭遇转基因表达的实质增加或降低，和/或内源基因表达的实质增加或降低。分离的基因可以是从生物体分离的，或者可以是人造的(例如通过化学合成)。

还提供可编程核酸酶用于产生鉴别生物体基因组中感兴趣的核酸的人工标志物等位基因的用途。如本文所述，所述可编程核酸酶可选自CRISPR核酸酶系统、锌指核酸酶、TALEN或大范围核酸酶。

根据本发明的第七方面，提供一种包含可通过根据第一方面所述的方法得到的人工标志物等位基因或包含根据本发明的第五方面所述的人工标志物等位基因的植物或种子。所述植物可以是任何植物，并且可以例如选自大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharum officinarium)、玉米(Zea mays)、谷子(Setaria italica)、小粒野生稻(Oryza minuta)、水稻(Oriza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、小麦(Triticumaestivum)、黑麦(Secale cereale)、苹果(Malus domestica)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、海滨大麦(Hordeum marinum)、节节麦(Aegilops tauschii)、Daucusglochidiatus、甜菜(Beta vulgaris)、Daucus pusillus、Daucus muricatus、野胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitisvinifera)、Erythrante guttata、黄花螺旋狸藻(Genlisea aurea)、黄瓜(Cucumissativus)、川桑(Morus notabilis)、Arabidopsis arenosa、琴叶拟南芥(Arabidopsislyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、须弥芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa pastoris)、Olmarabidopsis pumila、硬毛南芥(Arabis hirsute)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、Brassica oeleracia、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassica juncea)、黑芥(Brassicanigra)、芝麻菜(Eruca vesicaria subsp.sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、麻疯树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、Cicer yamashitae、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、Cicer reticulatum、Cicer judaicum、木豆(Cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、紫云英(Astragalus sinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、夏堇(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、大葱(Alliumfistulosum)、大蒜(Allium sativum)和韭菜(Allium tuberosum)。

在本申请文件的整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和“包含”及词语的变形，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，意为“包括但不限于”且不排除其它组件、整数或步骤。此外，除非上下文另有要求，否则单数包含复数：特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则申请文件应理解为考虑复数以及单数。

当涉及诸如参数、量、时间长度等的可测量值时，本文所使用的术语“约(about)”或“约(approximately)”旨在涵盖所述值+/-20％或更小的变化，优选为所述值+/-10％或更小的变化，更优选为所述值+/-5％或更小的变化，且甚至更优选为所述值+/-1％或更小的变化，以及从所述值+/-20％或更小的变化，优选为从所述值+/-10％或更小的变化，更优选为从所述值+/-5％或更小的变化，且甚至更优选为从所述值+/-1％或更小的变化，在这个范围内，这种变化适合于在所公开的本发明中执行。应当理解，修饰语“约”或“约”所指的值本身也被具体地且优选地公开。

尽管术语“一个或多个”或“至少一个”(例如一组成员中的一个或多个或至少一个成员)本身是清楚的，通过进一步举例说明，尤其是所述术语涵盖对任何一个所述成员或任何两个或更多个所述成员的引用，例如，所述成员中≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等的任何，以及多达所有所述成员。

本发明的每个方面的优选特征可以如结合任何其它方面所描述的。在本申请的范围内，明确意图是，在前面的段落、权利要求和/或以下描述和附图中阐述的各个方面、实施方案、实施例和替代方案，以及特别是其各个特征，可以独立使用或以组合的方式使用。换言之，可以以任何方式和/或组合来组合所有的实施方案和/或任何实施方案的特征，除非这些特征是不相容的。

附图简述

现在将参考附图仅以举例的方式对本发明的一个或多个实施方案进行描述，其中：

图1A-C示出标志物辅助分析和质量控制测定的示意图，其中通过使用本发明的InDel方法可以确保具有期望的性状的繁殖的种子的纯度。

图2示出育种过程的示意图，其中在育种过程开始时，即在使供体与期望的优良品系杂交之前，将InDel引入供体植物(包含感兴趣的核酸，其优选编码赋予感兴趣的性状的多肽)的基因组基因座中。

图3示出编码突变的细胞色素P450氧化酶(其赋予雄性不育)的基因的InDel标志物辅助选择。

图4示出编码点突变的乙酰乳酸合酶(赋予除草剂抗性)的基因的InDel标志物辅助选择。

实施例

实施例1：缺失标志物等位基因

利用基因组编辑引入缺失用于标志物辅助选择

该实施例展示使用缺失标志物检测期望的性状，所述期望的性状否则由于位于病因多态性侧翼的基因组区域的特征，会是难以鉴定的。

在DE 10 2016 106 656.7中公开的甜菜突变体BvCYP703A2_gst在编码赋予突变体雄性不育表型的细胞色素P450氧化酶的基因中包含缺失(野生型(WT)BvCYP703＝BvCYP703_WT(SEQ ID NO:75))。该表型可以例如用于改善育种程序和用于杂交种子的生产。

突变体BvCYP703A2_gst(SEQ ID NO:76)在位置1560和2100之间包含大的缺失(参见图3)。然而，由于位于缺失侧翼的基因组区域的特征(即，高度重复和高AT含量)，难以(如果不是不可能的话)设计可以允许直接检测病因多态性本身的合适的引物和测定法。因此，由于缺乏合适的测定方法，所以不可能通过直接检测缺失来针对期望的基因型筛选通过将野生型植物与供体杂交而获得的后代植物。

因此，本发明人鉴定了编码细胞色素P450氧化酶的基因的侧翼区域中适合于InDel标志物辅助选择期望的基因型的区域。造成所述性状(雄性不育)的天然发生的缺失位于BvCYP703A2基因的第-200和+333位之间(编号从翻译起始位点开始)。由于缺失会引起基因破坏，毫无疑问，其余的基因特征(例如，外显子)是无功能的，并且在其余外显子内的额外的操作不会引起多效性作用。因此，选择其余外显子1的部分，跨越区域+334至+500，作为人工InDel标志物等位基因的靶位点。从缺失第+334位到感兴趣的区域末端(+500)的最大距离为166bp，对应于0.00096cM的遗传距离。对166bp片段的Blast分析未揭示甜菜基因组中的非特异性命中。进一步的序列分析(重复性、GC含量、碱基分布)导致将+434至+443的区域定义为人工缺失的靶位点，其中InDel特异性引物在第+420至+449位之间。

如本文所述，通过基因组编辑将缺失插入该靶位点(SEQ ID NO:77)。针对缺失标志物的侧翼区域设计合适的引物(参见上文)。由于其与期望的基因型的紧密连锁，该缺失可用于鉴定赋予雄性不育的后代植物。对于缺失的同质/异质检测，应进行两次PCR反应。

可用于检测供体和/或野生型株的可能引物有：

BvCYP703A2_WT_fwd：5’-TAGACGACTTGAACTATTTGTGAG-3’(SEQ ID NO:45)

BvCYP703A2_gst_fwd：5’-TAGACGACTTGAACTTCATAGGGC-3’(SEQ ID NO:46)

BvCYP703A2_rev：5’-AAAGTATTGCTTCCCTAGCAACA-3’(SEQ ID NO:47)

实施例2：插入标志物等位基因

利用基因组编辑引入插入用于标志物辅助选择

该实施例展示通过使用本文所述的InDel标志物方法，可以可靠地鉴定由于其因果联系是单核苷酸多态性(SNP)而难以进行检测的期望的性状。

在该实施例中，编码酶乙酰乳酸合酶的基因中第+1706位处的单点突变赋予甜菜植物中对磺酰脲类除草剂的抗性(如WO 2012/049268中所公开的；野生型(WT)BvALS＝BvALS_WT(SEQ ID NO:78；点突变BvALS＝BvALS_SU_res(SEQ ID NO:79))。该单核苷酸多态性是难以检测的，因为专为筛选具有供体性状的植物而设计的引物与野生型序列相比仅在一个单核苷酸上存在差异，因此增加假阳性和/或假阴性的可能性，这限制筛选的质量。

通过将InDel标志物引入编码乙酰乳酸合酶的突变的基因的侧翼区域，可以克服这一缺陷(参见图4)。

本发明人鉴定适合于设计人工标志物等位基因的突变的基因的形态发生侧翼区域。导致所述性状(SU抗性，W569L)的SNP位于BvALS基因的第+1706位处(编号从翻译起始位点开始)。所述基因的注释3’UTR区域在第+2252位处结束。本发明人无法定位从第+2253位开始到第+4000位的基因组特征。从SNP第+1706位到感兴趣的区域末端(+4000)的最大距离为2294bp，对应于0.00036cM的遗传距离。2294bp片段的Blast分析未揭示甜菜基因组中的非特异性命中。迭代序列分析(blast，比对)使得选择适合人工InDel放置的区域+2274至+2445。进一步的序列分析(重复地、GC含量、碱基分布)使得将区域+2285至+2293定义为人工靶位点，其中InDel特异性引物组在第+2274至+2303位之间(见图4)。

该靶位点中可以插入9bp长的插入物，所述插入物是非同源的并且对于供体品系的基因组库是唯一的(SEQ ID NO:80)。如本文所述设计针对所述插入物的侧翼区域的合适引物。对于插入标志物的同质/异质检测，需要进行两次PCR反应。

然后，基于这种方法，可以针对插入赋予除草剂抗性的期望的突变，而无需依赖病因多态性本身来筛选由供体与野生型植物杂交得到的后代植物。

可用于检测供体和/或野生型株的可能引物有：

BvALS_WT_fwd：5’-ACTAGTTGGCTTGGTGCATCT-3’(SEQ ID NO:48)

BvALS_SU_res_fwd：5’-ACTAGTTGGCTGCACTATCGTGC-3’(SEQ ID NO:49)

BvALS_rev：5’-CCAATGCTCCCATGTCAGGT-3’(SEQ ID NO:50)

实施例3：确保各个性状的种子繁殖纯度的质量控制测定

该实施例示出如何可以通过使用本文所述的InDel方法来确保具有期望的性状的繁殖种子的纯度。

在该实施例中，通过将核苷酸序列(GCACTATCG)引入其基因组来修饰包含期望的性状的供体品系，以产生与期望的性状紧密连锁的人工插入标志物等位基因。

在将包含插入标志物等位基因的供体与不含人工标志物等位基因的野生型植物杂交后，获得F1后代植物，其在其遗传组成上是异质的。回交和随后的选择产生野生型植物的遗传背景内包含感兴趣的性状的植物。为了确保包含期望的性状的植物的种子繁殖的同质性和纯度，使用对野生型(引物1+3)和/或供体(引物2+3)具有特异性的引物对来分析种子样品。之后，通过例如(q)PCR分析种子样品容易地允许评估纯度的程度(参见图1C)。

因此，基于该质量控制测定法，可以可靠地评估所测的种子样品对于期望的性状是否是纯合的，或者种子是否被与期望的供体性状对应的野生型基因/性状“污染”。如果与期望性状连锁的多态性是单核苷酸多态性，则这样的质量控制将是不可能的，因为单核苷酸错配不能提供足够的分辨率和特异性以确保通过(q)PCR的可靠的质量评估。

实施例4：用于产生与期望的性状连锁的人工InDel标志物等位基因的基于GE的技术

该实施例提供关于如何进行以下的技术描述：

(a)通过基于GE的基因修饰在编码细胞色素P450氧化酶的基因中具有较大缺失的供体基因组中产生缺失标志物等位基因造成雄性不育(实施例1)，

(b)通过基于GE的基因修饰在编码酶乙酸乳酸合酶的基因中具有点突变的供体基因组中产生插入标志物等位基因赋予甜菜植物除草剂抗性(实施例2)，以及

(c)通过经由GE引入特异性点突变(G→T)从而在甜菜植物中赋予除草剂抗性，并产生与人工产生的感兴趣的性状连锁的插入标志物等位基因，来修饰编码乙酸乳酸合酶的内源基因。

crRNA的设计和选择：

使用CRISPR RGEN工具设计针对Cpf1诱导的双链断裂的合适crRNA(http://www.rgenome.net/cas-designer/[Park J.,Bae S.,and Kim J.-S.Cas-Designer:A web-based tool for choice of CRISPR-Cas9 target sites.Bioinformatics 31,4014-4016(2015).以及Bae S.,Park J.,and Kim J.-S.Cas-OFFinder:A fast and versatilealgorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guidedendonucleases.Bioinformatics 30,1473-1475(2014).)。因此，鉴定并选择基因组DNA序列内合适的前间区序列(protospacer)。为确保来自毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)ND2006(Lb)(SEQ ID NO:51)的Cpf1核酸内切酶的功能性，选择长度为24个核苷酸的前间区序列，其中，在5’端的基因组结合序列侧翼为必需的前间区序列邻近基序(PAM)，其具有序列5’-TTTV-3’(V为G、C或A)。根据工具的规定质量标准选择合适的前间区序列，并使用甜菜的内部参考基因组分析其潜在的脱靶。

为了进一步的实验，选择crRNA，除了实际的靶序列外，crRNA还与功能性PAM具有至多15个相同碱基。由于前间区序列的前18个核苷酸对于识别和切割靶序列是必不可少的，因此有可能避免其它基因组序列中不必要的切割[Tang,X.,L.G.Lowder,T.Zhang,A.A.Malzahn,X.Zheng,D.F.Voytas,Z.Zhong,Y.Chen,Q.Ren,Q.Li,E.R.Kirkland,Y.Zhangand Y.Qi(2017)."A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing andtranscriptional repression in plants."Nat Plants 3:17018]。基于这种方法，鉴定出特异于以下各个位置的潜在crRNA(参见表A)。

表A：所选择的靶序列。PAM序列带有下划线。

遗传元件的克隆：

为了克隆Cpf1-和crRNA表达盒，通过引入点突变(T→G)从靶载体pZFNnptII中去除限制性酶BbsI的阻碍识别序列。使用两种诱变引物，按照制造商的说明，用商业可得的诱变试剂盒进行诱变(参见表B)。

表B：用于引入点突变(G→T，带下划线)来去除BbsI识别序列的诱变引物

为了甜菜中Lbcpf1基因的表达，合成包含针对拟南芥(A.thaliana)进行密码子优化的DNA序列的DNA片段，其中所述DNA序列具有来自欧芹(Petroselinum crispum)的5’侧翼PcUbi启动子序列和来自Pea sp.的3’侧翼3A终止子序列(SEQ ID NO:52)。与克隆相关的Lbcpf1编码序列内限制性切割位点可通过引入沉默突变(即不影响氨基酸序列的核苷酸交换)而去除。密码子优化是基于ThermoScientific的GeneArt算法进行的。为了允许cpf1转运到细胞核中，cpf1的编码序列在5’端与来自SV40的核定位信号(NLS)以及在3’端与来自核质蛋白的NLS连接。为了与二元靶载体pZFNnptII连接，表达盒的侧翼是两个HindIII限制性切割位点。为了克隆crRNA表达盒，在5’侧翼HindIII切割位点和PcUbi启动子序列之间插入额外的PstI切割位点。通过遵循标准方案完成pZFNnptII_LbCpf1的连接。通过测序证实成功插入PcUbi::Cpf1::TPea表达盒(SEQ ID NO:52)，其中将所用的引物设计为与跨越载体侧翼区域以及表达盒的部分的区域特异性结合(参见表C)。

表C：用于测序整合到pZFNnptII载体中的PcUbi::Cpf1::TPea表达盒的引物

在植物细胞中转录后，crRNA被两个侧翼核酶切割。因此，前体crRNA的侧翼为锤头状核酶(SEQ ID NO:53)和HDV核酶(SEQ ID NO:54)的编码序列[Tang,X.,L.G.Lowder,T.Zhang,A.A.Malzahn,X.Zheng,D.F.Voytas,Z.Zhong,Y.Chen,Q.Ren,Q.Li,E.R.Kirkland,Y.Zhang and Y.Qi(2017)."A CRISPR-Cpf1 system for efficientgenome editing and transcriptional repression in plants."Nat Plants 3:17018.]。存在用于转录crRNA的其它方法，例如通过PolII启动子、从mRNA上切割Cpf1、其它核酶等。为了将单个前间区序列与crRNA重复序列无缝连接，在crRNA重复和HDV核酶之间整合两个BbsI识别序列，其中相应地调整用于克隆的突出端。

为了确保cpf1和crRNA的表达强度相同，crRNA核酶盒的侧翼是5’端的PcUbi启动子序列和3’端的3A终止子序列。crRNA表达盒的侧翼为两个PstI切割位点，以便随后连接到pZFNnptII_Cpf1靶载体(SEQ ID NO:55)中。购买crRNA表达盒(SEQ ID NO:56)作为合成DNA片段。通过遵循标准方案进行连接。通过多轮测序证实正确插入表达盒。将前间区序列安排为互补寡核苷酸，并根据标准方案退火。以这种方式产生的24bp长的DNA片段的侧翼为与连接步骤有关的4nt突出端(参见表D)。

表D：用于产生24bp短前间区序列的寡核苷酸序列，用于连接的4nt突出端有下划线。

通过甜菜叶中农杆菌诱导的基因转移，测试4种crRNAs的效率。将pZFNtDTnptII质粒(SEQ ID NO:57)共转化以验证转化效率。遵循标准方案，通过真空渗透完成叶外植体的转化。在六天后通过荧光显微镜测量tDT的荧光。丢弃具有异质性荧光的外植体。渗透后十天，将叶外植体在液氮中速冻，通过CTAB方案分离基态DNA(ground DNA)和基因组DNA。通过NGS(外部服务提供商)根据相对于基因组DNA中未编辑序列的插入编辑数目(例如插入、缺失或核苷酸交换的数目)，验证单个crRNA的效率。

由于所有测试的crRNA均显示出活性，因此与上述核酶、启动子序列和终止子序列一起作为反向表达盒的crRNAs crRNA_ALS_G/T(SEQ ID NO:58)、crRNA_CYP_Del(SEQ IDNO:59)、crRNA_ALS_In1(SEQ ID NO:60)(最有效)和crRNA_ALS_In2(SEQ ID NO:61)安排为合成DNA构建体(总共4个构建体；每个crRNA一个构建体(SEQ ID NO:62、63、64、65))。每个DNA构建体侧翼为用于克隆到靶载体pZFNnptII_LbCpf1(SEQ ID NO:55)中的两个PstI限制性切割位点。插入crRNA后，通过HindIII将LbCpf1和crRNA表达盒从pZFNnptII_LbCpf1_crRNA载体(SEQ ID NO：23、71、72、73、74)连接到pUbitDTnptII载体(SEQ ID NO：66、67、68、69、70)。

生成和使用用于HD修复的修复模板

ALS G→T突变

为了产生G→T点突变，将修复模板设计为在点突变的上游和下游包含1000bp。整个DNA模板被安排为2001bp长的合成DNA片段(SEQ ID NO:24)，并直接用于提供商(provider)的载体骨架中的转化。根据最佳递送方案，使用基因枪通过基因枪共轰击将修复模板质粒和pUbitDTnptII_LbCpf1_crRNA质粒(SEQ ID NO:67)引入甜菜愈伤组织培养物中。转化后一天通过荧光显微镜基于瞬时tDT荧光验证转化效率。在无选择压力(即，没有卡那霉素(Kanamycin))的情况下，在芽诱导培养基中培养愈伤组织培养物。随后针对定点突变测试再生芽(原则上，如果点突变导致ALS抗性增加，则这种增加可用于选择期望的事件)。因此，通过CTAB分离基因组DNA。通过两次PCR，并使用引物5’ALS_G/T和ALS_G/T_Rv以及ALS_G/T_Fw和3’ALS_G/T，扩增点突变。之后，在每种情况中，用两种引物对PCR产物进行测序。在此，重要的是，第一引物的结合发生在修复模板的同源区域内，且第二引物的结合发生在修复模板的5’和3’侧翼同源区域之外(参见表E)。

表E：用于检测点突变的引物

除了检测甜菜基因组中成功点突变外，还分析质粒DNA的不期望的整合。因此，通过PCR分析了已确认在期望的基因座成功整合点突变的基因组DNA中是否存在质粒DNA。cpf1、crRNA核酶盒和tDT内的序列区域用下表F所列的引物扩增。

表F：用于检测甜菜芽基因组中稳定整合的质粒特异性序列的引物

ALS 9bp插入物：

对于ALS 9bp插入物，使用与对于上述ALS G→T突变相似的方法。9bp插入物GCACTATCG的上游和下游侧翼为1000bp的同源序列(SEQ ID NO:35)。

表G：用于检测插入的引物

G→T点突变和ALS中9bp插入物的组合插入：

通常，对于上述两种方法都使用类似的过程。然而，在这种情况下，修复模板的上游和下游侧翼仅为250bp同源序列，因为在具有相应修复模板上游和下游的1000bp的同源侧翼序列将会重叠。在此设置中，使用基因枪共轰击法转化crRNA_ALS_G/T和crRNA_ALS_In1的质粒以及两个修复模板。如上所述进行点突变和9bp插入物的检测。

CYP缺失标志物：

还可以使用上述方法之一来产生和检测缺失。对于产生缺失标志物，重要的是修复模板必须包含9bp缺失(ATTTGTGAG)。然后，其也位于修复模板上游和下游的1000bp同源序列侧翼，并用于构建体(SEQ ID NO:40)。

表H：用于检测缺失的引物

序列表

<110> 科沃施种子欧洲股份两合公司

<120> 人工标志物等位基因

<130> KWS0260PCT

<150> EP18174057.2

<151> 2018-05-24

<160> 80

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_G/T

<400> 1

tttaggtatg gttgtccaat gggaagat 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_In1

<400> 2

tttcggctat ggatgttgtg ttgcatca 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_In2

<400> 3

tttctacgtg gttcggttga tcatatag 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_CYP_Del

<400> 4

tttgtacgtg gttcggttga tcatatag 28

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mutagenesis primer 1

<400> 5

cagtgcagcc gtcgtctgaa aacgaca 27

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mutagenesis primer 2

<400> 6

aacgtcagaa gccgactgca ctatag 26

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_F1

<400> 7

agcgcaacgc aattaatgtg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_R1

<400> 8

gatgaagctg aggtagtacc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_F2

<400> 9

aggaaggtta gcaagctcga g 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_R2

<400> 10

tctcgtcgac cttctggatg 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_F3

<400> 11

atgctgagta cgatgacatc c 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_R3

<400> 12

tagacctgct tctcaacctt ca 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_F4

<400> 13

accactcact cctcgataag 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_R4

<400> 14

aacgacaatc tgatcgggta c 21

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_GT/TG protospacer oligonucleotide

<400> 15

agatggtatg gttgtccaat gggaagat 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_G/T protospacer oligonucleotide

<400> 16

ggccatcttc ccattggaca accatacc 28

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_In1 protospacer oligonucleotide

<400> 17

agatggctat ggatgttgtg ttgcatca 28

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_In1 protospacer oligonucleotide

<400> 18

ggcctgatgc aacacaacat ccatagcc 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_In2 protospacer oligonulceotide

<400> 19

agattacgtg gttcggttga tcatatag 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS_In2 protospacer oligonucleotide

<400> 20

ggccctatat gatcaaccga accacgta 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_CYP_Del protospacer oligonucleotide

<400> 21

agattacgtg gttcggttga tcatatag 28

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_CYP_Del protospacer oligonucleotide

<400> 22

ggccctatat gatcaaccga accacgta 28

<210> 23

<211> 16862

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pZFNnptII_LbCpf1_crRNA cassette

<400> 23

ccggattgaa agaaatatag tttaaatatt tattgataaa ataacaagtc aggtattata 60

gtccaagcaa aaacataaat ttattgatgc aagtttaaat tcagaaatat ttcaataact 120

gattatatca gctggtacat tgccgtagat gaaagactga gtgcgatatt atgtgtaata 180

cataaattga tgatatagct agcttagctc atcgggtcag aagaactcgt caagaaggcg 240

atagaaggcg atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc 300

agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta tgtcctgata 360

gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc cattttccac 420

catgatattc ggcaagcagg catcgccatg agtcacgacg agatcctcgc cgtcgggcat 480

gcgcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct cttcgtccag 540

atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga tgcgatgttt 600

cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc gcattgcatc 660

agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat cctgccccgg 720

cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc 780

gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtcct gaagttcatt 840

cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg 900

gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct 960

ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatcc aagctcccat 1020

tttctgtgat tttggatgtg tttttgtatg gattgagagt gaatatgaga ctctaattgg 1080

ataccgaggg gaatttatgg aacgtcagtg gagcattttt gacaagaaat atttgctagc 1140

tgatagtgac cttaggcgac ttttgaacgc gcaataatgg tttctgacgt atgtgcttag 1200

ctcattaaac tccagaaacc cgcggctgag tggctccttc aacgttgcgg ttctgtcagt 1260

tccaaacgta aaacggcttg tcccgcgtca tcggcggggg tcattccgga ctgtggggcc 1320

atatcccaga actggttgag tcggtccaac acctgggtgc caatcatgtc gatggtgggg 1380

tatggccaat tttttttcaa ttcaaaaatg tagatgtccg cagcgttatt ataaaatgaa 1440

agtacatttt gataaaacga caaattacga tccgtcgtat ttataggcga aagcaataaa 1500

caaattattc taattcggaa atctttattt cgacgtgtct acattcacgt ccaaatgggg 1560

gcttagatga gaaacttcac gatcggctct agaggccatg gcggccgcac tagtggatcc 1620

cccgggatgc atgaattcaa gcttatcgat gtcgacaggc cttaagggcc agatcccccg 1680

ggctgcagaa gcctatactg tacttaactt gattgcataa ttacttgatc atagactcat 1740

agtaaacttg attacacaga taagtgaaga aacaaaccaa ttcaagacat aaccaaagag 1800

aggtgaaaga ctgttttata tgtctaacat tgcaccttaa tatcacactg ttagttcctt 1860

tcttacttaa attcaaccca ttaaagtaaa aacaacagat aataataatt tgagaatgaa 1920

caaaaggacc atatcattta ttaactctta tccatccatt tgcattttga tgtccgaaaa 1980

caaaaactga aagaacacag taaattacaa gcagaacaaa tgatagaaga aaacagcttt 2040

tccaatgcca taatactcaa acttagtagg attctggtgt gtgggcaatg aaactgatgc 2100

attgaacttg acgaacgttg tcgaaaccga tgatacggac gaaagctggg aggcctggtc 2160

ccattcgcca tgccgaagca tgttgcccag ccggcgccag cgaggaggct gggaccatgc 2220

cggccaggtc ttccgcggtc agactgagcg aagactcatc tacacttagt agaaattaga 2280

cgagcttact cgtttcgtcc tcacggactc atcagtaatt tggatccgct gcacatacat 2340

aacatatcaa gatcagaaca cacatataca cacacaaata caatcaagtc aacaactcca 2400

aaaagtccag atctacatat atacatacgt aaataacaaa atcatgtaaa taatcacaat 2460

catgtaatcc agatctatgc acatatatat atacacaatt aataaaaaaa atgatataac 2520

agatctatat ctatgtatgt aacaacacaa tcagatgaga gaagtgatgt tttcagatct 2580

gtatacatac aaacacaaac agatgaacaa ttgatacgta gatccatatg tatacgtaca 2640

attagctaca cgattaaatg aaaaaaatca acgatttcgg attggtacac acaaacgcaa 2700

caatatgaag aaattcatat ctgattagat ataaacataa ccacgtgtag atacacagtc 2760

aaatcaacaa atttatagct tctaaacgga tgagatgaac aagataaaga tattcacata 2820

aggcatacat aagataagca gattaacaaa ctagcaataa tacataccta attaaaacaa 2880

ggaataacag agagagagag agagagagag atttaccttg aaaatgaaga ggagaagaga 2940

ggatttctta aaattggggg tagagaaaga aagatgatga attgtgagaa aggagagata 3000

gaaggggggg ttgtatatat aggctgtaga agattatttt tgtgtttgag gcggtgaagg 3060

aagaggggat ctgactatga cacgtttgcg gttacgtatt tcgataggag tctttcaacg 3120

cttaacgccg ttactctata tgaccgtttg ggccgtaacg gggccgtttg ttaacgctga 3180

tgttgattct tttctttctt tctttcttcc ttttttaaag aagcaattgt acaatcgttg 3240

ctagctgtca aacggataat tcggatacgg atatgcctat attcatatcc gtaatttttc 3300

tgcaggaatt cgatctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 3360

gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 3420

gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 3480

atgattacga attcaaaaat tacggatatg aatataggca tatccgtatc cgaattatcc 3540

gtttgacagc tagcaacgat tgtacaattg cttctttaaa aaaggaagaa agaaagaaag 3600

aaaagaatca acatcagcgt taacaaacgg ccccgttacg gcccaaacgg tcatatagag 3660

taacggcgtt aagcgttgaa agactcctat cgaaatacgt aaccgcaaac gtgtcatagt 3720

cagatcccct cttccttcac cgcctcaaac acaaaaataa tcttctacag cctatatata 3780

caaccccccc ttctatctct cctttctcac aattcatcat ctttctttct ctacccccaa 3840

ttttaagaaa tcctctcttc tcctcttcat tttcaaggta aatctctctc tctctctctc 3900

tctctgttat tccttgtttt aattaggtat gtattattgc tagtttgtta atctgcttat 3960

cttatgtatg ccttatgtga atatctttat cttgttcatc tcatccgttt agaagctata 4020

aatttgttga tttgactgtg tatctacacg tggttatgtt tatatctaat cagatatgaa 4080

tttcttcata ttgttgcgtt tgtgtgtacc aatccgaaat cgttgatttt tttcatttaa 4140

tcgtgtagct aattgtacgt atacatatgg atctacgtat caattgttca tctgtttgtg 4200

tttgtatgta tacagatctg aaaacatcac ttctctcatc tgattgtgtt gttacataca 4260

tagatataga tctgttatat catttttttt attaattgtg tatatatata tgtgcataga 4320

tctggattac atgattgtga ttatttacat gattttgtta tttacgtatg tatatatgta 4380

gatctggact ttttggagtt gttgacttga ttgtatttgt gtgtgtatat gtgtgttctg 4440

atcttgatat gttatgtatg tgcagcgaat tcggcgcgcc atggctccta agaagaagag 4500

gaaggttagc aagctcgaga agtttaccaa ctgctacagc ctctctaaga ccctcaggtt 4560

caaggctatc cctgtgggaa agacccaaga gaatatcgac aacaagaggc tcctcgtcga 4620

ggatgagaag agagctgaag attacaaggg cgtgaagaag ctcctcgaca ggtactacct 4680

cagcttcatc aacgatgtgc tccacagcat caagctcaag aacctcaaca actacatcag 4740

cctcttccgt aagaaaacca ggaccgagaa agagaacaaa gagcttgaga acctcgagat 4800

caacctccgt aaagagatcg ccaaggcttt caagggaaac gagggataca agagcctctt 4860

caagaaggat attatcgaga caatcctgcc tgagttcctg gacgataagg atgagatcgc 4920

tctcgtgaac agcttcaacg gattcactac tgccttcacc ggattcttcg acaacaggga 4980

aaacatgttc agcgaagagg ccaagagcac ctctatcgct ttcagatgca tcaacgagaa 5040

cctcacgcgt tacatcagca acatggacat cttcgagaag gtggacgcca tcttcgataa 5100

gcacgaggtg caagaaatca aagagaagat cctcaacagc gactacgacg tcgaggactt 5160

ttttgaaggg gagttcttca acttcgttct cacccaagag ggcatcgacg tgtacaacgc 5220

tattatcgga ggattcgtga ccgagtctgg ggagaagatt aagggactca acgagtacat 5280

caacctgtac aaccagaaaa cgaagcagaa gctcccgaag ttcaagccgc tctacaagca 5340

ggttctctct gatcgtgaga gcctctcatt ttacggtgag ggttacacct ctgacgagga 5400

agtgcttgag gttttccgta acaccctcaa caagaacagc gagatcttct cgtccatcaa 5460

gaagttggag aaacttttca agaacttcga cgagtacagc agcgctggga tcttcgttaa 5520

gaacggacct gctatcagca ccatcagcaa ggatattttc ggcgagtgga acgtgatcag 5580

ggacaagtgg aatgctgagt acgatgacat ccacctcaag aagaaggctg tcgtcactga 5640

gaagtacgag gatgacaggc gtaagtcgtt caagaagatc ggctctttca gcctcgagca 5700

gcttcaagaa tacgctgatg ctgatctcag cgtggtcgag aagctcaaag agatcatcat 5760

ccagaaggtc gacgagatct acaaggtgta cgggtcctct gagaagttgt tcgatgctga 5820

tttcgtcctc gagaagagtc tgaagaagaa cgacgctgtc gtcgcgatca tgaaggattt 5880

gctcgacagc gtgaagtcct tcgagaacta tatcaaggcc ttcttcggag agggcaaaga 5940

gactaatagg gacgagtctt tctacgggga tttcgtgctc gcttacgata tcctcctcaa 6000

ggtggaccat atctacgacg ccatcagaaa ctacgtgacc cagaagcctt acagcaagga 6060

caagttcaag ttgtactttc agaacccgca gttcatgggc ggatgggaca aagacaaaga 6120

gacagattac agggccacca tcctcaggta cgggtctaag tactacctgg ccatcatgga 6180

caagaaatac gccaagtgcc tccaaaagat cgacaaggat gacgtgaacg ggaactatga 6240

gaagatcaac tacaagctcc ttccgggacc gaacaagatg cttcctaagg tgttcttcag 6300

caagaaatgg atggcctact acaacccgtc tgaggacatc cagaaaatct acaagaacgg 6360

gaccttcaag aaaggcgaca tgttcaacct caacgactgc cacaagctca tcgatttctt 6420

caaggacagc atctcgcgtt acccgaagtg gtctaacgct tacgacttta acttcagcga 6480

gacagaaaag tacaaggata tcgccgggtt ctaccgtgag gttgaggaac agggttacaa 6540

ggttagcttc gagagcgcct ccaagaaaga ggttgacaag ttggtcgaag agggcaagct 6600

ctacatgttc cagatctata acaaggactt ctccgacaag agccacggaa ctcctaacct 6660

ccatacgatg tacttcaagc tgcttttcga cgagaacaac cacgggcaga tcagactttc 6720

tggtggtgct gaactcttca tgcgtagggc ctcactcaag aaagaagagt tggttgttca 6780

cccggccaac tctccaatcg ctaacaagaa tcctgacaac ccgaaaaaga ccaccacgct 6840

gtcttacgac gtctacaagg acaaaaggtt cagcgaggac cagtacgagc ttcatatccc 6900

gatcgctatc aacaagtgcc cgaagaacat cttcaagatc aataccgagg tgagggtgct 6960

gctcaagcac gatgataacc cttacgtgat cggaatcgat cgtggtgaga gaaacctcct 7020

ctacatcgtt gtggtggacg gaaagggaaa catcgtcgag cagtacagcc tgaacgagat 7080

tatcaacaat ttcaacggca tcaggatcaa gaccgactac cactcactcc tcgataagaa 7140

agaaaaagag cgtttcgagg ccaggcagaa ctggacttct atcgaaaaca tcaaagagtt 7200

gaaggccggc tacatctctc aggtggtgca taagatctgc gagctggtgg aaaagtacga 7260

tgctgtgatc gctcttgagg acctcaactc tgggttcaag aacagtagag tgaaggttga 7320

gaagcaggtc taccaaaagt tcgagaagat gctcatcgac aagctcaact acatggtgga 7380

caaaaagagc aacccttgcg ctaccggtgg tgctcttaag ggataccaga tcacgaacaa 7440

gttcgagtcc ttcaagagca tgagcaccca gaacggcttc atcttctata tccctgcttg 7500

gctcaccagc aagatcgatc cttctactgg tttcgtgaac ctgctcaaga ccaagtacac 7560

ctcgatcgcc gacagcaaga agttcatctc gtctttcgac aggatcatgt acgtgccgga 7620

agaggatctt ttcgagttcg ctctcgacta taagaacttc agcaggaccg acgccgacta 7680

cattaagaag tggaagctct actcctacgg gaaccgtatc aggatcttcc gaaatccgaa 7740

gaaaaacaac gtgttcgact gggaagaagt gtgcctcacc tctgcctaca aagaactgtt 7800

caacaagtac ggcatcaact accagcaggg tgatatcagg gctcttttgt gcgagcagag 7860

cgacaaggca ttctacagct cattcatggc cctcatgtct ctcatgctcc agatgaggaa 7920

ctctatcacc ggaaggaccg atgtggactt ccttatctct ccggtcaaga actctgacgg 7980

gatcttctac gacagccgta actatgaggc tcaagagaac gctatcctgc cgaagaatgc 8040

tgatgcaaac ggggcttaca acattgcgag aaaggttctc tgggctatcg ggcagtttaa 8100

gaaagcggaa gatgagaagc tcgacaaggt gaagatcgcc atctccaaca aagagtggct 8160

tgagtacgct cagacctccg ttaagcacaa gaggcctgct gctactaaga aagctggcca 8220

ggccaaaaag aagaagtgag gcgcgccgag ctccaggcct cccagctttc gtccgtatca 8280

tcggtttcga caacgttcgt caagttcaat gcatcagttt cattgcccac acaccagaat 8340

cctactaagt ttgagtatta tggcattgga aaagctgttt tcttctatca tttgttctgc 8400

ttgtaattta ctgtgttctt tcagtttttg ttttcggaca tcaaaatgca aatggatgga 8460

taagagttaa taaatgatat ggtccttttg ttcattctca aattattatt atctgttgtt 8520

tttactttaa tgggttgaat ttaagtaaga aaggaactaa cagtgtgata ttaaggtgca 8580

atgttagaca tataaaacag tctttcacct ctctttggtt atgtcttgaa ttggtttgtt 8640

tcttcactta tctgtgtaat caagtttact atgagtctat gatcaagtaa ttatgcaatc 8700

aagttaagta cagtataggc ttgagctccc taggatcaag cttatcgatg tcgacaggcc 8760

ttaagggcca gatcttgggc ccggtacccg atcagattgt cgtttcccgc cttcggttta 8820

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 8880

agaataatcg gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg 8940

catgccaacc acagggttcc cctcgggagt gcttggcatt ccgtgcgata atgacttctg 9000

ttcaaccacc caaacgtcgg aaagcctgac gacggagcag cattccaaaa agatcccttg 9060

gctcgtctgg gtcggctaga aggtcgagtg ggctgctgtg gcttgatccc tcaacgcggt 9120

cgcggacgta gcgcagcgcc gaaaaatcct cgatcgcaaa tccgacgctg tcgaaaagcg 9180

tgatctgctt gtcgctcttt cggccgacgt cctggccagt catcacgcgc caaagttccg 9240

tcacaggatg atctggcgcg agttgctgga tctcgccttc aatccgggtc tgtggcggga 9300

actccacgaa aatatccgaa cgcagcaaga tatcgcggtg catctcggtc ttgcctgggc 9360

agtcgccgcc gacgccgttg atgtggacgc cgaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 9420

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 9480

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 9540

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 9600

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt 9660

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 9720

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 9780

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 9840

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 9900

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 9960

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 10020

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 10080

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 10140

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccga ttaccgcctt 10200

tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 10260

ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca 10320

ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac 10380

actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct 10440

gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc 10500

tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagggg 10560

tacgtcgagg tcgatccaac ccctccgctg ctatagtgca gtcggcttct gacgttcagt 10620

gcagccgtcg tctgaaaacg acatgtcgca caagtcctaa gttacgcgac aggctgccgc 10680

cctgcccttt tcctggcgtt ttcttgtcgc gtgttttagt cgcataaagt agaatacttg 10740

cgactagaac cggagacatt acgccatgaa caagagcgcc gccgctggcc tgctgggcta 10800

tgcccgcgtc agcaccgacg accaggactt gaccaaccaa cgggccgaac tgcacgcggc 10860

cggctgcacc aagctgtttt ccgagaagat caccggcacc aggcgcgacc gcccggagct 10920

ggccaggatg cttgaccacc tacgccctgg cgacgttgtg acagtgacca ggctagaccg 10980

cctggcccgc agcacccgcg acctactgga cattgccgag cgcatccagg aggccggcgc 11040

gggcctgcgt agcctggcag agccgtgggc cgacaccacc acgccggccg gccgcatggt 11100

gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg 11160

gagcgggcgc gaggccgcca aggcgcgagg cgtgaagttt ggcccccgcc ctaccctcac 11220

cccggcacag atcgcgcacg cccgcgagct gatcgaccag gaaggccgca ccgtgaaaga 11280

ggcggctgca ctgcttggcg tgcatcgctc gaccctgtac cgcgcacttg agcgcagcga 11340

ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga 11400

ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac 11460

caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg 11520

gccgggtacg tgttcgagcc gcccgcgcac gtctcaaccg tgcggctgca tgaaatcctg 11580

gccggtttgt ctgatgccaa gctcgcggcc tggccggcga gcttggccgc tgaagaaacc 11640

gagcgccgcc gtctaaaaag gtgatgtgta tttgagtaaa acagcttgcg tcatgcggtc 11700

gctgcgtata tgatgcgatg agtaaataaa caaatacgca aggggaacgc atgaaggtta 11760

tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc catctagccc 11820

gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg 11880

cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc 11940

cgacgattga ccgcgacgtg aaggccatcg gccggcgcga cttcgtagtg atcgacggag 12000

cgccccaggc ggcggacttg gctgtgtccg cgatcaaggc agccgacttc gtgctgattc 12060

cggtgcagcc aagcccttac gacatatggg ccaccgccga cctggtggag ctggttaagc 12120

agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca 12180

aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc 12240

ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg 12300

ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa 12360

ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac 12420

gctaagtgcc ggccgtccga gcgcacgcag cagcaaggct gcaacgttgg ccagcctggc 12480

agacacgcca gccatgaagc gggtcaactt tcagttgccg gcggaggatc acaccaagct 12540

gaagatgtac gcggtacgcc aaggcaagac cattaccgag ctgctatctg aatacatcgc 12600

gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag 12660

gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg 12720

gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca 12780

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aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggcggcgc aggccgccca 12900

gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg 12960

aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc 13020

caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga 13080

tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg 13140

cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg 13200

catggcgagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc 13260

catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt 13320

tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt 13380

agaaacctgc attcggttaa acaccacgca cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa 13440

gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg tgaagccttg attagccgct acaagatcgt 13500

aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg 13560

cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt gctgacggtt caccccgatt actttttgat 13620

cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga 13680

agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa 13740

gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa 13800

ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg 13860

cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg 13920

ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt ggatagcacg tacattggga acccaaagcc 13980

gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc 14040

acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt 14100

aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac 14160

agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc 14220

ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa 14280

tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg 14340

caccggtggg tatgcctgac gatgcgtgga gaccgaaacc ttgcgctcgt tcgccagcca 14400

ggacagaaat gcctcgactt cgctgctgcc caaggttgcc gggtgacgca caccgtggaa 14460

acggatgaag gcacgaaccc agtggacata agcctgttcg gttcgtaagc tgtaatgcaa 14520

gtagcgtatg cgctcacgca actggtccag aaccttgacc gaacgcagcg gtggtaacgg 14580

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ggcatccaag cagcaagcgc gttacgccgt gggtcgatgt ttgatgttat ggagcagcaa 14700

cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta aacatcatga gggaagcggt 14760

gatcgccgaa gtatcgactc aactatcaga ggtagttggc gtcatcgagc gccatctcga 14820

accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg ctccgcagtg gatggcggcc tgaagccaca 14880

cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac cgtaaggctt gatgaaacaa cgcggcgagc 14940

tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc ttcccctgga gagagcgaga ttctccgcgc 15000

tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga catcattccg tggcgttatc cagctaagcg 15060

cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa tgacattctt gcaggtatct tcgagccagc 15120

cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct gacaaaagca agagaacata gcgttgcctt 15180

ggtaggtcca gcggcggagg aactctttga tccggttcct gaacaggatc tatttgaggc 15240

gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc gccgcccgac tgggctggcg atgagcgaaa 15300

tgtagtgctt acgttgtccc gcatttggta cagcgcagta accggcaaaa tcgcgccgaa 15360

ggatgtcgct gccgactggg caatggagcg cctgccggcc cagtatcagc ccgtcatact 15420

tgaagctaga caggcttatc ttggacaaga agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca 15480

gttggaagaa tttgtccact acgtgaaagg cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg 15540

tctaacaatt cgttcaagcc gacgccgctt cgcggcgcgg cttaactcaa gcgttagatg 15600

cactaagcac ataattgctc acagccaaac tatcaggtca agtctgcttt tattattttt 15660

aagcgtgcat aataagccct acacaaattg ggagatatat catgaaaggc tggctttttc 15720

ttgttatcgc aatagttggc gaagtaatcg caacatagct tgcttggtcg ttccgcgtga 15780

acgtcggctc gattgtacct gcgttcaaat actttgcgat cgtgttgcgc gcctgcccgg 15840

tgcgtcggct gatctcacgg atcgactgct tctctcgcaa cgccatccga cggatgatgt 15900

ttaaaagtcc catgtggatc actccgttgc cccgtcgctc accgtgttgg ggggaaggtg 15960

cacatggctc agttctcaat ggaaattatc tgcctaaccg gctcagttct gcgtagaaac 16020

caacatgcaa gctccaccgg gtgcaaagcg gcagcggcgg caggatatat tcaattgtaa 16080

atggcttcat gtccgggaaa tctacatgga tcagcaatga gtatgatggt caatatggag 16140

aaaaagaaag agtaattacc aatttttttt caattcaaaa atgtagatgt ccgcagcgtt 16200

attataaaat gaaagtacat tttgataaaa cgacaaatta cgatccgtcg tatttatagg 16260

cgaaagcaat aaacaaatta ttctaattcg gaaatcttta tttcgacgtg tctacattca 16320

cgtccaaatg ggggcttaga tgagaaactt cacgatcggc tctagttcga gcgatctagt 16380

aacatagatg acaccgcgcg cgataattta tcctagtttg cgcgctatat tttgttttct 16440

atcgcgtatt aaatgtataa ttgcgggact ctaatcataa aaacccatct cataaataac 16500

gtcatgcatt acatgttaat tattacatgc ttaacgtaat tcaacagaaa ttatatgata 16560

atcatcgcaa gaccggcaac aggattcaat cttaagaaac tttattgcca aatgtttgaa 16620

cgatcgggga aattcgtttc tatgcttcaa ttctgctcta tagatgttct tctagtctta 16680

acttttagaa ggcacaacat ttgaaatgtt ggtaattttt ctgctgggta gtgaaccatt 16740

gtaatttgtg tttgcttata ttatccgttg ggtttctcta tgttatctgt ggggccatat 16800

cccagaactg gttgagtcgg tccaacacct gggtgccaat catgtcgatg gtggggtatg 16860

gt 16862

<210> 24

<211> 2001

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Repair-Template ALS G/T

<400> 24

ggtaggcctg gacctgtttt gattgatctt cctaaagata ttcagcagca attggttgtt 60

cctgattggg ataggccttt taagttgggt gggtatatgt ctaggctgcc aaagtccaag 120

ttttcgacga atgaggttgg acttcttgag cagattgtga ggttgatgag tgagtcgaag 180

aagcctgtct tgtatgtggg aggtgggtgt ttgaattcta gtgaggagtt gaggagattt 240

gttgagttga cagggattcc ggtggctagt actttgatgg ggttggggtc ttacccttgt 300

aatgatgaac tgtctcttca tatgttgggg atgcacggga ctgtttatgc caattatgcg 360

gtggataagg cggatttgtt gcttgctttc ggggttaggt ttgatgatcg tgtgaccggg 420

aagctcgagg cgtttgctag ccgtgctaag attgtgcata ttgatattga ctctgctgag 480

attgggaaga acaagcagcc ccatgtgtcc atttgtgctg atgttaaatt ggcattgcgg 540

ggtatgaata agattctgga gtctagaata gggaagctga atttggattt ctccaagtgg 600

agagaagaat taggtgagca gaagaaggaa ttcccactga gttttaagac atttggggat 660

gcaattcctc cacaatatgc cattcaggtg cttgatgagt tgaccaatgg taatgctatt 720

ataagtactg gtgttgggca gcaccaaatg tgggctgcgc agcattacaa gtacagaaac 780

cctcgccaat ggctgacctc tggtgggttg ggggctatgg ggtttgggct accagccgcc 840

attggagctg cagttgctcg accagatgca gtggttgtcg atattgatgg ggatggcagt 900

tttattatga atgttcaaga gttggctaca attagggtgg aaaatctccc agttaagata 960

atgctgctaa acaatcaaca tttaggtatg gttgtccaat tggaagatag gttctataaa 1020

gctaaccggg cacatacata ccttggaaac ccttccaaat ctgctgatat cttccctgat 1080

atgctcaaat tcgctgaggc atgtgatatt ccttctgccc gtgttagcaa cgtggctgat 1140

ttgagggccg ccattcaaac aatgttggat actccagggc cgtacctgct cgatgtgatt 1200

gtaccgcatc aagagcatgt gttgcctatg attccaagtg gtgccggttt caaggatacc 1260

attacagagg gtgatggaag aacctcttat tgatcggttt aatgacggtt ggaaccattt 1320

aaagagggta agctatatta ctgtatgtat attagtatgt tcctggataa tttagaagct 1380

tttgtctgtt gtcttttgca gtttatgaag ttagtttgct gttgtcatgt tacttgttac 1440

tttaaaaagc tttttgtagt ttttgagcaa ctagtatgga atgctcttcc tgtattgctt 1500

ggaaaattca caaaagtggt ttttcggcta tggatgttgt gttgcatcat gcatatatag 1560

cttgatatac tagttggctt ggtgcatctt taacatatac taatgagact acgacagcaa 1620

ttgccaatta gttggcttga cataattctt agtctgccac tagaaatctt gcttcttttt 1680

tttccctcat ttgttgaaag tccctgttgc gacctgacat gggagcattg gagattgttt 1740

agcaatagca gttgcagtta ggtgactaca gtcatcttcc aaatatgaat actctctgga 1800

ggggaggagg ttttacaaaa tatgagtttt taacacatga gaaacttata ttaaacaagg 1860

ttgagtcacc ccatattttt caaagttgac ttttgtctga tttgggtgac tatgcctgtt 1920

gtatgcaata aactcgatgt acataagact tgtataatcc aatctaaccc ttcctggctg 1980

attatgaaac cgagtcggct a 2001

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'ALS_G/T primer

<400> 25

gttttggatg tagaggatat tcctaga 27

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS_G/T_Rv primer

<400> 26

cagggaagat atcagcagat ttg 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS_G/T_Fw primer

<400> 27

ctacaattag ggtggaaaat ctc 23

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'ALS_G/T primer

<400> 28

ctctagtggt cacctggcat c 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_F4 primer

<400> 29

accactcact cctcgataag 20

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_LbCpf1_R3 primer

<400> 30

tagacctgct tctcaacctt ca 22

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_Ribozyme_F primer

<400> 31

tgcagcggat ccaaattact g 21

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_Ribozyme_R primer

<400> 32

cctggtccca ttcgccat 18

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSeq_tDT_F primer

<400> 33

ttacaagaag ctgtccttcc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 34

gtactgttcc acgatggtgt 20

<210> 35

<211> 2010

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Repair-Template ALS 9bp Insertion

<400> 35

gaatttggat ttctccaagt ggagagaaga attaggtgag cagaagaagg aattcccact 60

gagttttaag acatttgggg atgcaattcc tccacaatat gccattcagg tgcttgatga 120

gttgaccaat ggtaatgcta ttataagtac tggtgttggg cagcaccaaa tgtgggctgc 180

gcagcattac aagtacagaa accctcgcca atggctgacc tctggtgggt tgggggctat 240

ggggtttggg ctaccagccg ccattggagc tgcagttgct cgaccagatg cagtggttgt 300

cgatattgat ggggatggca gttttattat gaatgttcaa gagttggcta caattagggt 360

ggaaaatctc ccagttaaga taatgctgct aaacaatcaa catttaggta tggttgtcca 420

atgggaagat aggttctata aagctaaccg ggcacataca taccttggaa acccttccaa 480

atctgctgat atcttccctg atatgctcaa attcgctgag gcatgtgata ttccttctgc 540

ccgtgttagc aacgtggctg atttgagggc cgccattcaa acaatgttgg atactccagg 600

gccgtacctg ctcgatgtga ttgtaccgca tcaagagcat gtgttgccta tgattccaag 660

tggtgccggt ttcaaggata ccattacaga gggtgatgga agaacctctt attgatcggt 720

ttaatgacgg ttggaaccat ttaaagaggg taagctatat tactgtatgt atattagtat 780

gttcctggat aatttagaag cttttgtctg ttgtcttttg cagtttatga agttagtttg 840

ctgttgtcat gttacttgtt actttaaaaa gctttttgta gtttttgagc aactagtatg 900

gaatgctctt cctgtattgc ttggaaaatt cacaaaagtg gtttttcggc tatggatgtt 960

gtgttgcatc atgcatatat agcttgatat actagttggc tgcactatcg tggtgcatct 1020

ttaacatata ctaatgagac tacgacagca attgccaatt agttggcttg acataattct 1080

tagtctgcca ctagaaatct tgcttctttt ttttccctca tttgttgaaa gtccctgttg 1140

cgacctgaca tgggagcatt ggagattgtt tagcaatagc agttgcagtt aggtgactac 1200

agtcatcttc caaatatgaa tactctctgg aggggaggag gttttacaaa atatgagttt 1260

ttaacacatg agaaacttat attaaacaag gttgagtcac cccatatttt tcaaagttga 1320

cttttgtctg atttgggtga ctatgcctgt tgtatgcaat aaactcgatg tacataagac 1380

ttgtataatc caatctaacc cttcctggct gattatgaaa ccgagtcggc taatttgttg 1440

cttgatcttc atgtgtgagc ctgatgccag gtgaccacta gaggagtacc tttcattgag 1500

atatcgattc ggttaattgg ttcctcatat gggtctcaaa actgaatttt tctcaggctc 1560

tcttctaacc agttgttgaa ttttatgaaa cttcagtcca gttaaaactt tgatcccgga 1620

tcagaatttc tctgagttgt tcttccgcct ctcagttcca ctgttccagt gttcttggtc 1680

ctcaacctgt actctgagct atttctgcaa acacctgaag ttcctgctgc ccttggacaa 1740

atacagaatg cagcattagc atttatttaa gacaagatga atacttgctc ccctgttagt 1800

tatgctaatt ctgcattagt attctttaat tttaattaga tactgcaatc cgtgaactct 1860

gcagtttctt gatctctctc tgtttcaatt tctcctatct tatcgcccat ttctttaggc 1920

tttcgttatc tatcgtctaa ttcaagagta ggtaactagg tacgggataa aactttttca 1980

tgaagaacct atgttcccgt attatgctgt 2010

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'ALS_Insertion primer

<400> 36

gtgctgatgt taaattggca ttgc 24

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS_Insertion_Rv primer

<400> 37

ctagtggcag actaagaatt atg 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ALS_Insertion_Fw primer

<400> 38

gaatgctctt cctgtattgc ttg 23

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'ALS_Insertion primer

<400> 39

cagttcaaca caaaagaagt tgtc 24

<210> 40

<211> 2000

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Repair-Template CYP Deletionsmarker

<400> 40

tagagttttt cgatttacga ttgtggtaaa ttaattgtaa ttgatcggtt gtcttgtagt 60

caagaaatga cgtatgaatc aatttagggc atgttctctt cggcataaaa cagctgaact 120

gaattgaact gaactgaaat gaatagtgat atgtgagagt aaaagtattg tcaagagctg 180

aactgagctg aactgaacgg atctgaactg aactgatcta atctgaacta atctgaactg 240

aactgaactg aattgaactg aaaataagct agggaaaaca gacccttact actattatat 300

aacctcgttt aaatattagg aaattaaaaa aataattata tttctttata ctttattaac 360

ctattgaggt ttttatattg actcccaaat actattttat agatcatgcc atgttaatga 420

gcaaactact ttctcacatc tttataggag aaaaagtaga tcactcacta gcatatcatg 480

accagcgaaa ccaaccaacg ctaatagttt tattgcttcc attagagata agagttaact 540

aataatacca tctttgtgaa attttgatgg attttggaac tttagcaata tatttactgt 600

gtgcactttt tgctaccaaa attttatacc aatggctcaa gtcctactta tacacaacat 660

acaaactccc tcccggccca ccaaggtggc ccttatttgg aaacctcctt caactagggc 720

cacttcccca ccgcgatttc gcctcatttt gtgaaaaata tgggccttta gtctacataa 780

ggcttggtaa tgtggatgcc ataaccacta atgatccaga aatcatacgt gagatcttag 840

ttcgacaaga tgatgtattt gcgtctcgtc cacatacctt agccgcaacc cacttggctt 900

acaatagtgg tgatgtggcc ttggctccaa tgggaccaaa atggaaaaga atgagaagga 960

tatgcatgga gcacttgctc acaactagac gacttgaact tcatagggct gatgaggcac 1020

gacatttggt ccaagacgta ttaactcgtt cccacaaaga taaagttgtt aatttgaggg 1080

aagtgttagg tgcattttct atgaataacg tgactagaat gttgctaggg aagcaatact 1140

ttggggccgg gacggcgggc ccacaagagg ctctagagtt tatgcatata acacatgagt 1200

tgttttggtt actaggcttg atttacttgg gtgattattt gcctttttgg aggtgggttg 1260

atccatatgg atgtgaaaag aaaatgaggg aagttgaaaa aagggtagat gatttccatc 1320

gcaaaattat agaggaacat aggaaggaga agaaaaggaa agaagaaatg ggagtgaatg 1380

agggtgaaat ggattttgta gatattttgt tggctttgcc tggtgaaaat ggaaatgagc 1440

atatggatga tgcagatatt aaagctctaa ttcaggtaat tcatgtataa tttgaatgtg 1500

atcgatacaa agtttgatag aaaacatatt tgcataaata tatggttgcc ctactagacc 1560

caataaaata cataattatt gccttactag ttgaaagttg aaacaaccta gctaccattt 1620

tgttgtgatt atcattagcc aaccaaaatt atttcttgca tccatatatt aatgttgaga 1680

tcagagtcgg catatttaca attacttgta acattttaag caaacaaatt aaaatatttt 1740

ttggcaagtc cattttattg aataatacct atatcttaaa atgaattctt ggtcatgtac 1800

acttgccttt caaggtacca atatttgacc atatgtaatt actattaaca aatttgataa 1860

aatctaataa tatgtaaata tacattcacg cacatattag aaacaaagat cacaaatgat 1920

aatgcaaaat aacttatttg aactaatgtt gtgaagttaa atttggaaca aaaggtatat 1980

ttgtattgcc gaattttaat 2000

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5'CYP_Deletion primer

<400> 41

gtctttacat agcaaaacaa tattgaag 28

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CYP_Deletion_Rv primer

<400> 42

ctaacacttc cctcaaatta acaac 25

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CYP_Deletion_Fw primer

<400> 43

caatagtggt gatgtggcct tgg 23

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3'CYP_Deletion primer

<400> 44

ggtaactagt aaaagtatac tcatc 25

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvCYP703A2_WT_fwd primer

<400> 45

tagacgactt gaactatttg tgag 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvCYP703A2_gst_fwd primer

<400> 46

tagacgactt gaacttcata gggc 24

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvCYP703A2_rev primer

<400> 47

aaagtattgc ttccctagca aca 23

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvALS_WT_fwd primer

<400> 48

actagttggc ttggtgcatc t 21

<210> 49

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvALS_SU_res_fwd primer

<400> 49

actagttggc tgcactatcg tgc 23

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvALS_rev primer

<400> 50

ccaatgctcc catgtcaggt 20

<210> 51

<211> 3759

<212> DNA

<213> Lachnospiraceae bacterium

<400> 51

atggctccta agaagaagag gaaggttagc aagctcgaga agtttaccaa ctgctacagc 60

ctctctaaga ccctcaggtt caaggctatc cctgtgggaa agacccaaga gaatatcgac 120

aacaagaggc tcctcgtcga ggatgagaag agagctgaag attacaaggg cgtgaagaag 180

ctcctcgaca ggtactacct cagcttcatc aacgatgtgc tccacagcat caagctcaag 240

aacctcaaca actacatcag cctcttccgt aagaaaacca ggaccgagaa agagaacaaa 300

gagcttgaga acctcgagat caacctccgt aaagagatcg ccaaggcttt caagggaaac 360

gagggataca agagcctctt caagaaggat attatcgaga caatcctgcc tgagttcctg 420

gacgataagg atgagatcgc tctcgtgaac agcttcaacg gattcactac tgccttcacc 480

ggattcttcg acaacaggga aaacatgttc agcgaagagg ccaagagcac ctctatcgct 540

ttcagatgca tcaacgagaa cctcacgcgt tacatcagca acatggacat cttcgagaag 600

gtggacgcca tcttcgataa gcacgaggtg caagaaatca aagagaagat cctcaacagc 660

gactacgacg tcgaggactt ttttgaaggg gagttcttca acttcgttct cacccaagag 720

ggcatcgacg tgtacaacgc tattatcgga ggattcgtga ccgagtctgg ggagaagatt 780

aagggactca acgagtacat caacctgtac aaccagaaaa cgaagcagaa gctcccgaag 840

ttcaagccgc tctacaagca ggttctctct gatcgtgaga gcctctcatt ttacggtgag 900

ggttacacct ctgacgagga agtgcttgag gttttccgta acaccctcaa caagaacagc 960

gagatcttct cgtccatcaa gaagttggag aaacttttca agaacttcga cgagtacagc 1020

agcgctggga tcttcgttaa gaacggacct gctatcagca ccatcagcaa ggatattttc 1080

ggcgagtgga acgtgatcag ggacaagtgg aatgctgagt acgatgacat ccacctcaag 1140

aagaaggctg tcgtcactga gaagtacgag gatgacaggc gtaagtcgtt caagaagatc 1200

ggctctttca gcctcgagca gcttcaagaa tacgctgatg ctgatctcag cgtggtcgag 1260

aagctcaaag agatcatcat ccagaaggtc gacgagatct acaaggtgta cgggtcctct 1320

gagaagttgt tcgatgctga tttcgtcctc gagaagagtc tgaagaagaa cgacgctgtc 1380

gtcgcgatca tgaaggattt gctcgacagc gtgaagtcct tcgagaacta tatcaaggcc 1440

ttcttcggag agggcaaaga gactaatagg gacgagtctt tctacgggga tttcgtgctc 1500

gcttacgata tcctcctcaa ggtggaccat atctacgacg ccatcagaaa ctacgtgacc 1560

cagaagcctt acagcaagga caagttcaag ttgtactttc agaacccgca gttcatgggc 1620

ggatgggaca aagacaaaga gacagattac agggccacca tcctcaggta cgggtctaag 1680

tactacctgg ccatcatgga caagaaatac gccaagtgcc tccaaaagat cgacaaggat 1740

gacgtgaacg ggaactatga gaagatcaac tacaagctcc ttccgggacc gaacaagatg 1800

cttcctaagg tgttcttcag caagaaatgg atggcctact acaacccgtc tgaggacatc 1860

cagaaaatct acaagaacgg gaccttcaag aaaggcgaca tgttcaacct caacgactgc 1920

cacaagctca tcgatttctt caaggacagc atctcgcgtt acccgaagtg gtctaacgct 1980

tacgacttta acttcagcga gacagaaaag tacaaggata tcgccgggtt ctaccgtgag 2040

gttgaggaac agggttacaa ggttagcttc gagagcgcct ccaagaaaga ggttgacaag 2100

ttggtcgaag agggcaagct ctacatgttc cagatctata acaaggactt ctccgacaag 2160

agccacggaa ctcctaacct ccatacgatg tacttcaagc tgcttttcga cgagaacaac 2220

cacgggcaga tcagactttc tggtggtgct gaactcttca tgcgtagggc ctcactcaag 2280

aaagaagagt tggttgttca cccggccaac tctccaatcg ctaacaagaa tcctgacaac 2340

ccgaaaaaga ccaccacgct gtcttacgac gtctacaagg acaaaaggtt cagcgaggac 2400

cagtacgagc ttcatatccc gatcgctatc aacaagtgcc cgaagaacat cttcaagatc 2460

aataccgagg tgagggtgct gctcaagcac gatgataacc cttacgtgat cggaatcgat 2520

cgtggtgaga gaaacctcct ctacatcgtt gtggtggacg gaaagggaaa catcgtcgag 2580

cagtacagcc tgaacgagat tatcaacaat ttcaacggca tcaggatcaa gaccgactac 2640

cactcactcc tcgataagaa agaaaaagag cgtttcgagg ccaggcagaa ctggacttct 2700

atcgaaaaca tcaaagagtt gaaggccggc tacatctctc aggtggtgca taagatctgc 2760

gagctggtgg aaaagtacga tgctgtgatc gctcttgagg acctcaactc tgggttcaag 2820

aacagtagag tgaaggttga gaagcaggtc taccaaaagt tcgagaagat gctcatcgac 2880

aagctcaact acatggtgga caaaaagagc aacccttgcg ctaccggtgg tgctcttaag 2940

ggataccaga tcacgaacaa gttcgagtcc ttcaagagca tgagcaccca gaacggcttc 3000

atcttctata tccctgcttg gctcaccagc aagatcgatc cttctactgg tttcgtgaac 3060

ctgctcaaga ccaagtacac ctcgatcgcc gacagcaaga agttcatctc gtctttcgac 3120

aggatcatgt acgtgccgga agaggatctt ttcgagttcg ctctcgacta taagaacttc 3180

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gttgaccgtg ttcgccggca ttgccgagtt cgagcgttcc ctaatcatcg accgcacccg 7860

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ggaagtgacg cccaccgagg ccaggcggcg cggtgccttc cgtgaggacg cattgaccga 8100

ggccgacgcc ctggcggccg ccgagaatga acgccaagag gaacaagcat gaaaccgcac 8160

caggacggcc aggacgaacc gtttttcatt accgaagaga tcgaggcgga gatgatcgcg 8220

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tcgctgtact taaccagaaa ggcgggtcag gcaagacgac catcgcaacc catctagccc 8520

gcgccctgca actcgccggg gccgatgttc tgttagtcga ttccgatccc cagggcagtg 8580

cccgcgattg ggcggccgtg cgggaagatc aaccgctaac cgttgtcggc atcgaccgcc 8640

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agcgcattga ggtcacggat ggaaggctac aagcggcctt tgtcgtgtcg cgggcgatca 8880

aaggcacgcg catcggcggt gaggttgccg aggcgctggc cgggtacgag ctgcccattc 8940

ttgagtcccg tatcacgcag cgcgtgagct acccaggcac tgccgccgcc ggcacaaccg 9000

ttcttgaatc agaacccgag ggcgacgctg cccgcgaggt ccaggcgctg gccgctgaaa 9060

ttaaatcaaa actcatttga gttaatgagg taaagagaaa atgagcaaaa gcacaaacac 9120

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gcagctacca gagtaaatga gcaaatgaat aaatgagtag atgaatttta gcggctaaag 9360

gaggcggcat ggaaaatcaa gaacaaccag gcaccgacgc cgtggaatgc cccatgtgtg 9420

gaggaacggg cggttggcca ggcgtaagcg gctgggttgt ctgccggccc tgcaatggca 9480

ctggaacccc caagcccgag gaatcggcgt gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca 9540

aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt ggagaagttg aaggcggcgc aggccgccca 9600

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aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc 9720

caagggcgac gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga 9780

tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg 9840

cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg 9900

catggcgagt gtgtgggatt acgacctggt actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc 9960

catgaaccga taccgggaag ggaagggaga caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt 10020

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ggtatggcca attttttttc aattcaaaaa tgtagatgtc cgcagcgtta ttataaaatg 15000

aaagtacatt ttgataaaac gacaaattac gatccgtcgt atttataggc gaaagcaata 15060

aacaaattat tctaattcgg aaatctttat ttcgacgtgt ctacattcac gtccaaatgg 15120

gggcttagat gagaaacttc acgatcggct ctagaggcca tggcggccgc actagtggat 15180

cccccgggat gcatgaattc aagcttatcg atgtcgacag gccttaaggg ccagatcccc 15240

cgggc 15245

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<211> 9763

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pZFNtDTnptII plasmid

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agcttatcga tgtcgacagg ccttaagggc cagatcttgg gcccggtacc cgatcagatt 60

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ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 900

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 960

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aggaaggccg caccgtgaaa gaggcggctg cactgcttgg cgtgcatcgc tcgaccctgt 2580

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tccgtgagga cgcattgacc gaggccgacg ccctggcggc cgccgagaat gaacgccaag 2700

aggaacaagc atgaaaccgc accaggacgg ccaggacgaa ccgtttttca ttaccgaaga 2760

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caaggggaac gcatgaaggt tatcgctgta cttaaccaga aaggcgggtc aggcaagacg 3060

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gattccgatc cccagggcag tgcccgcgat tgggcggccg tgcgggaaga tcaaccgcta 3180

accgttgtcg gcatcgaccg cccgacgatt gaccgcgacg tgaaggccat cggccggcgc 3240

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agctgctatc tgaatacatc gcgcagctac cagagtaaat gagcaaatga ataaatgagt 3900

agatgaattt tagcggctaa aggaggcggc atggaaaatc aagaacaacc aggcaccgac 3960

gccgtggaat gccccatgtg tggaggaacg ggcggttggc caggcgtaag cggctgggtt 4020

gtctgccggc cctgcaatgg cactggaacc cccaagcccg aggaatcggc gtgagcggtc 4080

gcaaaccatc cggcccggta caaatcggcg cggcgctggg tgatgacctg gtggagaagt 4140

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cgccgtcgat taggaagccg cccaagggcg acgagcaacc agattttttc gttccgatgc 4320

tctatgacgt gggcacccgc gatagtcgca gcatcatgga cgtggccgtt ttccgtctgt 4380

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cggtttccca tctaaccgaa tccatgaacc gataccggga agggaaggga gacaagcccg 4560

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cataactgtc tggccagcgc acagccgaag agctgcaaaa agcgcctacc cttcggtcgc 5460

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aaaaacccat ctcataaata acgtcatgca ttacatgtta attattacat gcttaacgta 7800

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actttattgc caaatgtttg aacgatcggg gaaattcgtt tctatgcttc aattctgctc 7920

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tatgttatct gtggggccat atcccagaac tggttgagtc ggtccaacac ctgggtgcca 8100

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taaaataaca agtcaggtat tatagtccaa gcaaaaacat aaatttattg atgcaagttt 8220

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agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg 8940

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gtctacattc acgtccaaat gggggcttag atgagaaact tcacgatcgg ctctagaggc 9720

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<210> 58

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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<400> 58

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<210> 59

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_Cyp Del

<400> 59

attaaagatg attcacatct atacgtggtt cggttgatca tatag 45

<210> 60

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS In1

<400> 60

attaaagatg attcacatct aggctatgga tgttgtgttg catca 45

<210> 61

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_ALS In2

<400> 61

attaaagatg attcacatct atacgtggtt cggttgatca tatag 45

<210> 62

<211> 1603

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

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aaaaattacg gatatgaata taggcatatc cgtatccgaa ttatccgttt gacagctagc 60

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tgttttaatt aggtatgtat tattgctagt ttgttaatct gcttatctta tgtatgcctt 480

atgtgaatat ctttatcttg ttcatctcat ccgtttagaa gctataaatt tgttgatttg 540

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ttgtgattat ttacatgatt ttgttattta cgtatgtata tatgtagatc tggacttttt 900

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aaaaattacg gatatgaata taggcatatc cgtatccgaa ttatccgttt gacagctagc 60

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cttcaccgcc tcaaacacaa aaataatctt ctacagccta tatatacaac ccccccttct 300

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ctcttctcct cttcattttc aaggtaaatc tctctctctc tctctctctc tgttattcct 420

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<211> 1603

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tatgtcttga attggtttgt ttcttcactt atctgtgtaa tcaagtttac tatgagtcta 1560

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<210> 65

<211> 1603

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crRNA_Cyp_Del expression cassette

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gttgaaagac tcctatcgaa atacgtaacc gcaaacgtgt catagtcaga tcccctcttc 240

cttcaccgcc tcaaacacaa aaataatctt ctacagccta tatatacaac ccccccttct 300

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ctcttctcct cttcattttc aaggtaaatc tctctctctc tctctctctc tgttattcct 420

tgttttaatt aggtatgtat tattgctagt ttgttaatct gcttatctta tgtatgcctt 480

atgtgaatat ctttatcttg ttcatctcat ccgtttagaa gctataaatt tgttgatttg 540

actgtgtatc tacacgtggt tatgtttata tctaatcaga tatgaatttc ttcatattgt 600

tgcgtttgtg tgtaccaatc cgaaatcgtt gatttttttc atttaatcgt gtagctaatt 660

gtacgtatac atatggatct acgtatcaat tgttcatctg tttgtgtttg tatgtataca 720

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ttatatcatt ttttttatta attgtgtata tatatatgtg catagatctg gattacatga 840

ttgtgattat ttacatgatt ttgttattta cgtatgtata tatgtagatc tggacttttt 900

ggagttgttg acttgattgt atttgtgtgt gtatatgtgt gttctgatct tgatatgtta 960

tgtatgtgca gcggatccaa attactgatg agtccgtgag gacgaaacga gtaagctcgt 1020

ctaatttcta ctaagtgtag atatgcacca agccaactag tatatcggcc ggcatggtcc 1080

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tcccagcttt cgtccgtatc atcggtttcg acaacgttcg tcaagttcaa tgcatcagtt 1200

tcattgccca cacaccagaa tcctactaag tttgagtatt atggcattgg aaaagctgtt 1260

ttcttctatc atttgttctg cttgtaattt actgtgttct ttcagttttt gttttcggac 1320

atcaaaatgc aaatggatgg ataagagtta ataaatgata tggtcctttt gttcattctc 1380

aaattattat tatctgttgt ttttacttta atgggttgaa tttaagtaag aaaggaacta 1440

acagtgtgat attaaggtgc aatgttagac atataaaaca gtctttcacc tctctttggt 1500

tatgtcttga attggtttgt ttcttcactt atctgtgtaa tcaagtttac tatgagtcta 1560

tgatcaagta attatgcaat caagttaagt acagtatagg ctt 1603

<210> 66

<211> 5816

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> pUbitDTnptII vector

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gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 360

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ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 720

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ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 840

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aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1020

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gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1140

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<213> Artificial Sequence

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atatgtgcat agatctggat tacatgattg tgattattta catgattttg ttatttacgt 4380

atgtatatat gtagatctgg actttttgga gttgttgact tgattgtatt tgtgtgtgta 4440

tatgtgtgtt ctgatcttga tatgttatgt atgtgcagcg aattcggcgc gccatggctc 4500

ctaagaagaa gaggaaggtt agcaagctcg agaagtttac caactgctac agcctctcta 4560

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accgcccgga gctggccagg atgcttgacc acctacgccc tggcgacgtt gtgacagtga 10980

ccaggctaga ccgcctggcc cgcagcaccc gcgacctact ggacattgcc gagcgcatcc 11040

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<213> Beta vulgaris

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aattatattt ctttatactt tattaaccta ttgaggtttt tatattgact cccaaatact 1380

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aagtagatca ctcactagca tatcatgacc agcgaaacca accaacgcta atagttttat 1500

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ttggaacttt agcaatatat ttactgtgtg cactttttgc taccaaaatt ttataccaat 1620

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gaccaaaatg gaaaagaatg agaaggatat gcatggagca cttgctcaca actagacgac 1980

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<211> 4220

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<400> 76

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aaacatattt gcataaatac atggttaccc tactagaccc aataaaatac ataattattg 2040

ccttgctagt tgaaagttga aacaacctag ctaccatttt gttgtgatta tcattagcca 2100

accaaaacta tttcttgcat ccatatatta atgttgagag tcgccatatt tacaattact 2160

tgtaacattt tgagcaaaca aattaaaata ttttttggca agtccatttt attgaatgat 2220

acctatatct taaaatgaat ccttggttat gtacacttgc ctttcaaggt accaatattt 2280

gaccatatgt aattactatt aacaaatttg ataaaatcta ataatatgta aatatacgtt 2340

cacgcacata ttagaaacaa agatcacaaa tgataatgca aaataactta tttgaactaa 2400

tgttgtgaag ttaaatttgg aacaaaaggt atatttgtat tgccgaattt taatttataa 2460

attacttata acaacaactc aatatgtaaa actgttaaga tggagtgtgg atagaatgag 2520

atgagtatac ttttactagt taccactcga aattgcattt cctcctttgt ttatagttgt 2580

tctaacttct attatcataa ataatttttg gacttatttc aatgtatatt tacaacgtta 2640

attgtttaat tttttaaaaa tacataatgt aaacaaggat ttcatggtca attatacaca 2700

ttatagatat tatcttaaaa aacttactaa tgctcaatta gtgtccataa tataggatat 2760

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gtcataacgc atcttgtttt gaaaaaaaaa gctacacttt cttacaccat aaactgttcc 3600

gttactaaat tcttcttggc ttattttaga attaattttt caattttcct atttacttat 3660

aacacaagat aagaaaatcg actaacaata tttcacaaca ttatatcttg atagttcgtt 3720

gaaattaata attttcaata atttcaaaac gcaaaaagct tctttgttcg gataaattca 3780

cgtcattttc aataaaatcg caaaatcttc ccttgccatc aaggaacaaa tttttcacat 3840

caaaactctt cttccaaaaa gtatacttct ccattgatta tgtaaaagag tttgcatgtt 3900

ctaatccatt agtatgtatt tttcggataa gaagttgtat tacaagctta aataaagata 3960

taaacttagt taaatatcga ccaatccaca atatgtatct tcatatgtgt ccatcagcgc 4020

ctaaccttga gatgtagatc atctaaagca cattaacatg gcgtactcct cctgttcaaa 4080

tcagggttgt ttgaaaccaa acttctccaa aatacttcct cagtaatgaa gagaaaaact 4140

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<211> 4211

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvCYP703A2_gst including artificial InDel marker allele

<400> 77

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ctcctcaaaa gtgtgtaaaa atccgacaca cgagtagaat gggattgaag tgggtcaaga 120

tctgaaacca atgggtcaat gccacaaaat aaggtaaggt ttctcgcagt agcaaaaaaa 180

taaagttaag ttgagagaaa aattatgaat agttgtttct cgtgaagagt tgtatacaaa 240

aaaagtctaa tttgatacat tttcttttac atttataaag gattgaccaa tcatccaaat 300

taccaaatat ttaggatata aatctttcag attacaaccc atatatgata cactaaattt 360

tacatgaggc aatggaggat ttgcatgaat atcgaggaga gaaaaaatta gttacaaaac 420

ttgcataatt tatccaaacc aaatcaagtc aagaaacaac gaacaatatt atcattagta 480

ctataagtat atattatagg cttagagcaa agccctaact accacactgc acacaaatga 540

taactagtaa gagaggaaaa tacaaattta agattcaaca tagcaaatta ttcatgattc 600

atgattcatg attcatgatt catgattcac gaacatcaag aatggtatag ctgataaagg 660

acaatttaaa cataagtgta aagctcgcac atcatcaatt atattcgcat actactagac 720

caatctttac ttagtacatg tgttagtaca tgtgttactt catatcagat gtattgattg 780

ttgccaatga catatcatgt tcacttaatc ttagggccat ttaattataa catggagaat 840

aatacaactt aaaattatgt ggtggctatc atctcatttt ctagataatt aaacctttat 900

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aattatattt ctttatactt tattaaccta ttatacaata gtggtgatgt ggccttggct 1380

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ttgggtgatt atttgccttt ttggaggtgg gttgatccat atggatgtga aaagaaaatg 1740

agggaagttg aaaaaagggt agatgatttc catcgcaaaa ttatagagga acataggaag 1800

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ttaaaatgaa tccttggtta tgtacacttg cctttcaagg taccaatatt tgaccatatg 2280

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gagaagatgt cctggggccc cacttggggt ggtgtttgtg ttgatgggat tggctacact 3240

ttttcatgca tttgattggt taccacctga tggaatgaag gcagaagaaa ttgatactaa 3300

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catcttgttt tgaaaaaaaa agctacactt tcttacacca taaactgttc cgttactaaa 3600

ttcttcttgg cttattttag aattaatttt tcaattttcc tatttactta taacacaaga 3660

taagaaaatc gactaacaat atttcacaac attatatctt gatagttcgt tgaaattaat 3720

aattttcaat aatttcaaaa cgcaaaaagc ttctttgttc ggataaattc acgtcatttt 3780

caataaaatc gcaaaatctt cccttgccat caaggaacaa atttttcaca tcaaaactct 3840

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ttaaatatcg accaatccac aatatgtatc ttcatatgtg tccatcagcg cctaaccttg 4020

agatgtagat catctaaagc acattaacat ggcgtactcc tcctgttcaa atcagggttg 4080

tttgaaacca aacttctcca aaatacttcc tcagtaatga agagaaaaac tcacattctg 4140

aaaaacatca acatcatggt tctatggtct agtggttatg acactggact ctgaatccag 4200

taacccgagt t 4211

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<211> 3252

<212> DNA

<213> Beta vulgaris

<400> 78

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attaaaacac aaactcaagc accttcttct ccagctattg aagattcatc tttcgtttct 240

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ctcacacgct ctaaaaccat ccgcaatgtc ctccctcgcc atgaacaagg cggggttttc 420

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ccttttaagt tgggtgggta tatgtctagg ctgccaaagt ccaagttttc gacgaatgag 840

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cttcatatgt tggggatgca cgggactgtt tatgccaatt atgcggtgga taaggcggat 1080

ttgttgcttg ctttcggggt taggtttgat gatcgtgtga ccgggaagct cgaggcgttt 1140

gctagccgtg ctaagattgt gcatattgat attgactctg ctgagattgg gaagaacaag 1200

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ctggagtcta gaatagggaa gctgaatttg gatttctcca agtggagaga agaattaggt 1320

gagcagaaga aggaattccc actgagtttt aagacatttg gggatgcaat tcctccacaa 1380

tatgccattc aggtgcttga tgagttgacc aatggtaatg ctattataag tactggtgtt 1440

gggcagcacc aaatgtgggc tgcgcagcat tacaagtaca gaaaccctcg ccaatggctg 1500

acctctggtg ggttgggggc tatggggttt gggctaccag ccgccattgg agctgcagtt 1560

gctcgaccag atgcagtggt tgtcgatatt gatggggatg gcagttttat tatgaatgtt 1620

caagagttgg ctacaattag ggtggaaaat ctcccagtta agataatgct gctaaacaat 1680

caacatttag gtatggttgt ccaatgggaa gataggttct ataaagctaa ccgggcacat 1740

acataccttg gaaacccttc caaatctgct gatatcttcc ctgatatgct caaattcgct 1800

gaggcatgtg atattccttc tgcccgtgtt agcaacgtgg ctgatttgag ggccgccatt 1860

caaacaatgt tggatactcc agggccgtac ctgctcgatg tgattgtacc gcatcaagag 1920

catgtgttgc ctatgattcc aagtggtgcc ggtttcaagg ataccattac agagggtgat 1980

ggaagaacct cttattgatc ggtttaatga cggttggaac catttaaaga gggtaagcta 2040

tattactgta tgtatattag tatgttcctg gataatttag aagcttttgt ctgttgtctt 2100

ttgcagttta tgaagttagt ttgctgttgt catgttactt gttactttaa aaagcttttt 2160

gtagtttttg agcaactagt atggaatgct cttcctgtat tgcttggaaa attcacaaaa 2220

gtggtttttc ggctatggat gttgtgttgc atcatgcata tatagcttga tatactagtt 2280

ggcttggtgc atctttaaca tatactaatg agactacgac agcaattgcc aattagttgg 2340

cttgacataa ttcttagtct gccactagaa atcttgcttc ttttttttcc ctcatttgtt 2400

gaaagtccct gttgcgacct gacatgggag cattggagat tgtttagcaa tagcagttgc 2460

agttaggtga ctacagtcat cttccaaata tgaatactct ctggagggga ggaggtttta 2520

caaaatatga gtttttaaca catgagaaac ttatattaaa caaggttgag tcaccccata 2580

tttttcaaag ttgacttttg tctgatttgg gtgactatgc ctgttgtatg caataaactc 2640

gatgtacata agacttgtat aatccaatct aacccttcct ggctgattat gaaaccgagt 2700

cggctaattt gttgcttgat cttcatgtgt gagcctgatg ccaggtgacc actagaggag 2760

tacctttcat tgagatatcg attcggttaa ttggttcctc atatgggtct caaaactgaa 2820

tttttctcag gctctcttct aaccagttgt tgaattttat gaaacttcag tccagttaaa 2880

actttgatcc cggatcagaa tttctctgag ttgttcttcc gcctctcagt tccactgttc 2940

cagtgttctt ggtcctcaac ctgtactctg agctatttct gcaaacacct gaagttcctg 3000

ctgcccttgg acaaatacag aatgcagcat tagcatttat ttaagacaag atgaatactt 3060

gctcccctgt tagttatgct aattctgcat tagtattctt taattttaat tagatactgc 3120

aatccgtgaa ctctgcagtt tcttgatctc tctctgtttc aatttctcct atcttatcgc 3180

ccatttcttt aggctttcgt tatctatcgt ctaattcaag agtaggtaac taggtacggg 3240

ataaaacttt tt 3252

<210> 79

<211> 3252

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvALS_SU_res: mutated BvALS W569L

<400> 79

atggcggcta ccttcacaaa cccaacattt tccccttcct caactccatt aaccaaaacc 60

ctaaaatccc aatcttccat ctcttcaacc ctcccctttt ccacccctcc caaaacccca 120

actccactct ttcaccgtcc cctccaaatc tcatcctccc aatcccacaa atcatccgcc 180

attaaaacac aaactcaagc accttcttct ccagctattg aagattcatc tttcgtttct 240

cgatttggcc ctgatgaacc cagaaaaggg tccgatgtcc tcgttgaagc tcttgagcgt 300

gaaggtgtta ccaatgtgtt tgcttaccct ggtggtgcat ctatggaaat ccaccaagct 360

ctcacacgct ctaaaaccat ccgcaatgtc ctccctcgcc atgaacaagg cggggttttc 420

gccgccgagg gatatgctag agctactgga aaggttggtg tctgcattgc gacttctggt 480

cctggtgcta ccaacctcgt atcaggtctt gctgacgctc tccttgattc tgtccctctt 540

gttgccatca ctggccaagt tccacgccgt atgattggca ctgatgcttt tcaggagact 600

ccaattgttg aggtgacaag gtctattact aagcataatt atttagtttt ggatgtagag 660

gatattccta gaattgttaa ggaagccttt tttttagcta attctggtag gcctggacct 720

gttttgattg atcttcctaa agatattcag cagcaattgg ttgttcctga ttgggatagg 780

ccttttaagt tgggtgggta tatgtctagg ctgccaaagt ccaagttttc gacgaatgag 840

gttggacttc ttgagcagat tgtgaggttg atgagtgagt cgaagaagcc tgtcttgtat 900

gtgggaggtg ggtgtttgaa ttctagtgag gagttgagga gatttgttga gttgacaggg 960

attccggtgg ctagtacttt gatggggttg gggtcttacc cttgtaatga tgaactgtct 1020

cttcatatgt tggggatgca cgggactgtt tatgccaatt atgcggtgga taaggcggat 1080

ttgttgcttg ctttcggggt taggtttgat gatcgtgtga ccgggaagct cgaggcgttt 1140

gctagccgtg ctaagattgt gcatattgat attgactctg ctgagattgg gaagaacaag 1200

cagccccatg tgtccatttg tgctgatgtt aaattggcat tgcggggtat gaataagatt 1260

ctggagtcta gaatagggaa gctgaatttg gatttctcca agtggagaga agaattaggt 1320

gagcagaaga aggaattccc actgagtttt aagacatttg gggatgcaat tcctccacaa 1380

tatgccattc aggtgcttga tgagttgacc aatggtaatg ctattataag tactggtgtt 1440

gggcagcacc aaatgtgggc tgcgcagcat tacaagtaca gaaaccctcg ccaatggctg 1500

acctctggtg ggttgggggc tatggggttt gggctaccag ccgccattgg agctgcagtt 1560

gctcgaccag atgcagtggt tgtcgatatt gatggggatg gcagttttat tatgaatgtt 1620

caagagttgg ctacaattag ggtggaaaat ctcccagtta agataatgct gctaaacaat 1680

caacatttag gtatggttgt ccaattggaa gataggttct ataaagctaa ccgggcacat 1740

acataccttg gaaacccttc caaatctgct gatatcttcc ctgatatgct caaattcgct 1800

gaggcatgtg atattccttc tgcccgtgtt agcaacgtgg ctgatttgag ggccgccatt 1860

caaacaatgt tggatactcc agggccgtac ctgctcgatg tgattgtacc gcatcaagag 1920

catgtgttgc ctatgattcc aagtggtgcc ggtttcaagg ataccattac agagggtgat 1980

ggaagaacct cttattgatc ggtttaatga cggttggaac catttaaaga gggtaagcta 2040

tattactgta tgtatattag tatgttcctg gataatttag aagcttttgt ctgttgtctt 2100

ttgcagttta tgaagttagt ttgctgttgt catgttactt gttactttaa aaagcttttt 2160

gtagtttttg agcaactagt atggaatgct cttcctgtat tgcttggaaa attcacaaaa 2220

gtggtttttc ggctatggat gttgtgttgc atcatgcata tatagcttga tatactagtt 2280

ggcttggtgc atctttaaca tatactaatg agactacgac agcaattgcc aattagttgg 2340

cttgacataa ttcttagtct gccactagaa atcttgcttc ttttttttcc ctcatttgtt 2400

gaaagtccct gttgcgacct gacatgggag cattggagat tgtttagcaa tagcagttgc 2460

agttaggtga ctacagtcat cttccaaata tgaatactct ctggagggga ggaggtttta 2520

caaaatatga gtttttaaca catgagaaac ttatattaaa caaggttgag tcaccccata 2580

tttttcaaag ttgacttttg tctgatttgg gtgactatgc ctgttgtatg caataaactc 2640

gatgtacata agacttgtat aatccaatct aacccttcct ggctgattat gaaaccgagt 2700

cggctaattt gttgcttgat cttcatgtgt gagcctgatg ccaggtgacc actagaggag 2760

tacctttcat tgagatatcg attcggttaa ttggttcctc atatgggtct caaaactgaa 2820

tttttctcag gctctcttct aaccagttgt tgaattttat gaaacttcag tccagttaaa 2880

actttgatcc cggatcagaa tttctctgag ttgttcttcc gcctctcagt tccactgttc 2940

cagtgttctt ggtcctcaac ctgtactctg agctatttct gcaaacacct gaagttcctg 3000

ctgcccttgg acaaatacag aatgcagcat tagcatttat ttaagacaag atgaatactt 3060

gctcccctgt tagttatgct aattctgcat tagtattctt taattttaat tagatactgc 3120

aatccgtgaa ctctgcagtt tcttgatctc tctctgtttc aatttctcct atcttatcgc 3180

ccatttcttt aggctttcgt tatctatcgt ctaattcaag agtaggtaac taggtacggg 3240

ataaaacttt tt 3252

<210> 80

<211> 3261

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> BvALS_SU_res including artifical InDel marker allele

<400> 80

atggcggcta ccttcacaaa cccaacattt tccccttcct caactccatt aaccaaaacc 60

ctaaaatccc aatcttccat ctcttcaacc ctcccctttt ccacccctcc caaaacccca 120

actccactct ttcaccgtcc cctccaaatc tcatcctccc aatcccacaa atcatccgcc 180

attaaaacac aaactcaagc accttcttct ccagctattg aagattcatc tttcgtttct 240

cgatttggcc ctgatgaacc cagaaaaggg tccgatgtcc tcgttgaagc tcttgagcgt 300

gaaggtgtta ccaatgtgtt tgcttaccct ggtggtgcat ctatggaaat ccaccaagct 360

ctcacacgct ctaaaaccat ccgcaatgtc ctccctcgcc atgaacaagg cggggttttc 420

gccgccgagg gatatgctag agctactgga aaggttggtg tctgcattgc gacttctggt 480

cctggtgcta ccaacctcgt atcaggtctt gctgacgctc tccttgattc tgtccctctt 540

gttgccatca ctggccaagt tccacgccgt atgattggca ctgatgcttt tcaggagact 600

ccaattgttg aggtgacaag gtctattact aagcataatt atttagtttt ggatgtagag 660

gatattccta gaattgttaa ggaagccttt tttttagcta attctggtag gcctggacct 720

gttttgattg atcttcctaa agatattcag cagcaattgg ttgttcctga ttgggatagg 780

ccttttaagt tgggtgggta tatgtctagg ctgccaaagt ccaagttttc gacgaatgag 840

gttggacttc ttgagcagat tgtgaggttg atgagtgagt cgaagaagcc tgtcttgtat 900

gtgggaggtg ggtgtttgaa ttctagtgag gagttgagga gatttgttga gttgacaggg 960

attccggtgg ctagtacttt gatggggttg gggtcttacc cttgtaatga tgaactgtct 1020

cttcatatgt tggggatgca cgggactgtt tatgccaatt atgcggtgga taaggcggat 1080

ttgttgcttg ctttcggggt taggtttgat gatcgtgtga ccgggaagct cgaggcgttt 1140

gctagccgtg ctaagattgt gcatattgat attgactctg ctgagattgg gaagaacaag 1200

cagccccatg tgtccatttg tgctgatgtt aaattggcat tgcggggtat gaataagatt 1260

ctggagtcta gaatagggaa gctgaatttg gatttctcca agtggagaga agaattaggt 1320

gagcagaaga aggaattccc actgagtttt aagacatttg gggatgcaat tcctccacaa 1380

tatgccattc aggtgcttga tgagttgacc aatggtaatg ctattataag tactggtgtt 1440

gggcagcacc aaatgtgggc tgcgcagcat tacaagtaca gaaaccctcg ccaatggctg 1500

acctctggtg ggttgggggc tatggggttt gggctaccag ccgccattgg agctgcagtt 1560

gctcgaccag atgcagtggt tgtcgatatt gatggggatg gcagttttat tatgaatgtt 1620

caagagttgg ctacaattag ggtggaaaat ctcccagtta agataatgct gctaaacaat 1680

caacatttag gtatggttgt ccaattggaa gataggttct ataaagctaa ccgggcacat 1740

acataccttg gaaacccttc caaatctgct gatatcttcc ctgatatgct caaattcgct 1800

gaggcatgtg atattccttc tgcccgtgtt agcaacgtgg ctgatttgag ggccgccatt 1860

caaacaatgt tggatactcc agggccgtac ctgctcgatg tgattgtacc gcatcaagag 1920

catgtgttgc ctatgattcc aagtggtgcc ggtttcaagg ataccattac agagggtgat 1980

ggaagaacct cttattgatc ggtttaatga cggttggaac catttaaaga gggtaagcta 2040

tattactgta tgtatattag tatgttcctg gataatttag aagcttttgt ctgttgtctt 2100

ttgcagttta tgaagttagt ttgctgttgt catgttactt gttactttaa aaagcttttt 2160

gtagtttttg agcaactagt atggaatgct cttcctgtat tgcttggaaa attcacaaaa 2220

gtggtttttc ggctatggat gttgtgttgc atcatgcata tatagcttga tatactagtt 2280

ggctgcacta tcgtggtgca tctttaacat atactaatga gactacgaca gcaattgcca 2340

attagttggc ttgacataat tcttagtctg ccactagaaa tcttgcttct tttttttccc 2400

tcatttgttg aaagtccctg ttgcgacctg acatgggagc attggagatt gtttagcaat 2460

agcagttgca gttaggtgac tacagtcatc ttccaaatat gaatactctc tggaggggag 2520

gaggttttac aaaatatgag tttttaacac atgagaaact tatattaaac aaggttgagt 2580

caccccatat ttttcaaagt tgacttttgt ctgatttggg tgactatgcc tgttgtatgc 2640

aataaactcg atgtacataa gacttgtata atccaatcta acccttcctg gctgattatg 2700

aaaccgagtc ggctaatttg ttgcttgatc ttcatgtgtg agcctgatgc caggtgacca 2760

ctagaggagt acctttcatt gagatatcga ttcggttaat tggttcctca tatgggtctc 2820

aaaactgaat ttttctcagg ctctcttcta accagttgtt gaattttatg aaacttcagt 2880

ccagttaaaa ctttgatccc ggatcagaat ttctctgagt tgttcttccg cctctcagtt 2940

ccactgttcc agtgttcttg gtcctcaacc tgtactctga gctatttctg caaacacctg 3000

aagttcctgc tgcccttgga caaatacaga atgcagcatt agcatttatt taagacaaga 3060

tgaatacttg ctcccctgtt agttatgcta attctgcatt agtattcttt aattttaatt 3120

agatactgca atccgtgaac tctgcagttt cttgatctct ctctgtttca atttctccta 3180

tcttatcgcc catttcttta ggctttcgtt atctatcgtc taattcaaga gtaggtaact 3240

aggtacggga taaaactttt t 3261