一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用。

背景技术

目前，胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)是引起猪胸膜肺炎的病原体，猪胸膜肺炎是一种具有高度传染性的严重猪疾病，可与呼吸道病原体如伪狂犬病病毒和/或猪肺炎支原体的混合感染使病情恶化。对全球各地的养殖业均造成重大损失。猪胸膜肺炎的特点是出血性、纤维性和坏死性肺囊肿，临床表现从急性到慢性不等。接触这种微生物可能导致慢性感染，导致动物无法茁壮成长，即使猪能存活下来，它们也会成为无症状的携带者，将疾病传染给健康的猪群。

乙醛/乙醇脱氢酶(aldehyde/alcohol dehydrogenase,AdhE)是一种由AdhE基因编码的双功能脱氢酶，具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。在之前的关于AdhE研究中，大多数都集中于其在乙醇代谢以及硝化应激和乙醇耐受性上发挥的功能，尚未有传染性胸膜肺炎放线杆菌(7型)AdhE蛋白在亚单位疫苗中的应用。其广泛地分布在真核生物和原核生物中，真核生物中有13个，原核生物中有93个。这种广泛存在说明它对生命的过程有重要意义AdhE是一种双功能酶，具有乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶的催化活性。近年来，大量研究结果表明AdhE可以诱导宿主的天然免疫。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有关于AdhE的研究大多数都集中于其在乙醇代谢以及硝化应激和乙醇耐受性上发挥的功能，尚未有传染性胸膜肺炎放线杆菌(7型)AdhE蛋白在亚单位疫苗中的应用。

解决上述技术问题的难度：本发明首次对猪胸膜放线杆菌7型AdhE基因进行扩增和蛋白原核表达，并通过免疫原性研究验证其具有很好的同源免疫原性，AdhE基因全长2616bp，蛋白大小95kD，蛋白偏大，表达难度也随之增加，本发明中通过优化诱导条件，最终克服困难，成功高产的表达了APP 7型的AdhE蛋白。

解决上述技术问题的意义：猪胸膜放线杆菌严重危害养猪业发展，特别是目前非洲猪瘟疫情国内流行，APP感染损伤猪群呼吸系统，从而可能加重非洲猪瘟疫情传播。高产的APP 7型AdhE蛋白体系的建立能够为APP亚单位疫苗研制提供技术保障，为APP防控提供技术支撑。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种一种猪胸膜放线杆菌基因、蛋白的原核表达和应用，具体涉及一种猪胸膜放线杆菌7型AdhE蛋白的原核表达和应用。本发明为传染性胸膜肺炎放线杆菌(7型)AdhE蛋白的亚单位疫苗提供候选，为传染性胸膜肺炎疫病防控奠定基础。

本发明是这样实现的，一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因，所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因的DNA序列为SEQ ID NO：1。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因构建的表达载体，购买于北京全式金生物技术有限公司；并在大肠杆菌BL21中的可溶性诱导表达。

本发明的另一目的在于提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：

(1)AdhE全基因的扩增：

以传染性胸膜肺炎放线杆菌7型的基因组DNA为模板，根据所设计的特异性引物为PCR引物，经PCR扩增出大小约在2631bp的目的片段。

(2)AdhE蛋白原核表达载体的构建及测序鉴定：

将回收后的AdhE基因目的片段和质粒pET-32a(+)进行BamHⅠ+NotⅠ双酶酶切后，AdhE目的片段再与原核表达载体pET-32a(+)连接得到重组原核表达质粒rpET-32a(+)-Adh，原核表达重组质粒进行酶切鉴定，单双酶切鉴定结果显示：单酶酶切出一条线性条带，大小大约在8500bp左右；双酶酶切出两条线性条带，一条大小大约在2600bp左右，与目的片段大小相吻合，另一条大小大约在5900bp左右，与pET-32a(+)载体大小相吻合。测序结果显示，目的片段与App7型AdhE基因序列一致，片段大小为2616bp。

ADhE基因序列：

atggctaacaatgcaaaaaatgcacaaccatatgatgctcaaaccgaagtaaatcagctagttgaaaacggtttaaaagctctcgaagaatttcgtcagcttaaccaagaacaagtggattacatcgttgcaaaagcctccgtggcggcactggataaacatggcgttctagcaatgcacgcttatgaagaaacggggcggggcgtatttgaagacaaagcgactaaaaatctatttgcttgtgaatatgtcgtaaataatatgcgacatttaaaaacggcggggataattagtgaagataacgtaaccggtattaccgaaatcgccgaccctgtcggtgtcgtatgcggcataactccgacaaccaacccaacctcaaccactatcttcaaagcgttaatcgccctcaaaactcgtaacccaatcgtttttgctttccacccttccgcacaacaatcttccgctcatgccgctcaagttgtatatgatgccgccgttgctgccggcgcaccgaaaaattgtgtgcaatggattaaaaccccgtcaatggaaggtacttccgcattaatgaaacatccgggtattgcaaccattcttgctaccggcggtaatgccatggttgaagcggcatattcttgcggtaaaccggcattaggcgtaggggcgggtaacgtaccggcttatgtggaaaaaactgctaaactagaacaagctgtttacgacattgtgatgtcaaaatcttttgacaacggtatgatttgtgcatccgaacaagcggcgattgtcgataaagaaatctatgccgatttcgtgaaagaaatgcaatcttacggcgtatatctggtaaataaaaaagaaaaagtactgttagaaaaattcattttcggtgtggataaagccaaagatgaaaactgtgccggagcaaaattaaatgcggcggtcgtaggtaaaccggcggcatggattgccgaacaagcgggttttagcgtgccaccaaaaacaaacatcctacttgcagaatgtgcgtttgtcggtgaaggcgaaccgcttactcgtgagaaattatcaccggtacttgcattattaaaatcgaattcaaccgaacacggtttagaactttccgaagcgatggtaaatttctacggtttaggtcactcggcggcaatccatacgcaaaatgtcgaattagcaaaaacattcggcgagcgcgttaaagcgattcgtgtaatttggaactcgccatcaacattcggtggtatcggtgacgtgtataattcattccttccgtccctcacattaggttgtggttcttacggtaaaaactccgtaagtaacaacgtaagtgcggtgaacttaattaatattaaacgtgtgggcagacggagaaacaatatgcaatggtttaaagttccatcaaaaatctactttgagcgtgattcaattcaatatctcaaatcaatgaaagatgcggaaaaagtgatgatcgtgaccgaccgctcaatggtagatctcggttttgtcgatagaattaccgaccaattacgccaacgtcgtaataaagtgatgattcagttatttaccgatgttgaaccgaatccaagtttacaaaccgtacaacgcgggacggaacttatgcgtagcttccaaccggataccattattgccttaggtggcggctcgcctatggatgcggcaaaagtaatgtggttattctatgaacaaccggaagtggatttccgtgatttagttcagaaatttatggatattcgtaaacgtgcgttcaaattcccgcaattaggtcgtaaagcgaaatttgtcggtatcccgaccacatccggtaccggttccgaagtcacgccgtttgcggtcattactgacggcgatattaaatatccgttggccgactactctctcacgccgacaattgcgattgtagatcctgcattagtgatgtcagtgccggctcatgttgcagcggataccggtttagacgtattaactcacgcaactgaggcttatacttcaatacttgccaacgactacaccgacggtttagcgttacaggcaattaaactggtatttgaaaatttagaaaaatccgtgaaagaatttgatgaagtcgctcgcgagaaaatgcacaatgcttcaactatggcaggtatggcgtttgcaaacgcattcttaggtatttgtcactcaatggcgcataaaatcggcggtaaattccatacgattcacggtcgtaccaatgcgattttattaccgcacgtaattcgttataacggtactcgcccgactaaagtggcaacttggccgaaatacacaaactatgttgcggataaacgcttccaagacatcgcacgtattttaggtttaccggcgacaacgcctgaagaagcggtggaatcttacgctaaagcggtacatgatttagcagtacgttgtggtgttaaaatgtctttacgtgaacaaggtattgacgaacaagagttcttagacgcacgtcgtgaacttgcattaaatgcctttgaagaccaatgtactccggcaaatccacgtcttgcaatggtagaagatatggaagagataatgacaaaagcttactatggcaaataa

对诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化，最适诱导温度为37℃，时间为4h，IPTG浓度为0.8mM。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因编码的蛋白，所述蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一目的在于提供一种所述的蛋白的原核表达方法，所述AdhE蛋白的原核表达方法包括以下步骤：

步骤一，根据App7型全基因序列，设计AdhE蛋白基因的上下游引物(SEQ ID NO：4)分别为AdhE P1、AdhE P2；

步骤二，AdhE基因扩增与原核表达载体pET-32a(+)连接；

步骤三，AdhE蛋白的原核表达及纯化与WB鉴定。

进一步，步骤一中，所述上游引物的基因序列为：AdhE P1：cgcggatccatggctaacaatgcaaaa(BamH I)；

所述下游引物的基因序列为：AdhEP2：

aaggaaaaaagcggccgcttatttgccatagtaagcttttgtc(Not I)。

进一步，步骤二中，所述AdhE基因扩增与原核表达载体pET-32a(+)连接具体包括：

App7型的细菌基因组DNA按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取；将AdhE基因的PCR扩增产物回收后与表达质粒pET-32a(+)连接后转化DH5α菌株保存。

进一步，步骤三中，所述AdhE蛋白的原核表达及纯化与WB鉴定方法包括：

(1)将含有pET-32a(+)-AdhE和pET32a重组质粒的表达菌株BL21于Amp-LB培养液中过夜培养，将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于10mL LB培养液中；

(2)诱导4h取菌液4℃下12000r/min离心5min，弃上清，所得菌体用加20mM的Tris-HCl(pH8.0)，洗涤2次，然后进行超声波破碎；

(3)按照纯化系统操作说明对rAdhE表达产物进行纯化，用ToxinEraserTM去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性；

(4)纯化的重组蛋白rAdhE进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、BSA封闭、稀释的高免血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Westernblot，ECL显色。

进一步，所述步骤(1)进一步还包括：剧烈振荡培养至OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mM，于37℃振荡培养。

本发明另一目的在于提供一种所述蛋白在传染性胸膜肺炎疫病防控亚单位疫苗中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供的一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE蛋白的原核表达方法，以App7型菌株基因组为模板扩增出AdhE的全基因序列。本发明成功构建pET-32a(+)-rAdhE表达载体，实现其在大肠杆菌BL21中的可溶性诱导表达，融合蛋白大小约为110kDa。对诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行了优化，最适诱导温度为37℃，时间为4h，最适IPTG浓度为0.8mM。

本发明通过ELISA检测证明原核表达的rAdhE融合蛋白能刺激小鼠产生高水平特异性抗体，具有较好的免疫原性。同时，rAdhE免疫后能够抵御APP7型的致死性攻毒和70％的APP1型的攻读保护，对App的致死剂量攻击提供保护力，减轻小鼠体内的急性炎症反应，为传染性胸膜肺炎疫病防控奠定基础。

本发明的APP7型AdhE蛋白用于预防APP的致死性感染；表达方法成熟简单，成本较低，适用于产业化生产。

附图说明

图1是本发明实施例提供的传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE蛋白的原核表达方法流程图。

图2是本发明实施例提供的DH5α菌株示意图。

图3是本发明实施例提供的纯化后的重组蛋白在110KDa处的条带显示示意图一。

图4是本发明实施例提供的纯化后的重组蛋白在110KDa处的条带显示示意图二。

图5是本发明实施例提供的AdhE基因PCR扩增图。图中：M：DNAMarker S plus,ready-to-use；1：AdhE基因扩增结果2631bp；2：阴性对照。

图6是本发明实施例提供的rpET-32(a)-AdhE质粒酶切鉴定图。图中：M：DL10000DNA Marker；1：rpET-32(a)-AdhE单酶切片段8491bp；2：rpET-32(a)-AdhE双酶切后目的片段2631bp和质粒片段5860bp。

图7是本发明实施例提供的rpET-32(a)-AdhE质粒示意图。

图8是本发明实施例提供的rAdhE对BALB/c小鼠的攻毒保护图。

图9是本发明实施例提供的各组病理切片经HE染色，镜检观察结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE蛋白的原核表达方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例在于提供一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因，所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因的DNA序列为SEQ ID NO：1。

本发明提供一种利用所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因构建的表达载体；并在大肠杆菌BL21中的可溶性诱导表达。

本发明实施例提供一种所述表达载体的构建方法，所述表达载体的构建方法包括：

对诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化，最适诱导温度为37℃，时间为4h，IPTG浓度为0.8mM。

本发明实施例提供一种利用所述传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因编码的蛋白，所述蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

如图1所示，本发明实施例提供的一种传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE蛋白的原核表达方法包括以下步骤：

S101：根据App7型全基因序列，设计AdhE蛋白基因的上下游引物分别为AdhE P1、AdhE P2。

S102：AdhE基因扩增与原核表达载体pET-32a(+)连接。

S103：AdhE蛋白的原核表达及纯化与WB鉴定。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例

1、AdhE基因的扩增与序列分析

1.1引物设计

根据NCBI已发表的登录号为CP001091.1的App7型全基因序列，设计AdhE蛋白基因的上下游引物(SEQ ID NO：3)(表1)。

表1扩增传染性胸膜肺炎放线杆菌7型的特异性引物

1.2AdhE基因扩增与原核表达载体pET-32a(+)连接。

App7型的细菌基因组DNA按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书提取。将AdhE基因(附件1)的PCR扩增产物回收后与表达质粒pET-32a(+)连接后转化DH5α菌株保存。(如图2所示)

1.3AdhE蛋白的原核表达及纯化与WB鉴定

将含有pET-32a(+)-AdhE和pET32a重组质粒的表达菌株BL21于Amp-LB培养液中过夜培养，将过夜培养的菌液按1:50的比例接种于10mL LB培养液中，剧烈振荡培养至OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mM，于37℃振荡培养。诱导4h取菌液4℃下12000r/min离心5min，弃上清，所得菌体用加20mM的Tris-HCl(pH8.0)，洗涤2次，然后进行超声波破碎。然后按照生工生物工程(上海)有限公司Ni-NTA-SefinoseColumn(BSP079-3)纯化系统操作说明对rAdhE表达产物进行纯化，用ToxinEraserTM去内毒素试剂盒进行去除内毒素处理后，鲎试剂检测蛋白内毒素为阴性。

纯化的重组蛋白rAdhE进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、BSA封闭、稀释的高免血清作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG为二抗进行Westernblot，经ECL显色后拍照，观察结果，在110KDa处有条带显示。(如图3-4所示)

1.4App7型AdhE蛋白的免疫保护性分析

将60只6周龄雌性Balb/C小鼠分为A(rAdhE组)、B(疫苗组)两组，每组20只。

A组(rAdhE组)：免疫AdhE重组蛋白，将100μg重组蛋白AdhE溶解于100μLPBS后与佐剂1：1混匀，首次免疫时每只小鼠皮下多点注射200μL，2周后进行腹腔注射第二次免疫(首免时使用完全弗氏佐剂，二免使用不完全弗氏佐剂)，二免2周以后直接对小鼠注射30μg纯化的rAdhE蛋白进行加强免疫。

B组(PBS组)：以等量的PBS替换第一组中的rAdhE，采用同第一组相同的方式免疫。

在加强免疫后一周，从A、B两组中随机选取10只腹腔接种致死菌量2.74×108CFU/200μL的App7进行攻毒保护试验，另10只腹腔接种致死菌量9.4×107CFU/200μL的App1进行攻毒保护试验。结果显示：感染App7的PBS组小鼠在36h内全部死亡，存活率为0；感染App7的rAdhE组小鼠在24h内均无小鼠死亡，48h内攻毒App7的rAdhE组无死亡，获得100％的保护力；感染App1的PBS组小鼠在36h内全部死亡，存活率为0，感染App1的rAdhE组小鼠在24h内无小鼠死亡，48h内攻毒App1的rAdhE组小鼠有3只死亡，获得70％的保护力；分析认为，抗原AdhE刺激机体产生的抗体能够在App感染急性期提供一定免疫保护。

本发明的APP7型AdhE蛋白用于预防APP的致死性感染；表达方法成熟简单，成本较低，适用于产业化生产。

下面结合表达载体的构建方法对本发明作进一步描述。

本发明实施例提供的表达载体的构建方法包括：

(1)AdhE全基因的扩增

以传染性胸膜肺炎放线杆菌7型的基因组DNA为模板，根据所设计的特异性引物为PCR引物，经PCR扩增出大小约在2631bp的目的片段(图5，图中：M：DNAMarker S plus,ready-to-use；1：AdhE基因扩增结果2631bp；2：阴性对照)。

(2)AdhE蛋白原核表达载体的构建及测序鉴定：将回收后的AdhE基因目的片段和质粒pET-32a(+)进行BamHⅠ+NotⅠ双酶酶切后，AdhE目的片段再与原核表达载体pET-32a(+)连接得到重组原核表达质粒rpET-32a(+)-AdhE(图6，图中，rpET-32(a)-AdhE质粒酶切鉴定，M：DL10000 DNA Marker；1：rpET-32(a)-AdhE单酶切片段8491bp；2：rpET-32(a)-AdhE双酶切后目的片段2631bp和质粒片段5860bp)，原核表达重组质粒进行酶切鉴定，单双酶切鉴定结果显示：单酶酶切出一条线性条带，大小大约在8500bp左右；双酶酶切出两条线性条带，一条大小大约在2600bp左右，与目的片段大小相吻合，另一条大小大约在5900bp左右，与pET-32a(+)载体大小相吻合(图7rpET-32(a)-AdhE质粒示意图)。测序结果显示，目的片段与App7型AdhE基因序列一致，片段大小为2631bp。

对诱导温度、诱导时间和IPTG浓度进行优化，最适诱导温度为37℃，时间为4h，IPTG浓度为0.8mM。

下面结合具体实验对本发明作进一步描述。

rAdhE对小鼠的攻毒保护结果：

对A、B、C组小鼠进行腹腔注射攻毒，观察并记录小鼠的死亡情况，结果见图8rAdhE对BALB/c小鼠的攻毒保护图。感染App7的PBS组小鼠在36h内全部死亡，存活率为0；感染App7的rAdhE组小鼠在24h内均无小鼠死亡，48h内攻毒App7的rAdhE组仅死亡一只，获得90％的保护力；感染App1的PBS组小鼠在36h内全部死亡，存活率为0，感染App1的rAdhE组小鼠在24h内无小鼠死亡，48h内攻毒App1的rAdhE组小鼠有3只死亡，获得70％的保护力；商品灭活苗对于两种血清型的感染都提供了100％的保护力。分析认为，抗原AdhE刺激机体产生的抗体能够在App感染急性期提供一定免疫保护，但保护效果比商品疫苗略差。

组织病理学分析：

各组病理切片经HE染色，镜检观察，结果如图9。结果显示App1和App7分别攻毒的PBS组死亡小鼠的肺组织(图9，A1和B1)均呈间质性肺炎，部分结构已凝固性坏死，肺叶中可见肺组织局灶性出血，支气管出血，部分支气管黏膜以及血管壁破碎、断裂，肺泡壁弥漫性的轻度增厚，肺泡壁上细胞分成增多，可见较多分叶状的中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，在较多小血管内也可见嗜中性粒细胞。App1和App7攻毒rAdhE组的存活小鼠的肺组织(图9，A2和B2)中未见明显出血、淤血、坏死反应，支气管上皮完整正常，管腔内干净，少量肺泡壁轻度增厚，肺泡壁以及血管周围和支气管周围仍然可见少量以中性粒细胞为主的炎性浸润，但相比其各自的PBS对照组，炎性细胞已数量已显著减少。而App1和App7分别攻毒的疫苗组存活小鼠(图9，A3和B3)肺组织中未见显著的病理损伤，支气管上皮完整正常，管腔内干净，肺泡壁厚度均匀，仅在肺泡壁上可见少量中性粒细胞及淋巴细胞。图9中，A1-A3分别为App1攻毒PBS组、rAdhE组、疫苗组后的肺组织；B1-B3分别为App7攻毒PBS组、rAdhE组、疫苗组后的肺组织。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 传染性胸膜肺炎放线杆菌AdhE基因、蛋白及表达载体

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2616

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctaaca atgcaaaaaa tgcacaacca tatgatgctc aaaccgaagt aaatcagcta 60

gttgaaaacg gtttaaaagc tctcgaagaa tttcgtcagc ttaaccaaga acaagtggat 120

tacatcgttg caaaagcctc cgtggcggca ttggataaac atggcgttct agcaatgcac 180

gcttatgaag aaacggggcg gggcgtattt gaagacaaag cgactaaaaa tctatttgct 240

tgtgaatatg tcgtaaataa tatgcgacat ttaaaaacgg cggggataat tagtgaagat 300

aacgtaaccg gtattaccga aatcgccgac cctgtcggtg tcgtatgcgg tataactccg 360

acaaccaacc caacctcaac cactatcttc aaagcgttaa tcgccctcaa aactcgtaac 420

ccaatcgttt ttgctttcca cccttccgca caacaatctt ccgctcatgc cgctcaagtt 480

gtatatgatg ccgccgttgc tgccggcgca ccgaaaaatt gtgtgcaatg gattaaaacc 540

ccgtcaatgg aaggtacttc cgcattaatg aaacatccgg gtattgcaac cattcttgct 600

accggcggta atgccatggt tgaagcggca tattcttgcg gtaagccggc attaggcgta 660

ggggcgggta acgtaccggc ttatgtggaa aaaactgcta aactagaaca agctgtttac 720

gacattgtga tgtcaaaatc ttttgacaac ggtatgattt gtgcatccga acaagcggcg 780

attgtcgata aagaaatcta tgccgatttc gtgaaagaaa tgcaatctta cggcgtatat 840

ctggtaaata aaaaagaaaa agtactgtta gaaaaattca ttttcggtgt ggataaagcc 900

aaagatgaaa actgtgccgg agcaaaatta aatgcggcgg tcgtaggtaa accggcggca 960

tggattgccg aacaagcggg ttttagcgtg ccaccaaaaa caaacatcct acttgcagaa 1020

tgtgcgtttg tcggtgaagg cgaaccgctt actcgtgaga aattatcacc ggtacttgca 1080

ttattaaaat cgaattcaac cgaacacggt ttagaacttt ccgaagcgat ggtaaatttc 1140

tacggtttag gtcactcggc ggcaatccat acgcaaaatg tcgaattagc aaaaacattc 1200

ggcgagcgcg ttaaagcgat tcgtgtaatt tggaactcgc catcaacatt cggtggtatc 1260

ggtgacgtgt ataattcatt ccttccgtcc ctcacattag gttgtggttc ttacggtaaa 1320

aactccgtaa gtaacaacgt aagtgcggtg aacttaatta atattaaacg tgtgggcaga 1380

cggagaaaca atatgcaatg gtttaaagtt ccatcaaaaa tctactttga gcgtgattca 1440

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gggacggaac ttatgcgtag cttccaaccg gataccatta ttgccttagg tggcggctcg 1680

cctatggatg cggcaaaagt aatgtggtta ttctatgaac aaccggaagt ggatttccgt 1740

gatttagttc agaaatttat ggatattcgt aaacgtgcgt tcaaattccc gcaattaggt 1800

cgtaaagcga aatttgtcgg tatcccgaca acatccggta ccggttccga agtcacgccg 1860

tttgcggtca ttactgacgg cgatattaaa tatccgttgg ccgactactc tctcacgccg 1920

acaattgcga ttgtagatcc tgcattagtg atgtcagtgc cggctcatgt tgcagcggat 1980

accggtttag acgtattaac tcacgcaact gaggcttata cttcaatact tgccaacgac 2040

tacaccgacg gtttagcgtt acaggcaatt aaactggtat ttgaaaattt agaaaaatcc 2100

gtgaaagaat ttgatgaagt cgctcgcgag aaaatgcaca atgcttcaac tatggcaggt 2160

atggcgtttg caaacgcatt cttaggtatt tgtcactcaa tggcgcataa aatcggcggt 2220

aaattccata cgattcacgg tcgtaccaat gcgattttat taccgcacgt aattcgttat 2280

aacggtactc gcccgactaa agtggcaact tggccgaaat acacaaacta tgttgcggat 2340

aaacgcttcc aagacatcgc acgtatttta ggtttaccgg cgacaacgcc tgaagaagcg 2400

gtggaatctt acgctaaagc ggtacatgat ttagcagtac gttgtggtgt taaaatgtct 2460

ttacgtgaac aaggtattga cgaacaagag ttcttagacg cacgtcgtga acttgcatta 2520

aatgcctttg aagaccaatg tactccggca aatccacgtc ttgcaatggt agaagatatg 2580

gaagagataa tgacaaaagc ttactatggc aaataa 2616

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcca tggctaacaa tgcaaaaaag gaaaaaagcg gccgcttatt tgccatagta 60

agcttttgtc 70