一种快速检测贝莱斯芽胞杆菌的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测贝莱斯芽胞杆菌的方法及其应用。

背景技术

利用有益微生物来防治植物病害具有绿色、无污染等优点，也是目前研究的热点。生防芽胞杆菌在土壤中广泛存在，因具有抗逆性强、易分离等特点，成为目前应用最为广泛的有益微生物。生防芽胞杆菌在病害防治方面也广有报道，但有关芽胞杆菌的检测方面研究较少。传统的生防菌检测主要是通过平板检测法和选择性培养基，不仅耗时耗力，检测周期较长，而且无法对自然环境中的有益微生物进行快速检测。

芽胞杆菌种类多样，包括枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、贝莱斯芽胞杆菌、蜡样芽孢杆菌等。贝莱斯芽胞杆菌是近年来新命名的、分离于解淀粉芽胞杆菌中一类芽胞杆菌，具有巨大的应用前景。贝莱斯芽胞杆菌与解淀粉芽胞杆菌极为相近，但仅凭单个保守基因序列难以区分，目前主要通过多基因联合构建系统发育树的方法进行鉴定。

发明内容

本发明的目的为特异检测贝莱斯芽胞杆菌。

本发明首先保护特异引物对，包括引物F和引物R；

所述引物F可为如下a1)或a2)：

a1)SEQ ID NO:2所示的单链DNA分子；

a2)将SEQ ID NO:2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO:2具有相同功能的DNA分子；

所述引物R可为如下a3)或a4)：

a3)SEQ ID NO:3所示的单链DNA分子；

a4)将SEQ ID NO:3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO:3具有相同功能的DNA分子。

所述特异引物对具体可由所述引物F和所述引物R组成。

本发明还保护上述任一所述特异引物对的应用，可为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)或b6)：

b1)检测贝莱斯芽胞杆菌；

b2)鉴定待测菌是否为贝莱斯芽胞杆菌；

b3)评价待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力；

b4)制备用于检测贝莱斯芽胞杆菌的试剂盒；

b5)制备用于鉴定待测菌是否为贝莱斯芽胞杆菌的试剂盒；

b6)制备用于评价待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力的试剂盒。

本发明还保护一种试剂盒，包括上述任一所述特异引物对。

本发明还保护所述试剂盒的应用，可为b1)或b2)或b3)：

b1)检测贝莱斯芽胞杆菌；

b2)鉴定待测菌是否为贝莱斯芽胞杆菌；

b3)评价待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将上述任一所述特异引物对中的各引物分别单独包装的步骤。

本发明还保护鉴定待测菌是否为贝莱斯芽胞杆菌的方法。

本发明所保护的鉴定待测菌是否为贝莱斯芽胞杆菌的方法，具体可为方法Q1)或方法Q2)。

所述方法Q1)为：以待测菌的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有大小为193bp的DNA片段，则待测菌为或疑似为贝莱斯芽胞杆菌；如果PCR扩增产物中不含有大小为193bp的DNA片段，则待测菌不为或疑似不为贝莱斯芽胞杆菌。

所述方法Q2)为：以待测菌的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段，则待测菌为或疑似为贝莱斯芽胞杆菌；如果PCR扩增产物中不含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段，则待测菌不为或疑似不为贝莱斯芽胞杆菌。

本发明还保护检测待测物质是否含有贝莱斯芽胞杆菌的方法。

本发明所保护的检测待测物质是否含有贝莱斯芽胞杆菌的方法，具体可为方法R1)或方法R2)。

所述方法R1)为：以待测物质的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有大小为193bp的DNA片段，则待测物质含有或疑似含有贝莱斯芽胞杆菌；如果PCR扩增产物中不含有大小为193bp的DNA片段，则待测物质不含有或疑似不含有贝莱斯芽胞杆菌。

所述方法R2)为：以待测物质的基因组DNA为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段，则待测物质为含有或疑似含有贝莱斯芽胞杆菌；如果PCR扩增产物中不含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段，则待测物质不含有或疑似不含有贝莱斯芽胞杆菌。

本发明还保护评价待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力的方法。

本发明所保护的评价待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力的方法，具体可为方法S1)或方法S2)。

所述方法S1)为：向待测土壤中接种贝莱斯芽胞杆菌，静置培养；之后提取培养后的待测土壤的基因组DNA并以其作为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增；PCR扩增产物中大小为193bp的DNA片段的含量越多，则待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力越强。

所述方法S2)为：向待测土壤中接种贝莱斯芽胞杆菌，静置培养；之后提取培养后的待测土壤的基因组DNA并以其作为模板，采用上述任一所述特异引物对进行PCR扩增；PCR扩增产物中含有核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA片段的含量越多，则待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力越强。

上述任一所述的方法中，进行PCR扩增时，退火温度可为53℃-56℃(如56℃、55.8℃、54.4℃、53.4℃或53℃)。

上述任一所述贝莱斯芽胞杆菌可为贝莱斯芽胞杆菌ZF2、贝莱斯芽胞杆菌FZB42、贝莱斯芽胞杆菌ZF128和贝莱斯芽胞杆菌ZF50中的至少一种。

实验证明，采用本发明提供的特异引物对可以检测贝莱斯芽胞杆菌，不仅灵敏度高(检测最低浓度为0.1fg/μL，最低拷贝数为474copies/μL)，而且特异性好。该特异引物对还可用于评价待测土壤中贝莱斯芽胞杆菌的定殖能力，即对贝莱斯芽胞杆菌在土壤中的定殖动态进行监测；这为探索贝莱斯芽胞杆菌在土壤中的持效期以及在病害防治过程中的有效期限提供技术条件，对土壤有益微生物中贝莱斯芽胞杆菌的含量进行预测，为从土壤中分离贝莱斯芽胞杆菌提供方向。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为特异引物对普通PCR筛选。

图2为PCR扩增退火温度筛选。

图3为特异引物对17的特异性PCR验证。

图4为特异引物对17的特异性qPCR验证。

图5为不同浓度阳性质粒溶液的qPCR扩增结果。

图6基于阳性质粒浓度绘制的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

贝莱斯芽胞杆菌ZF2已在文献“赵昱榕，李磊，谢学文，石延霞，柴阿丽，孙广玉，李宝聚.贝莱斯芽胞杆菌ZF2对多主棒孢病菌防治效果[J].中国生物防治学报，2019，35(02)：217-225.”中公开。

贝莱斯芽胞杆菌FZB42已在文献“Fan B，Wang C，Song X，et al.Corrigendum:Bacillus velezensis FZB42 in 2018：The Gram-Positive Model Strain for PlantGrowth Promotion and Biocontrol[J].Frontiers in Microbiology，2019，10:1279.”中公开。

解淀粉芽胞杆菌ZF75已在文献“李磊，赵昱榕，郑斐，石延霞，柴阿丽，谢学文，李宝聚.芹菜软腐病拮抗芽胞杆菌筛选及防治效果[J].中国生物防治学报，2020，36(03):388-395.”中公开。

枯草芽胞杆菌ZF161已在文献“李新宇，李磊，陈利达，石延霞，柴阿丽，谢学文，李宝聚.番茄匍柄霉叶斑病拮抗细菌的筛选与鉴定[J].园艺学报，2020，47(04):741-748.”中公开。

多粘类芽胞杆菌ZF129已在文献“李磊，赵昱榕，郑斐，石延霞，柴阿丽，谢学文，李宝聚.马铃薯黑痣病生防菌的筛选及防治效果[J/OL].植物病理学报:1-6[2020-12-23].https://doi.org/10.13926/j.cnki.apps.000357.”中公开。

贝莱斯芽胞杆菌ZF128已在文献“许帅，谢学文，张昀，石延霞，柴阿丽，李磊，李宝聚.马铃薯枯萎病生防芽胞杆菌筛选及生防效果研究[J].中国生物防治学报，2020，36(05):761-770.”中公开。

贝莱斯芽胞杆菌ZF50已在文献“谢学文，赵昱榕，孙雪莹，石延霞，柴阿丽，李磊，李宝聚.番茄疫霉根腐病生防菌的分离鉴定及其防治效果[J].植物病理学报,2020,50(05):610-617.”中公开。

解淀粉芽胞杆菌ZF57已在文献“李新宇，李磊，石延霞，柴阿丽，谢学文，李宝聚.黄瓜棒孢叶斑病拮抗细菌的筛选、鉴定及防治效果[J].植物保护学报,2020,47(03):620-627.”中公开。

解淀粉芽胞杆菌DSM 7已在文献“Christian R，Jochen B，Xiaohua C，Oleg R，Rainer B(2011)Genome sequence of B.amyloliquefaciens type strain DSM7(T)reveals differences to plant-associated B.amyloliquefaciens FZB42.JBiotechnol 155:78-85.https://doi.org10.1016/j.jbiotec.2011.01.006.Epub2011Jan 22.”中公开。

密执安棒杆菌密执安亚种(Clavibatermichiganensis subsp.michiganensis)已在文献“李焕玲，石延霞，谢学文，李宝聚.番茄溃疡病的发生规律与防治技术.中国蔬菜2011，23:24-27.”中公开。

丁香假单胞番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato)已在文献“柴阿丽，帕提古丽，郭威涛，石延霞，谢学文，席先梅，李宝聚.番茄细菌性斑点病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].园艺学报，2019，46(01):182-192.”中公开。

野油菜黄单胞野油菜变种(Xanthomonas campestris pv.campestris)已在文献“张扬，李金萍，周慧敏，李宝聚.十字花科蔬菜细菌性黑腐病的发生规律及防治.中国蔬菜2011，17:23-25.”中公开。

丁香假单胞流泪致病变种(Pseudomonas syringae pv.lachryrnans)已在文献“李焕玲，李宝聚.李宝聚博士诊病手记(五十三)黄瓜细菌性角斑病的症状多样性与综合防治[J].中国蔬菜，2012(21):23-25.”中公开。

密执安棒形杆菌环腐亚种(Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus)已在文献“马海艳，张家森，王丽，高中强，余宏军，蒋卫杰.蒋卫杰博士:聚焦生产一线(十四)滕州市早春拱棚马铃薯高效栽培技术.中国蔬菜2015，(08):70-73.”中公开。

实施例1、用于扩增贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)的特异引物对的筛选

一、用于扩增贝莱斯芽胞杆菌的特异引物对的设计和合成

根据贝莱斯芽胞杆菌ZF2与贝莱斯芽胞杆菌FZB42(模式菌株)、解淀粉芽胞杆菌DSM7、枯草芽胞杆菌168的保守基因序列、鞭毛蛋白合成基因序列的核苷酸比对结果，以及基于贝莱斯芽胞杆菌ZF2特有基因的核苷酸序列，设计并人工合成用于扩增贝莱斯芽胞杆菌的特异引物对。具体步骤如下：

1、从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分别下载贝莱斯芽胞杆菌ZF2(CP032154.1)、贝莱斯芽胞杆菌FZB42(CP000560.1)、解淀粉芽胞杆菌DSM7(FN597644.1)和枯草芽胞杆菌168(AL009126.3)的16S rRNA、atpD、galE、gap、gyrB、metC、pdhA、pgk、rho、rpoD等保守基因核苷酸序列，以及鞭毛蛋白合成基因fliC的核苷酸序列，以及经贝莱斯芽胞杆菌ZF2、贝莱斯芽胞杆菌FZB42、解淀粉芽胞杆菌DSM7和枯草芽胞杆菌168比较基因组分析确定的27个贝莱斯芽胞杆菌ZF2特有基因的核苷酸序列。

2、采用DNAMAN软件对不同菌株同一基因的核苷酸序列进行比对，在序列比对一致率较低区域，根据贝莱斯芽胞杆菌ZF2对应基因序列设计特异引物对，另外根据贝莱斯芽胞杆菌ZF2特有基因序列设计特异引物对。

经DNAMAN软件序列比对，仅在galE、gyrB、metC、pdhA、pgk、fliC基因序列比对中发现核苷酸序列一致率相对较低(低于95％)，其它保守基因在四个菌株中核苷酸序列一致率均大于98％。因此，分别根据贝莱斯芽胞杆菌ZF2 galE、gyrB、metC、pdhA、pgk、fliC基因的核苷酸序列和12个贝莱斯芽胞杆菌ZF2特有基因序列，依次设计并由北京博迈德生物技术有限公司合成18个特异引物对。

组成18个特异引物对的引物序列、用于扩增的基因名称和扩增大小见表1。

表1扩增基因及对应引物序列

二、用于扩增贝莱斯芽胞杆菌的特异引物对的筛选

1、特异引物对普通PCR筛选

(1)采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取待测菌(贝莱斯芽胞杆菌ZF2、贝莱斯芽胞杆菌FZB42、解淀粉芽胞杆菌ZF75、枯草芽胞杆菌ZF161和多粘类芽胞杆菌ZF129)的基因组DNA，得到待测菌的基因组DNA。

(2)以待测菌的基因组DNA为模板，分别采用步骤一中的18个特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应体系为20μL，包括10μL T-taq Mix(北京博迈德生物技术有限公司的产品)、1μL引物F水溶液、1μL引物R水溶液、1μL模板和7μL ddH

反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

将步骤(2)中的待测菌的基因组DNA替换为水，其它步骤均不变，作为空白对照。

部分检测结果见图1(M为DNAMarker，N为空白对照，1为贝莱斯芽胞杆菌ZF2，2为贝莱斯芽胞杆菌FZB42，3为解淀粉芽胞杆菌ZF75，4为枯草芽胞杆菌ZF161，5为多粘类芽胞杆菌ZF129)。结果表明，基于D3N19_RS13500基因的核苷酸序列合成的特异引物对17特异性较好，可以在多种芽胞杆菌中鉴别出贝莱斯芽胞杆菌。

2、PCR扩增退火温度筛选

(1)采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取待测菌(贝莱斯芽胞杆菌ZF2、贝莱斯芽胞杆菌FZB42、解淀粉芽胞杆菌ZF75、枯草芽胞杆菌ZF161或多粘类芽胞杆菌ZF129)的基因组DNA，得到待测菌的基因组DNA。

(2)以待测菌的基因组DNA为模板，分别采用特异引物对17进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应程序为：94℃3min；94℃30s，52℃-58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

将步骤(2)中的待测菌的基因组DNA替换为水，其它步骤均不变，作为空白对照。

部分检测结果见图2(M为DNAMarker，N为空白对照，1为贝莱斯芽胞杆菌ZF2，2为贝莱斯芽胞杆菌FZB42，3为解淀粉芽胞杆菌ZF75，4为枯草芽胞杆菌ZF161，5为多粘类芽胞杆菌ZF129，退火温度依次为57.6℃、56.9℃、55.8℃、54.4℃、53.4℃和52.6℃)。结果表明，退火温度在53℃-56℃之间时，扩增产物条带具有特异性且扩增效果较好。由此可见，53℃-56℃为最适退火温度。

3、特异引物对17的特异性验证

(1)采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取待测菌(贝莱斯芽胞杆菌ZF2、贝莱斯芽胞杆菌ZF50、贝莱斯芽胞杆菌ZF128、贝莱斯芽胞杆菌FZB42、解淀粉芽胞杆菌ZF57、解淀粉芽胞杆菌ZF75、解淀粉芽胞杆菌DSM7、枯草芽胞杆菌ZF161、多粘类芽胞杆菌ZF129、密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、丁香假单胞流泪致病变种或密执安棒形杆菌环腐亚种)的基因组DNA，得到待测菌的基因组DNA。

(2)以待测菌的基因组DNA为模板，分别采用特异引物对17进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

反应程序为：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

(3)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

将步骤(2)中的待测菌的基因组DNA替换为水，其它步骤均不变，作为空白对照。

检测结果见图3(M为DNAMarker，N为空白对照，1为贝莱斯芽胞杆菌ZF2，2为贝莱斯芽胞杆菌ZF50，3为贝莱斯芽胞杆菌ZF128，4为贝莱斯芽胞杆菌FZB42，5为解淀粉芽胞杆菌ZF57，6为解淀粉芽胞杆菌ZF75，7为解淀粉芽胞杆菌DSM7，8为枯草芽胞杆菌ZF161，9为多粘类芽胞杆菌ZF129，10-14为其它非芽胞类细菌(即密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种、丁香假单胞流泪致病变种、密执安棒形杆菌环腐亚种)。结果表明，仅在以贝莱斯芽胞杆菌的基因组DNA为模板时，出现大小约为193bp明亮单一条带，而以其它类芽孢杆菌或非芽胞类细菌的基因组DNA为模板时，均无条带出现。由此可见，特异引物对17对贝莱斯芽胞杆菌具有特异性。

大小约为193bp的条带的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。SEQ ID NO:1为：CTAATTTTTCCTATTTCTTTAACGCTGATTTTCATCTTTGTCTTTGACCCATGAATGCCGTCAGCAGTAAGGCCGTACATGGACTGGAATCGTTTGACTGCATTTGCGCTGTTTTCGGGCCGTAAATATCATCATCAAACCGTTCATCAATTGAAACTGACTCATTTACTGATGTAAGTGAATTTAAATAAAT。

4、特异引物对17的荧光定量PCR验证

(1)采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取待测菌(贝莱斯芽胞杆菌ZF2、贝莱斯芽胞杆菌FZB42、解淀粉芽胞杆菌ZF75、枯草芽胞杆菌ZF161、多粘类芽胞杆菌ZF129、密执安棒杆菌密执安亚种、丁香假单胞番茄致病变种、野油菜黄单胞野油菜变种或丁香假单胞流泪致病变种)的基因组DNA，得到待测菌的基因组DNA。

(2)以待测菌的基因组DNA为模板，采用荧光定量PCR试剂盒(天根生化科技有限公司的产品)进行荧光定量PCR扩增。检测引物为特异引物对17的引物。

荧光定量PCR体系为20μL，包括10μL SYBR Mix(荧光定量PCR试剂盒中的组件)、0.5μL引物F水溶液、0.5μL引物R水溶液、0.4μLROX、1μL模板和7.6μL ddH

荧光定量PCR程序为：98℃5min；98℃10s，60℃10s，72℃30s，40个循环。

每个模板设置3个重复。

以无菌水替代模板，作为空白对照。

检测结果见图4。结果表明，以贝莱斯芽胞杆菌ZF2或贝莱斯芽胞杆菌FZB42的基因组DNA为模板时出现明显扩增，CT值小于15；以其他菌株基因组DNA为模板时，无扩增或CT值大于35。由此可见，特异引物对17具有特异性。

实施例2、贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ZF2 PMA-qPCR检测体系的建立

一、最适PMA浓度的筛选

叠氮溴化丙锭(PMA)可以选择性的穿过死菌细胞膜，在光照条件下结合死菌DNA，从而阻止死菌的PCR扩增。筛选最适PMA浓度，可以区分活菌和死菌，对具有活性的贝莱斯芽胞杆菌进行检测。

1、将贝莱斯芽胞杆菌ZF2的单菌落接种于LB液体培养基，28℃恒温振荡培养24h，调节OD

2、取装有1mL活细胞(A组)或死细胞(B组)的1.5mL离心管，加入PMA并使PMA在体系中的浓度为0μM/L、10μM/L、20μM/L、30μM/L、40μM/L、50μM/L或60μM/L，得到不同浓度的PMA菌液。

3、将不同浓度的PMA菌液置于黑暗条件下处理15min，然后将菌液置于50W的LED灯下处理10min，冰浴孵育，避免温度过高将活细胞致死。

4、提取不同处理的菌液的基因组DNA并以其作为模板，采用荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR扩增。检测引物为特异引物对17的引物。

比较不同PMA浓度对活细胞和死细胞的影响。

检测结果见表2。结果表明，当PMA终浓度为60μM时，活细胞扩增CT值为13.27，死细胞扩增CT值为37.09。由此可见，PMA浓度为60μM是区分贝莱斯芽胞杆菌ZF2活细胞和死细胞的最适浓度。

表2不同浓度PMA处理活细胞和死细胞的扩增CT值

二、ZF2 qPCR检测体系的建立

1、特异性片段扩增

以贝莱斯芽胞杆菌ZF2的基因组DNA为模板，采用特异引物对17进行PCR扩增，回收约193bp的DNA片段。

反应体系为50μL，包括25μL T-taq Mix、2μL引物F水溶液、2μL引物R水溶液、2μL模板和19μL ddH

反应程序为：94℃3min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。

2、将步骤1回收的DNA片段和克隆载体pMD18-T进行连接，得到阳性质粒。

3、采用Nanodrop测定阳性质粒的DNA浓度，然后用无菌水稀释至10ng/μL；之后梯度稀释，获得浓度依次为10×10

以阳性质粒溶液的浓度的对数值为横坐标，相应的CT值为纵坐标，绘制标准曲线。

荧光定量PCR扩增结果见图5。

绘制的标准曲线见图6。

结果表明，不同浓度阳性质粒溶液的qPCR出现不同程度的扩增，并呈一定的线性关系。标准曲线的线性方程为y＝-3.8785x+30.713，R2＝0.9972。

由此可见，特异引物对17具备高灵敏度，检测最低浓度为0.1fg/μL，最低拷贝数为474copies/μL。

实施例3、贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)ZF2在土壤中的定殖动态监测

一、贝莱斯芽胞杆菌ZF2利福平驯化

利福平是一种广谱性的细菌抗生素，贝莱斯芽胞杆菌ZF2经利福平驯化后，可以在含有利福平的LB平板或培养基中生长，而其它细菌不能生长，从而区分开菌株ZF2与其它细菌，方便准确的检测菌株ZF2的定殖能力。利福平本身显红色，具有很强的标识性，是目前用于菌株驯化的最常用抗生素。

1、将贝莱斯芽胞杆菌ZF2单菌落接种于5mL含0.5ng/μL利福平的LB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养24h，得到ZF2菌液。

2、将ZF2菌液进行利福平抗性低浓度至高浓度的转接继代培养，利福平浓度梯度为1ng/μL、2g/μL、5ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、40ng/μL和50ng/μL，得到利福平驯化菌ZF2。

将利福平驯化菌ZF2的菌液和40％(v/v)甘油水溶液等体积混匀，-80℃保存。

二、贝莱斯芽胞杆菌ZF2在土壤中的定殖动态监测

待测土壤采集自河北青县、海南、山东寿光、新疆、天津或宁夏。

实验重复3次取平均值，每次重复的步骤如下：

1、将利福平驯化菌ZF2单菌落接种于5mL含利福平的LB液体培养基，28℃、180rpm振荡培养24h，得到OD

2、将步骤1得到的菌液和待测土壤混匀(混合比例为1mL菌液：10g土壤)，置于保湿盒，28℃静置培养0天、5天、10天或15天。

3、完成步骤2后，提取土壤的DNA(采用天根公司的土壤DNA提取试剂盒进行)并以其作为模板，采用荧光定量PCR试剂盒进行荧光定量PCR扩增，得到CT值。检测引物为特异引物对17的引物。

根据实施例2中步骤二绘制的标准曲线和CT值，获得ZF2基因拷贝数。ZF2基因拷贝数越大，土壤中菌株ZF2含量越高，定殖能力越强。

不同土壤中菌株ZF2基因拷贝数检测结果见表3。结果表明，接种利福平驯化菌ZF2的15天内，宁夏土壤和新疆土壤中ZF2基因拷贝数较高，且相对稳定，证明利福平驯化菌ZF2在新疆土壤和宁夏土壤中定殖能力较强。

表3 1克土壤中菌株ZF2检测基因拷贝数

4、将1g待测土壤或完成步骤2的土壤溶于9mL无菌水中，28℃振荡培养30min，得到稀释度为10

菌落数统计结果见表4。结果表明，接种利福平驯化菌ZF2的15天内，每克宁夏土壤和新疆土壤中的菌落数保持在10

表4 1g待测土壤中ZF2菌落数

平板计数法检测结果与实时荧光定量PCR检测结果基本一致。上述结果表明，与其它土壤相比，宁夏土壤和新疆土壤中贝莱斯芽胞杆菌ZF2的定殖能力显著增加。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 一种快速检测贝莱斯芽胞杆菌的方法及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 193

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ctaatttttc ctatttcttt aacgctgatt ttcatctttg tctttgaccc atgaatgccg 60

tcagcagtaa ggccgtacat ggactggaat cgtttgactg catttgcgct gttttcgggc 120

cgtaaatatc atcatcaaac cgttcatcaa ttgaaactga ctcatttact gatgtaagtg 180

aatttaaata aat 193

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

ctaatttttc ctatttcttt aacgc 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atttatttaa attcacttac atcagt 26