选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法、及确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法
文献发布时间:2023-06-19 12:21:13
技术领域
本发明涉及一种选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法、及确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法。
背景技术
一直以来,已知有利用昆虫识别气味的构造检测有气味的物质的方法。例如,专利文献1中记载有一种使试样接触共表达昆虫的嗅觉受体蛋白质及荧光蛋白质的草地贪夜蛾细胞,检测试样中的有气味的物质的方法。该方法中,使包含有气味的物质的试样接触保存有细胞芯片的容器,比较有气味的物质接触之前的容器的荧光图像的平均亮度值与接触了有气味的物质之后的容器的荧光图像的平均亮度值,在平均亮度值的增加率在规定的值以上的情况下,判定为检测出有气味的物质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2013-27376号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
专利文献1所记载的方法存在检测灵敏度不足的情况。因此,本发明的目的在于以高灵敏度检测试样中的目标物质。
解决技术问题的手段
本发明的选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法包括如下工序:(1a)使包含目标物质的试样接触多个细胞的工序,上述细胞是具有上述目标物质的受体与荧光指示剂的细胞,上述荧光指示剂发出上述目标物质与上述受体的结合的结果的荧光;(1b)算出每个上述细胞的荧光强度的上升速度的工序;和(1c)选择上述多个细胞中显示出前50%以内的上述荧光强度的上升速度的任意的细胞的工序。
上述方法可以使用微流路装置来实施。微流路装置具有:第一流路;第二流路,其与上述第一流路相邻;及联络部,其连接上述第一流路与上述第二流路,且在上述第一流路侧具有能够捕捉上述细胞的开口部。上述工序1a可以包括如下工序:(A1)以上述第一流路内的压力高于上述第二流路内的压力的方式,将包含上述多个细胞的悬浮液导入上述第一流路,并在上述第一流路侧的开口部捕捉上述细胞的工序;和(A2)在维持上述第一流路与上述第二流路的压力差的状态下,将包含目标物质的试样导入上述第一流路或上述第二流路,使包含上述目标物质的试样接触上述被捕捉的细胞的工序。上述方法中,在上述工序1c之后,可以包括如下工序:(1d)以上述第二流路内的压力高于上述第一流路内的压力的方式,将液体导入上述第二流路,自上述开口部释放上述被捕捉的细胞的工序;和(1e)回收上述被释放的细胞中上述被选择的任意的细胞的工序。
上述工序1c中,也可以选择上述多个细胞中显示出前30%以内的上述荧光强度的上升速度的任意的细胞。
本发明的确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法包括如下工序:(2a)使包含已知浓度的目标物质的标准试样接触多个细胞的工序,上述细胞是具有上述目标物质的受体与荧光指示剂的细胞,上述荧光指示剂发出上述目标物质与上述受体的结合的结果的荧光;(2b)算出每个上述细胞的荧光强度的上升速度的工序;(2c)使用1个以上包含不同浓度的上述目标物质的标准试样,重复工序2a及工序2b的组合,对各标准试样算出荧光强度的上升速度的工序;(2d)使包含未知浓度的目标物质的试样接触上述细胞的工序;(2e)算出每个上述细胞的接触上述试样之后的荧光强度的上升速度的工序;(2f)选择上述细胞中对上述试样或任一上述标准试样所计算出的荧光强度的上升速度在前50%以内的任意的细胞的工序;及(2g)将工序2e中对上述试样所计算出的荧光强度的上升速度与工序2b及工序2c中对上述标准试样所计算出的荧光强度的上升速度进行比较,算出上述试样中的上述目标物质的浓度的工序,上述被比较的上升速度是对工序2f中被选择的细胞所计算出的上升速度,工序2a、2b、2c、2d、2e及2g以该顺序进行,工序2f在工序2b之后且工序2g之前的任意阶段进行。
上述方法可以使用微流路装置来实施。微流路装置具有:第一流路;第二流路,其与上述第一流路相邻;及联络部,其连接上述第一流路与上述第二流路,且在上述第一流路侧具有能够捕捉上述细胞的开口部。上述方法中,在上述工序2a之前,也可以包括以上述第一流路内的压力高于上述第二流路内的压力的方式,将包含上述多个细胞的悬浮液导入上述第一流路,并在上述第一流路侧的开口部捕捉上述细胞的工序。上述工序2a也可以包括:在维持上述第一流路与上述第二流路的压力差的状态下,将上述标准试样导入上述第一流路或上述第二流路,使上述标准试样接触上述被捕捉的细胞的工序。上述工序2d也可以包括:在维持上述第一流路与上述第二流路的压力差的状态下,将上述试样导入上述第一流路或上述第二流路,使上述试样接触上述被捕捉的细胞的工序。
在上述工序2f中,也可以选择上述细胞中对上述试样或任一上述标准试样所计算出的荧光强度的上升速度为前30%以内的任意的细胞。
上述任一方法中,上述荧光强度的上升速度可以为规定时间中It的时间变化率。It为(Ft-F0)/F0。F0表示接触上述试样或上述标准试样之前的上述细胞的荧光强度,Ft表示接触上述试样或上述标准试样之后且上述荧光强度达到平台期之前的任意阶段中的上述细胞的荧光强度。上述规定时间是接触上述试样或上述标准试样之后且上述荧光强度达到平台期之前的任意两个阶段之间的时间。上述荧光强度的上升速度可以为It的时间变化率的最大值。
本发明的其他方面的确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法依次包括如下工序:(3a)使包含已知浓度的目标物质的标准试样接触多个细胞的工序,上述细胞是具有上述目标物质的受体与荧光指示剂的细胞,上述荧光指示剂发出上述目标物质与上述受体的结合的结果的荧光;(3b)算出每个上述细胞的荧光强度的上升速度的工序;(3c)使用1个以上包含不同浓度的上述目标物质的标准试样,重复工序3a及工序3b的组合,对各标准试样计算出荧光强度的上升速度的工序;(3d)使包含未知浓度的目标物质的试样接触上述细胞的工序;(3e)算出每个上述细胞的接触上述试样之后的荧光强度的上升速度的工序;及(3f)将工序3e中对上述试样所计算出的荧光强度的上升速度与工序3b及工序3c中对上述标准试样所计算出的荧光强度的上升速度进行比较,算出上述试样中的上述目标物质的浓度的工序。
上述任一方法中,上述目标物质可以为有气味的物质,上述多个细胞可以为具有昆虫的嗅觉受体及钙敏感性荧光蛋白质的昆虫细胞。上述任一方法中,上述目标物质也可以为蚕蛾醛(Bombykal,以下简记为BAL),上述多个细胞也可以为具有BmOR-3蛋白质及GCaMP6s蛋白质的Sf21细胞。
发明的效果
通过使用本发明的方法所选择的细胞,能够以高灵敏度检测试样中的目标物质。另外,根据本发明的确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法,即便目标物质的浓度较低,也能够确定其浓度。
附图说明
图1是可以用于选择响应性高的细胞、及确定目标物质的浓度的微流路装置的示意图。
图2是可以用于选择响应性高的细胞、及确定目标物质的浓度的微流路装置的示意图。
图3是表示It的经时变化的曲线图。
图4是表示荧光强度的最大上升速度的分布的柱状图。(A)、(B)、(C)分别是使用了30000nM、3000nM、300nM的BAL溶液时的结果。
图5是表示图4的分布中前100%、30%、25%、及20%以内的值的平均值的曲线图。
具体实施方式
本发明的选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法包括如下工序:
(1a)使包含目标物质的试样接触多个细胞的工序;
(1b)算出每个上述细胞的荧光强度的上升速度的工序;及
(1c)选择上述多个细胞中显示出前50%以内的上述荧光强度的上升速度的任意的细胞的工序。
本发明中所使用的细胞为具有目标物质的受体和荧光指示剂的细胞。
目标物质并无特别限定,可以为:BAL、蚕蛾醇、1-辛烯-3-醇、土腥素、苯乙醇、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苄醇、水杨酸甲酯、苯甲醛、戊醛、己醛、E2-己醛、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-甲基苯酚等有气味的物质。
目标物质的受体并无特别限定,例如可以为上述的有气味的物质的受体。有气味的物质的受体例如可以为蚕蛾、黑腹果蝇、疟蚊等昆虫的嗅觉受体。作为蚕蛾的嗅觉受体,例如可以列举作为BAL的受体的BmOR-3蛋白质、及作为蚕蛾醇的受体的BmOR-1蛋白质。作为黑腹果蝇的嗅觉受体,例如可以列举作为1-辛烯-3-醇的受体的Or13a蛋白质、及作为土腥素的受体的Or56a蛋白质。
荧光指示剂只要是发出目标物质与受体的结合的结果的荧光的物质就并无特别限定。荧光指示剂例如可以为荧光蛋白质或荧光色素。荧光指示剂优选为经遗传性编码的荧光蛋白质。例如,在目标物质与受体的结合引起细胞内的离子浓度的变化的情况下,荧光指示剂可以是对该离子具有敏感性的荧光蛋白质或荧光色素。荧光蛋白质的例子为作为钙敏感性荧光蛋白质的、GCaMP3蛋白质、GCaMP6s蛋白质、及GCaMP7蛋白质。荧光色素的例子为Fluo 3-AM、Rhod 2-AM、Calbryte(商标)520、Fluo 4-AM、Fura 2-AM、Indo 1-AM、Calbryte590、Calbryte 630等钙敏感性荧光色素。
细胞也可以进一步包含辅助受体。作为辅助受体的例子,可以列举作为昆虫的嗅觉受体的辅助受体的Orco蛋白质。
细胞例如可以是来自草地贪夜蛾的细胞。作为来自草地贪夜蛾的细胞,例如可以列举Sf21及Sf9。
在工序1a中,使包含目标物质的试样接触多个细胞。通过使试样接触细胞,试样中的目标物质与受体结合,其结果,荧光指示剂发出荧光。例如,在受体为BmOR-3蛋白质等钙离子通道的情况下,目标物质对受体的结合引起钙离子流入细胞内。钙离子与存在于细胞内的钙敏感性荧光指示剂结合,荧光指示剂发出荧光。通过使试样继续接触细胞,细胞内的钙浓度上升,且自细胞发出的荧光的强度也上升,但是钙离子进入细胞内的速度逐渐降低,细胞内钙浓度达到平台期(固定),因此,荧光强度也成为平台期。
使试样接触细胞的方法并无特别限定,在试样为液体的情况下,例如可以将细胞浸渍于试样中规定时间,也可以将试样以规定的流速流动,将细胞配置在该流体中。在试样为气体的情况下,例如可以将细胞配置在充满试样的空间。工序1a中试样的浓度可以是未知,也可以是已知。
在工序1b中,算出每个细胞的荧光强度的上升速度。荧光强度可以是测定值本身(绝对值),也可以是相对于接触试样之前的细胞的荧光强度等的相对值。荧光强度的上升速度可以是规定时间中绝对或相对的荧光强度的时间变化率。
在利用规定时间中绝对的荧光强度的时间变化率作为荧光强度的上升速度的情况下,荧光强度的上升速度可以通过计算规定时间中Ft的时间变化率dFt/dt而求出。在此,Ft表示接触试样之后且荧光强度达到平台期之前的任意阶段中细胞的荧光强度(测定值本身)。规定时间是指接触试样之后且荧光强度达到平台期之前的任意两个阶段之间的时间。dFt/dt也可以通过算出相对于接触试样后所经过的时间对Ft进行作图所获得的曲线的斜率而求出。作为荧光强度的上升速度,也可以利用dFt/dt的最大值。
作为一例,如果将接触试样后经过时间t1、t2后的阶段中细胞的荧光强度分别用Ft1、Ft2表示,则荧光强度的上升速度可以使用下式(1)计算。
荧光強度的上升速度=(Ft2-Ft1)/(t2-t1)···(1)
其中,接触试样后经过时间t1后的阶段及经过时间t2后的阶段均是荧光强度达到平台期之前的阶段,且t2>t1。
在利用规定时间中相对的荧光强度的时间变化率作为荧光强度的上升速度的情况下,荧光强度的上升速度可以通过计算规定时间中Ft/F0的时间变化率d/dt(Ft/F0)而求出。在此,F0表示接触试样之前的细胞的荧光强度(测定值本身)。规定时间是指接触试样之后且荧光强度达到平台期之前的任意两个阶段之间的时间。作为一例,荧光强度的上升速度可以使用下式(2)计算。
荧光强度的上升速度=(Ft2-Ft1)/F0/(t2-t1)···(2)
或者,荧光强度的上升速度可以通过计算规定时间中It的时间变化率dIt/dt而求出。在此,It为(Ft-F0)/F0。规定时间是指接触试样之后且荧光强度达到平台期之前的任意两个阶段之间的时间。dIt/dt也可以通过算出相对于接触试样后所经过的时间对It进行作图所获得的曲线的斜率而求出。作为荧光强度的上升速度,也可以利用dIt/dt的最大值。作为一例,荧光强度的上升速度可以使用下式(3)计算。如果将式(3)变形,则可以得到与式(2)相同的式子。
荧光强度的上升速度=(It2-It1)/(t2-t1)···(3)
在工序1c中,选择全部细胞中显示出前50%以内的荧光强度的上升速度的任意的细胞。优选选择全部细胞中荧光强度的上升速度的最大值在前50%、40%、30%、25%、或20%以内的细胞。所选择的细胞可以为荧光强度的上升速度在前50%以内的细胞中的全部细胞,也可以为其中的部分细胞。
首先回收被选择的细胞,然后,可以将其用于试样中的目标物质的检测或其浓度的确定。或者,可以不回收被选择的细胞而直接用于试样中的目标物质的检测或其浓度的确定。通过本发明的方法所选择的细胞针对目标物质表现出高响应性,因此,通过使用本发明的细胞,能够以高灵敏度检测试样中的目标物质。
使用被选择及回收的细胞检测试样中的目标物质或确定其浓度的方法并无特别限定,可以使用公知的方法。例如,可以通过使用公知的方法培养被回收的细胞,分析使试样接触培养细胞时所发出的荧光,从而检测试样中的目标物质或确定其浓度。但是,在被选择的细胞所具有的荧光指示剂未经遗传性编码的情况下,荧光色素等荧光指示剂需要存在于培养细胞内。为了检测目标物质及确定其浓度,可以利用荧光强度的上升速度,也可以利用在荧光强度达到平台期之前的任意阶段或达到了平台期的阶段的荧光强度。
也可以不回收被选择的细胞而直接用于试样中的目标物质的检测。在此情况下,通过使可能包含目标物质的试样至少接触全部细胞中上述被选择的细胞,分析自上述被选择的细胞所发出的荧光,从而能够检测试样中的目标物质的存在。
也可以不回收被选择的细胞而直接用于试样中的目标物质的浓度的确定。即,本发明还提供一种确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法,所述方法包括如下工序:
(2a)使包含已知浓度的目标物质的标准试样接触多个细胞的工序;
(2b)算出每个上述细胞的荧光强度的上升速度的工序;
(2c)使用1个以上包含不同浓度的上述目标物质的标准试样,重复工序2a及工序2b的组合,对各标准试样计算出荧光强度的上升速度的工序;
(2d)使包含未知浓度的目标物质的试样接触上述细胞的工序;
(2e)算出每个上述细胞的接触上述试样之后的荧光强度的上升速度的工序;
(2f)选择上述细胞中对上述试样或任一上述标准试样所计算出的荧光强度的上升速度在前50%以内的任意的细胞的工序;及
(2g)将工序2e中对上述试样所计算出的荧光强度的上升速度与工序2b及工序2c中对上述标准试样所计算出的荧光强度的上升速度进行比较,算出上述试样中的上述目标物质的浓度的工序。其中,工序2g中所比较的上升速度是对工序2f中被选择的细胞所计算出的上升速度。另外,工序2a、2b、2c、2d、2e、及2g按该顺序进行,工序2f在工序2b之后且工序2g之前的任意阶段进行。
工序2a~工序2c涉及使用了标准试样时的细胞的荧光强度的上升速度的测定。工序2a及工序2b的详细情况如对工序1a及工序1b所说明的。但是,在工序2a及工序2b中,使用包含已知浓度的目标物质的标准试样来代替试样。工序2c中,通过使用1个以上的标准试样重复工序2a及工序2b的组合,使目标物质的浓度与各细胞的荧光强度的上升速度相对应。也可以制作表示目标物质的浓度与各细胞的荧光强度的上升速度的关系的校准曲线。所使用的标准试样的数量并无特别限定,通过使用更多的标准试样,能够制作更加准确的校准曲线,因此,能够更加准确地确定试样中的目标物质的浓度。
工序2d及工序2e涉及使用了包含未知浓度的目标物质的试样时的细胞的荧光强度的上升速度的测定。工序2d及工序2e的详细情况如对工序1a及工序1b所说明的。但是,工序2d及工序2e中,使用包含未知浓度的目标物质的试样。
工序2f涉及细胞的选择。工序2f的详细情况如对工序1c所说明的。但是,工序2f中,细胞的选择基于工序2b、工序2c、及工序2e的任一者中所获得的荧光强度的上升速度的数据来进行。换而言之,工序2f中,可以选择全部细胞中工序2b所计算出的上升速度在前50%以内的细胞,也可以选择全部细胞中工序2c所计算出的上升速度在前50%以内的细胞,也可以选择全部细胞中工序2e所计算出的上升速度在前50%以内的细胞。即,本工序只要在工序2b之后,可以在工序2c之前进行,也可以在工序2d之前进行。
在工序2b与工序2c之间进行细胞的选择(工序2f)的情况下,工序2c及工序2e中荧光强度的上升速度的测定无需对全部细胞进行,只要至少对工序2f中被选择的细胞进行便足够。因此,工序2c及工序2d中,只要使标准试样或试样至少接触工序2f中被选择的细胞便足够。同样地,在工序2c与工序2d之间进行细胞的选择(工序2f)的情况下,工序2e中荧光强度的上升速度的测定无需对全部细胞进行,只要至少对工序2f中被选择的细胞进行便足够。另外,工序2d中,只要使试样至少接触工序2f中被选择的细胞便足够。
工序2g涉及试样中的目标物质的浓度的确定。本工序中,例如通过使用校准曲线,将对包含未知浓度的目标物质的试样所计算出的荧光强度的上升速度的值(工序2e)与对标准试样所计算出的荧光强度的上升速度的值(工序2b及工序2c)进行比较,确定试样中的目标物质的浓度。
根据上述实施方式的确定试样中的目标物质的浓度的方法,基于针对目标物质表现出高响应性的细胞的荧光来确定浓度,因此,能够以高灵敏度检测试样中的目标物质,因此,即便目标物质的浓度较低,也能够确定其浓度。另外,根据上述实施方式的确定试样中的目标物质的浓度的方法,将荧光强度的上升速度用作用于确定浓度的指标,因此,能够在荧光强度达到平台期之前确定浓度。因此,与基于在平台期的荧光强度来确定浓度的现有技术相比,能够更加快速地确定试样中的目标物质的浓度。
再者,从以高灵敏度检测目标物质的观点出发,选择荧光强度的上升速度快的细胞的工序2f是重要的,但如果目标物质的浓度高于检测限,则也存在不要求高灵敏度的情况。因此,本发明的其他方面提供一种确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法,所述方法依次包括如下工序:
(3a)使包含已知浓度的目标物质的标准试样接触多个细胞的工序;
(3b)算出每个上述细胞的荧光强度的上升速度的工序;
(3c)使用1个以上包含不同浓度的上述目标物质的标准试样,重复工序3a及工序3b的组合,对各标准试样算出荧光强度的上升速度的工序;
(3d)使包含未知浓度的目标物质的试样接触上述细胞的工序;
(3e)算出每个上述细胞的接触上述试样之后的荧光强度的上升速度的工序;及
(3f)将工序3e中所计算出的试样的上升速度与工序3b及工序3c中所计算出的标准试样的上升速度进行比较,算出上述试样中的上述目标物质的浓度的工序。
工序3a~3f的详细情况如对工序2a~2e及2g所说明的。但是,工序3f中所比较的上升速度可以是对全部细胞所计算出的上升速度,也可以是对任意的一部分细胞所计算出的上升速度。根据上述其他实施方式的确定试样中的目标物质的浓度的方法,由于利用荧光强度的上升速度作为用于确定浓度的指标,因此,能够在荧光强度达到平台期之前确定浓度。因此,与基于在平台期的荧光强度来确定浓度的现有技术相比,能够更快速地确定试样中的目标物质的浓度。尤其是,在试样中的目标物质的浓度较低的情况下,由于直到荧光强度达到平台期要花费较长时间,因此,能够在达到平台期之前确定浓度的本方法有用。
本发明的选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法、及确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法可以使用各种装置。例如,可以将包含目标物质的试样导入保存有细胞的流动槽内,如上所述分析自细胞所发出的荧光。或者,也可以使用具备多个能够捕捉单一细胞的凹部的装置。可以在凹部捕捉了细胞之后,将包含目标物质的试样导入凹部,如上所述分析自细胞所发出的荧光。进而,也可以使用具有微细流路的微型装置。
图1表示微流路装置的一例。图1所示的微流路装置10具备:在一个主面具有叉状的槽的基板2、及层叠于基板2的形成有槽一侧的主面的盖板玻璃1。设置于基板2的槽具有:流路3;3个注入口4、5及6,它们设置在流路3的一端;及注出口7,其设置在流路3的另一端,且槽呈叉状的形状。基板2并无特别限定,例如可以为硅橡胶(例如二甲基聚硅氧烷)等的树脂制。在基板2为树脂制的情况下,流路3、注入口4、5及6、以及注出口7可以通过光刻法容易地形成。3个注入口4、5及6也可以分别连接填充有细胞悬浮液或溶液的注射器(未图示)。自注入口4、5及6导入流路3的细胞悬浮液或溶液自注出口7排出至微流路装置10之外。流路3的表面根据需要可以使用聚赖氨酸、聚乙二醇(PEG)磷脂质等细胞粘附性基材修饰。
微流路装置10例如可以以如下方式用于选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法。首先,使用细胞粘附性基材修饰流路3的表面。分别将注射器S4、S5、S6与注入口4、5、6连接。在注射器S4、S5、S6中分别填充有细胞悬浮液、缓冲液、包含目标物质的试样。缓冲液例如可以为林格氏液(40mM NaCl、5.6mM KCl、4.5mM CaCl
或者,微流路装置10也可以例如以如下方式用于选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法。首先,分别将注射器S4、S5、S6与注入口4、5、6连接。在注射器S4及S6中填充有包含目标物质的试样,注射器S5中填充有细胞悬浮液。自注射器S4、S5及S6,同时将细胞悬浮液或试样导入流路3。通过调整注射器S4、S5及S6的压力,在流路3内形成由细胞悬浮液的层及夹着该层的2个试样层构成的3层的层流。在此,优选将细胞悬浮液的层的宽度调整为细胞在层内排列成一列。试样中的目标物质在层流内扩散,在流路3的下游,扩散后的目标物质在细胞悬浮液的层内与细胞接触(工序1a)。分析自细胞所发出的荧光,选择上述方法中响应性高的细胞(工序1b、1c)。细胞保持排列成一列地经由注出口7被排出至微流路装置10之外,因此,可以根据需要自所排出的细胞仅回收上述被选择的细胞。微流路装置10同样也可以用于确定试样中的目标物质的浓度的方法。
图2表示微流路装置的其他例子。图2的(A)所示的微流路装置40具备:流路23、与流路23邻接的流路24、及连接流路23与流路24的联络部30。流路23、流路24、及联络部30均为设置于基板22的槽,在基板22的形成有槽一侧的主面层叠有盖板玻璃21。基板22并无特别限定,例如可以为硅橡胶(例如二甲基聚硅氧烷)等树脂制。在基板22为树脂制的情况下,流路23、流路24、及联络部30可以通过光刻法容易地形成。
在流路23设置有液体的注入口25及26、以及注出口28,在流路24设置有液体的注入口27及注出口29。将包含细胞C的悬浮液注入至注入口25。将试样、标准试样、缓冲液等其他溶液注入剩余的注入口。自注入口25及26导入流路23的细胞悬浮液或溶液自注出口28被排出至微流路装置40之外,自注入口27导入流路24的溶液自注出口29被排出至微流路装置40之外。悬浮液及溶液例如可以使用注射器注入至注入口。注入口的数量可以仅是使用的溶液的数量,只要是对于一个流路至少有一个注入口即足够。因此,可以无注入口26,也可以在流路24及/或23追加1个以上的注入口。
图2的(B)表示联络部30的放大图。联络部30具有:连接流路23与流路24的孔32、及能够捕捉细胞C的开口部(开口端)31。在此,能够捕捉细胞C是指在流路23内的压力比流路24内的压力高的条件下,能够将存在于流路23内的细胞C保持在流路23侧的开口部31。在图2中,虽然开口部31形成凹处,但是开口部31的形状只要是能够捕捉细胞C的形状就并无特别限定。联络部30需要是细胞C不能穿过的形状。因此,孔32的孔径优选足够小于细胞C的直径。例如,在细胞为Sf21的情况下,孔32的孔径可以为1μm~15μm。另外,图2中联络部30经由孔32将流路23与流路24相连接,但是也可以将孔32替换为狭缝。开口部31只要设置在存在细胞C的流路23侧即可,不需要在流路24侧设置开口部。
接着,对使用微流路装置40选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法的几个例子进行说明。
在使用微流路装置40的情况下,上述工序1a例如可以包括如下工序:
(A1)以流路23内的压力高于流路24内的压力的方式,将包含多个细胞C的悬浮液导入流路23,并在流路23侧的开口部31捕捉细胞C的工序;和
(A2)在维持流路23与流路24的压力差的状态下,将包含目标物质的试样导入流路23,使包含目标物质的试样接触被捕捉的细胞C的工序。
在工序A1中,可以经由注入口25将细胞悬浮液流入流路23。在将包含细胞C的悬浮液流入流路23的期间,可以经由注入口27将林格氏液等缓冲液流入流路24。产生流路23与流路24的压力差的方法并无特别限定。例如,在流路23与流路24的形状相同的情况下,通过使将细胞悬浮液导入流路23的注射器的驱动压力高于将缓冲液导入流路24的注射器的驱动压力,从而能够使流路23内的压力高于流路24内的压力。
在工序A2中,可以停止注入细胞悬浮液,经由注入口26将试样导入流路23。此时,可以继续将缓冲液流入流路24。流路23与流路24的压力差可以通过调整注射器的驱动压力保持固定。通过使试样接触被开口部31捕捉的细胞C所发出的荧光,在工序1b如上所述被分析,在接着的工序1c中选择响应性高的细胞。
工序1c中被选择的细胞可以通过包括如下工序的方法回收:
(1d)以流路24内的压力高于流路23内的压力的方式,将液体导入流路24,自开口部31释放被捕捉的细胞C的工序;
(1e)自被释放的细胞C中回收上述被选择的任意的细胞的工序。
在工序1d中,导入流路24的液体并无限定,例如可以为缓冲液。使流路23与流路24的压力差反转的方法并无特别限定。例如,在流路23与流路24的形状相同的情况下,通过使将试样导入流路23的注射器的驱动压力低于将缓冲液导入流路24的注射器的驱动压力,能够使流路24内的压力高于流路23内的压力。通过使压力差反转所释放的细胞C可以自注出口28回收。
图2所示的微流路装置40中,在流路24仅设置有一个注入口,但也可以在流路24再追加一个注入口(以下称为注入口27b)。在此情况下,工序A2中可以将试样经由注入口27b而不是流路23导入流路24。此时,可以经由注入口26将缓冲液导入流路23。工序1d中通过使将缓冲液导入流路23的注射器的驱动压力低于将试样导入流路24的注射器的驱动压力,能够使流路24内的压力高于流路23内的压力。
在上述的例子中,对每个使用的悬浮液及溶液分别设置注入口的例进行了说明,但是也可以自单一的注入口将悬浮液及多个溶液导入流路23或24内。
微流路装置40也可以用于本发明的确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法。在使用微流路装置40的情况下,在上述工序2a之前,通过与上述工序A1相同的工序,在流路23侧的开口部31捕捉细胞C。另外,在工序2a中,通过与上述工序A2相同的方法使标准试样接触被捕捉的细胞C。进而,在工序2d中,通过与上述工序A2相同的方法,使包含未知浓度的目标物质的试样接触被捕捉的细胞C。
实施例
将2张涂布有真空润滑脂的纸(25mm×5mm)配置于载玻片上,在其上重叠盖板玻璃(18mm×18mm)。纸以隔开5mm的间隔相互平行的方式配置。载玻片的表面吸附牛血清白蛋白(BSA)之后,通过作为细胞粘附性基材的PEG磷脂质(BAM)修饰。将该装置用作流动槽。
将具有BmOR-3蛋白质、GCaMP6s蛋白质、Orco蛋白质的Sf21细胞悬浮于培养基,并导入流动槽。在细胞粘附于载玻片的表面后,将缓冲液导入流动槽,冲洗未粘附的细胞以及培养基。使用林格氏液作为缓冲液。
将流动槽置于荧光显微镜,观察100个细胞的荧光。将包含30nM的BAL的缓冲液导入流动槽,观察并记录细胞的荧光图像数分钟。根据荧光图像求出每个细胞的刚要导入BAL溶液之前的荧光强度F0、及导入BAL溶液之后的荧光强度Ft,算出下式所示的It,并经时地进行记录。
It=(Ft-F0)/F0×100(%)
使用300nM、3000nM、及30000nM的BAL溶液进行了同样的实验。将表示It的经时变化的曲线图示于图3。
对图3所示的It的曲线以固定的时间宽度重复直线拟合,求出曲线的斜率的经时变化。曲线的斜率表示荧光强度的上升速度。求出每个细胞的斜率的最大值,制作图4所示的斜率的最大值的柱状图。图4的(A)、(B)、(C)分别为使用了30000nM、3000nM、300nM的BAL溶液时的结果。根据柱状图,针对每个BAL溶液的浓度选择前100%以内(即,全部细胞)、前30%、25%、或20%以内的全部值,并计算各个的平均值。将结果示于图5。
符号的说明:
1、21…盖板玻璃,2、22…基板,3、23、24…流路、4、5、6、25、26、27…注入口,7、28、29…注出口,10、40…微流路装置,30…联络部,31…开口部,32…孔,C…细胞。
- 选择针对目标物质的响应性高的细胞的方法、及确定试样中未知浓度的目标物质的浓度的方法
- 检测至少一种气态目标物质的浓度的方法和装置以及气体监控装置的使用