一株牛支原体Mbov_0703基因突变株及其应用

技术领域

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一株牛支原体基因突变株，该菌株由于Mbov_0703基因发生突变从而导致毒力致弱和抗逆性能下降。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis，M.bovis)属厚壁菌门、柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属，是感染肉牛和奶牛的重要病原体，临床上可导致肺炎、乳腺炎、中耳炎、关节炎、滑膜炎、角膜结膜炎、脑膜炎、心肌炎、生殖系统紊乱等疾病(石磊等,2008)。当前，由于抗生素的耐药性增加和缺乏有效的疫苗，牛支原体病的防治已成为影响养牛业发展的重要难题，而这一问题的解决依赖于新型药物和有效疫苗的开发。研究认为，支原体中的毒力因子主要包括黏附素，侵袭素，类毒素，外毒素以及致病性酶和膜脂蛋白等(Qin et al.,2019)。然而，迄今为止，牛支原体的分子调控机制和典型毒力因子仍然不清楚。

热休克蛋白是生物体内一类在热刺激、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的蛋白(刘志宗等,2009)。许多热休克蛋白具有分子伴侣活性，它们通过控制、结合和释放来帮助错误折叠蛋白回到原来的状态，而维持细胞稳态。基因序列分析发现，牛支原体中的热休克蛋白有DnaK(Mbov_0157),DnaJ(Mbov_0641),ClpB(Mbov_0703),GrpE(Mbov_0817)等(Qi et al.,2012)。其中ClpB是一类属于HSP100/Clp(Caseinolyticprotease)家族的热休克蛋白，广泛存在于真核及原核生物中，是AAA+(ATPase associatedwith a variety of cellular activities)蛋白家族中的一员(Kedzierska-Mieszkowskaand Arent,2020)。

构建转座子突变体文库是鉴定支原体基因功能的一种有效途经，根据突变株表型变化来确定基因产物的功能(Zhu et al.,2020)。本申请人从前期构建的牛支原体转座子突变体库中筛选到一株牛支原体突变株T9.210，其缺失了牛支原体Mbov_0703基因编码的蛋白MbovP0703(ClpB)，经实验证实该突变株黏附细胞和诱导细胞炎性反应的能力降低，生物膜形成能力降低，在热刺激后突变株存活能力降低，以上结果表明，该突变株较野生株和回补株毒力降低，可望运用于牛支原体免疫防治领域，同时还有助于揭示牛支原体毒力机制和免疫制剂的研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一株牛支原体基因突变株T9.210，该基因的编码蛋白为MbovP0703(ClpB)，该蛋白具有ATP酶活性和伴侣蛋白功能。经验证，该突变菌株黏附牛肺上皮细胞的能力比野生株和回补株均显著降低，同时，诱导牛巨噬细胞产生炎性因子IL-1β，IL-6,TNF-α的水平也降低，产生生物膜的水平降低，热刺激条件下菌株存活能力降低。黏附和诱导细胞因子分泌是支原体实现感染的重要指标，也是与毒力相关的生物学特性，而菌膜的生成则有助于细菌抵抗环境因素和宿主防御系统，增强细菌的环境适应能力。因此推测突变菌株T9.210可能相比牛支原体野生株毒力和抗逆性能降低，可望成为牛支原体新型疫苗候选菌株，在牛支原体免疫防治领域发挥重要作用。

具体的，本发明的技术方案如下所述：

申请人以牛支原体HB0801为亲本菌株，首先利用PEG介导的转化方法，将含有转座子的pMT85质粒体外转化至牛支原体野生株HB0801中，利用庆大霉素进行抗性筛选，成功构建了牛支原体HB0801全基因组的突变体库(Zhu et al.,2020)。经转座子测序，从突变体库中成功鉴定出一株基因突变株T9.210，该菌株含有突变基因Mbov_0703，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，序列长度为2169bp，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示，该蛋白具有ATP酶活性和伴侣蛋白功能。通过western blot验证了突变株T9.210中MbovP0703蛋白不表达。

申请人将突变菌株命名为牛支原体T9.210(Mycoplasma bovis T9.210)，于2022年3月15日保藏于中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2022260。

本发明所述的牛支原体MbovP0703缺失/回补株构建及功能分析包括下列步骤：利用转座子Tn4001随机插入突变技术构建了突变体库，根据测序信息筛选出Mbov_0703基因缺失的突变体T9.210，后期通过Western blot验证T9.210菌株不表达MbovP703蛋白；回补菌株的构建首先包括克隆Mbov_0703基因，并将该基因连接至pOH/P质粒，获得回补质粒后，转化重组质粒至缺失菌株中，并通过抗生素筛选获得回补菌株CT9.210，后期通过Westernblot方法验证MbovP703蛋白在回补菌株中表达。

检测缺失株和回补株与HB0801株生长曲线及菌落形态，发现无统计学差异。将培养至对数期的各菌株在42℃培养条件下分别孵育15min,60min,120min，结果发现，与野生株和回补株相比，突变株在热处理60min后存活能力显著降低。

对所述的牛支原体MbovP703缺失/回补株生物膜的形成能力进行测定结果发现，与野生株和回补株相比，突变株的生物膜形成明显减少。

对所述的牛支原体MbovP703缺失/回补株对宿主细胞的黏附和炎性反应进行检测，利用牛肺上皮细胞黏附模型和牛肺巨噬细胞炎性模型，与野生株和回补株相比，在黏附0.5h、1h后发现，T9.210突变株表现为黏附牛肺上皮细胞(EBL)显著降低；与野生株相比，在感染24h后，发现T9.210突变株诱导牛肺巨噬细胞(BoMac)细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-αmRNA水平显著降低。

综合以上结果可以看出，MbovP0703突变菌株T9.210黏附牛肺上皮细胞的能力比野毒株和回补株显著降低，同时，诱导牛巨噬细胞产生炎性因子IL-1β，IL-6,TNF-α的水平也降低，产生生物膜的水平降低，热刺激条件下该突变菌株存活能力降低，由此判断该突变株毒力致弱且抗逆性能下降，具有成为牛支原体新型疫苗的潜力。

本发明具有以下优点：

(1)本发明的T9.210菌株是发明人从牛支原体基因缺失突变体库中通过大量随机筛选而获得，本发明不仅验证了该菌株的表型和功能，而且还对突变位点进行了鉴定，证实其发生突变的基因是Mbov_0703基因。

(2)本发明提供的牛支原体基因突变株黏附细胞的能力和诱导炎性反应的能力降低，生物膜形成能力降低，从而毒力致弱和抗逆性能下降，能更好地应用于疫苗。

更详细的发明方案见具体实施例。

附图说明

图1：是缺失株T9.210和回补菌株CT9.210的Western blot检测、生长曲线和菌落形态。附图标记说明：HB0801：牛支原体野生株HB0801株；T9.210：Mbov_0703缺失株；CT9.210：Mbov_0703回补菌株。A：Western blot验证野生株及缺失/回补株中MbovP703蛋白的表达，MbovP703：鼠抗MbovP703多克隆抗体；MbovP481：鼠抗MbovP481多克隆抗体；MbovP310：鼠抗MbovP310多克隆抗体。B：缺失/回补株在PPLO培养基中生长曲线分析图。C：野生株及MbovP703缺失/回补株中的菌落形态图。

图2：Mbov_0703基因序列中转座子插入突变位点。图中：紫色方框所示序列为转座子与HB0801基因组连接处测序序列，所示方向为转座子相对基因组的插入方向。

图3：是牛支原体突变株T9.210与野生株/回补株在42℃热刺激条件下的存活能力检测图。附图标记说明：“*”表示P﹤0.05，“***”表示P﹤0.001。

图4：是牛支原体突变株T9.210与野生株/回补株生物膜结晶紫染色图(A)及OD580测定结果(B)。“*”表示P﹤0.05,“***”表示P﹤0.001，“****”表示P﹤0.0001。

图5：是牛支原体突变株T9.210与野生株/回补株感染牛肺上皮细胞EBL后黏附能力定量检测分析。附图标记说明：“*”表示P﹤0.05。

图6：是牛支原体突变株T9.210与野生株/回补株感染牛肺巨噬细胞BoMac后IL-1β,IL-6,TNF-αmRNA表达水平检测分析。附图标记说明：“*”表示P﹤0.05,“**”表示P﹤0.01。

具体实施方式

实施例1：牛支原体Mbov_0703基因缺失/回补株构建与鉴定

1.1牛支原体Mbov_0703基因缺失/回补株构建

从实验室前期构建的牛支原体突变体库中筛选出Mbov_0703基因缺失菌株T9.210，并且通过Western blot在蛋白水平上验证Mbov_0703基因缺失；回补突变体的构建如下：以牛支原体基因组为模板，扩增Mbov_0703基因，将目的片段克隆至pOH/P质粒，获得回补质粒；利用PEG8000(购自SIGMA)介导的转化方法，将构建好的重组质粒转化至Mbov_0703基因缺失菌株中，在固体培养基中培养3-7天，利用抗性挑选阳性克隆。将阳性克隆扩大培养后，提取菌体的总蛋白，利用Western blot方法验证重组菌中MbovP0703蛋白的表达。在PPLO完全培养基中，检测突变菌株/回补菌株的生长曲线并与野生株比较，确定突变菌株/回补菌株的生长未受到影响。结果显示MbovP703蛋白在缺失株T9.210中不表达，在回补菌株CT9.210中表达，且缺失株T9.210和回补菌株CT9.210与野生株HB0801生长曲线和菌落形态无差异(图1)。

1.2T9.210菌株突变基因的鉴定

利用细菌基因组提取试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司)，提取牛支原体T9.210突变体全基因组，对Tn4001转座子与牛支原体基因组连接处进行测序，将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对，结果显示，T9.210突变基因为Mbov_0703，转座子插入位点位于基因组836459位点后，位于Mbov_0703基因1464位点后(图2)。

实施例2：突变株的环境抵御和菌膜形成能力

2.1牛支原体突变株T9.210在热刺激条件下的存活能力测定

取1ml生长于对数期的牛支原体HB0801，突变株T9.210以及回补菌株CT9.210分别进行菌落计数，根据计数结果统一调整为10

2.2牛支原体突变株T9.210的生物膜形成测定

取生长于对数期的牛支原体HB0801,突变株T9.210以及回补菌株CT9.210，分别吸取10μl菌液加入48孔细胞培养板中，每孔补加1ml PPLO完全培养基，每株菌液设4个重复，静置在37℃，5％CO

菌膜的生成有助于细菌抵抗环境因素和宿主防御系统，增强细菌的环境适应能力，从而使其更不容易被机体或药物所清除，而菌膜形成能力的下降则有助于降低细菌的抗逆性。

实施例3：突变株对牛肺上皮细胞EBL黏附能力的测定

取适量计数好的牛支原体HB0801,突变株T9.210以及回补菌株CT9.210用PBS洗涤3次，并用细胞培养基DMEM进行等体积重悬，按照感染比(MOI)为1000的比例感染EBL细胞，在37℃，5％CO

实施例4：突变株诱导牛肺巨噬细胞BoMac产生炎性因子的mRNA表达测定

取适量计数好的牛支原体HB0801,突变株T9.210以及回补菌株CT9.210用PBS洗涤3次，并用细胞培养基DMEM进行等体积重悬，按照感染比(MOI)为1000的比例感染BoMac细胞，同时设置牛支原体野毒株HB0801株，回补菌株为平行对照，设置不处理组为空白对照，分别在37℃，5％CO

将所有样品从-80℃拿出来放到室温融化，每孔加入0.2mL氯仿，振荡15s，室温静置2-5min，在4℃，12000rpm离心15min，取上层液体(500μL)至另一无RNA酶的EP管中，加入预冷的异丙醇(500μL)，混匀后室温静置10min,然后在4℃,12000rpm离心10min，弃掉上清用75％的乙醇清洗沉淀；最后在超净台里晾干15-20min，加入适量DEPC水在58℃水浴锅中溶解10min,吸出2μL进行RNA浓度测定。

取1μg RNA，利用诺唯赞反转录试剂盒进行反转录，将产物进行10倍稀释，按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行反应体系配制，根据qPCR引物，具体序列如下(表1)。用SYBRGreen qPCR Mix进行相对定量PCR反应。反应体系如下：qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，ROX Reference Dye 0.4μL，模板DNA(稀释10倍)2μL，灭菌蒸馏水补至20μL。荧光定量反应条件为：95℃，1min，预变性；95℃，30s，60℃，30s；72℃，45s，40个循环；每个样品均设置内参基因和目的基因进行扩增，每个反应设置3个重复。

表1荧光定量引物序列

结果显示，与野生株HB0801和回补株CT9.210相比，在感染后24h突变株T9.210产生IL-1β，IL-6，TNF-αmRNA表达量均有显著降低(图6)。

综上所述，与牛支原体野生株比较，含有Mbov_0703基因的牛支原体突变株T9.210表现出ClpB蛋白缺失，该突变株热处理条件下菌株活力降低，生物膜形成减少，对细胞的黏附和诱导炎性反应的能力降低等特征，这些特征导致该突变株可能在牛支原体致病和免疫防制中具有潜在应用前景。

名词术语说明：

牛支原体Mbov_0703编码蛋白：以MbovP0703或ClpB表示。

牛支原体Mbov_0703基因突变株：以牛支原体T9.210表示。

牛支原体野生株：以牛支原体HB0801表示。

对序列表的说明：

SEQ ID NO:1是本发明的牛支原体蛋白基因Mbov_0703的核苷酸序列，序列长度为2169bp。

SEQ ID NO:2是牛支原体蛋白基因Mbov_0703编码的蛋白质序列。

参考文献：

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<120> 一株牛支原体Mbov_0703基因突变株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2169

<212> DNA

<213> 牛支原体（Mycoplasma bovis）

<400> 1

atggaattta actttgaaga tttatttaac aacatctcag acaataataa aaataaaagt 60

gctgaaaatg atccacttaa aatttatggt cgtaatctaa ctgatttagc agctaaacat 120

gaattagagc ctgttatcaa tagagatgat gaaattagac gtttaattcg tattttaagt 180

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ttactttttg atgaaattga gaaagctgat agaaatgttt taaatatctt gctacaaatt 1680

ctagataatg gagcctttac agattcaaca ggaagagtaa ttaactgtag aaatttaatt 1740

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cctagtctta aagcagagtt acttaaattc ttaagcccgg aatttgtaaa tagaattgat 1860

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cttcaaaaat taattaaaag aatttatgac agcaaggaag ttacactaaa atattcacca 1980

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attcaaaaga atcataaata cgaaatcaca gttttcgcca acaaattcat agtttcaaaa 2160

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<211> 722

<212> PRT

<213> 牛支原体（Mycoplasma bovis）

<400> 2

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1 5 10 15

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Leu Thr Asp Leu Ala Ala Lys His Glu Leu Glu Pro Val Ile Asn Arg

35 40 45

Asp Asp Glu Ile Arg Arg Leu Ile Arg Ile Leu Ser Arg Lys Thr Lys

50 55 60

Asn Asn Pro Val Leu Val Gly Glu Pro Gly Val Gly Lys Thr Ala Ile

65 70 75 80

Val Glu Gly Leu Ala Arg Lys Ile Val Glu Gly Glu Val Pro Glu Asn

85 90 95

Leu Lys Asn Lys Asp Val Tyr Glu Ile Asp Leu Ala Ser Leu Ile Ala

100 105 110

Gly Ala Gln Phe Gln Gly Gln Phe Glu Lys Arg Leu Lys Asp Val Leu

115 120 125

Lys Arg Ile Glu Asp Ser Asn Gly Glu Ile Ile Val Phe Ile Asp Glu

130 135 140

Ile His Met Leu Val Gly Thr Gly Lys Asn Ala Asp Gly Gly Met Asp

145 150 155 160

Ala Ala Asn Ile Val Lys Pro Leu Met Ala Arg Gly Lys Met His Leu

165 170 175

Ile Gly Ala Thr Thr Tyr Asn Glu Tyr Arg Lys Tyr Ile Glu Lys Asp

180 185 190

Ala Ala Leu Glu Arg Arg Met Gln Lys Val Asp Ile Leu Glu Pro Ser

195 200 205

Ile Asp Asp Thr Ile Thr Ile Leu Arg Gly Ile Lys Gly Arg Phe Glu

210 215 220

Asn Tyr His Asn Val Lys Ile Gln Asp Asp Ala Leu Val Ala Ala Ala

225 230 235 240

Lys Leu Ser Ser Arg Tyr Ile Ser Asp Arg Phe Leu Pro Asp Lys Ala

245 250 255

Ile Asp Leu Val Asp Glu Ala Ala Ala Thr Ile Lys Thr Glu Ile Asn

260 265 270

Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Glu Lys Val Lys Gln Leu Val Thr Arg Leu

275 280 285

Asn Met Glu Lys Ile Ala Leu Asn Glu Glu Asp Lys Glu Lys His Lys

290 295 300

Asn Arg Ile Arg Glu Leu Glu Asp Glu Ile Lys Ser Ala Asn Gln Lys

305 310 315 320

Ile Ser Lys Leu Gln Asn Lys Trp Asn Glu Glu Lys Asn Glu Leu Glu

325 330 335

Asp Leu Ser Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Asp Asp Leu Trp Tyr Lys Ile

340 345 350

Asn Ile Tyr Lys Arg Glu Thr Lys Tyr Glu Asp Ala Ser Arg Leu Glu

355 360 365

Tyr Ser Glu Val Pro Lys Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Glu Glu

370 375 380

Lys Ile Ser Phe Ser Asp Ser Thr Leu Ile Lys Asn Ser Val Thr Ala

385 390 395 400

Glu Glu Ile Ala Gly Ile Val Ser Lys Trp Thr Met Ile Pro Val Thr

405 410 415

Lys Leu Leu Glu Thr Asp Lys Gln Lys Leu Leu Asn Leu Glu Asn Glu

420 425 430

Leu Arg Ala Arg Ile Lys Gly Gln Asp Glu Ala Val Asn Leu Val Ser

435 440 445

Lys Ala Val Leu Arg Ala Lys Ala Asn Ile Asn Asp Pro Asn Arg Pro

450 455 460

Leu Ala Ser Phe Leu Phe Thr Gly Ser Thr Gly Val Gly Lys Thr Glu

465 470 475 480

Leu Ala Arg Ala Leu Ala Phe Ala Leu Phe Asp Ser Glu Lys Gln Met

485 490 495

Ile Arg Leu Asp Met Ser Glu Tyr Met Glu Lys His Ser Val Ser Lys

500 505 510

Ile Ile Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Phe Asp Gln Gly Gly Ser

515 520 525

Leu Ala Glu Asn Ile Arg Lys Asn Pro Tyr Thr Ile Leu Leu Phe Asp

530 535 540

Glu Ile Glu Lys Ala Asp Arg Asn Val Leu Asn Ile Leu Leu Gln Ile

545 550 555 560

Leu Asp Asn Gly Ala Phe Thr Asp Ser Thr Gly Arg Val Ile Asn Cys

565 570 575

Arg Asn Leu Ile Ile Ile Met Thr Ser Asn Ile Ala Ser Asn Thr Glu

580 585 590

Leu Asn Glu Ala Leu Asp Gln Ile Pro Ser Leu Lys Ala Glu Leu Leu

595 600 605

Lys Phe Leu Ser Pro Glu Phe Val Asn Arg Ile Asp Glu Ile Val Lys

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Phe Asn Gln Leu Gln Glu Gln Asp Ile Gln Gln Ile Val Ile Leu Glu

625 630 635 640

Leu Gln Lys Leu Ile Lys Arg Ile Tyr Asp Ser Lys Glu Val Thr Leu

645 650 655

Lys Tyr Ser Pro Lys Leu Val Glu Tyr Ile Ala Lys Asn Ala Tyr Asp

660 665 670

Glu Asn Phe Gly Ala Arg Pro Ile Lys Arg Tyr Ile Gln Asn Asn Ile

675 680 685

Glu Ser Val Leu Ala Tyr Gln Ile Ile Asp Gly Ser Ile Gln Lys Asn

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His Lys Tyr Glu Ile Thr Val Phe Ala Asn Lys Phe Ile Val Ser Lys

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Val Lys