特异性结合柯萨奇病毒A6的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及特异性结合柯萨奇病毒A6的单克隆抗体及其用途。

背景技术

手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是以儿童急性感染为主的全球性传染病，是我国法定丙类传染病。病毒传播速度快，感染能力强，其发病数常位于我国丙类传染病前三。HFMD是由多病原引起的症候群，主要感染人群为儿童，典型临床症状包括咳嗽，发热，手、足、口、臀部位出疹，食欲不振，流涎等；部分患者仅表现出HA症状，少数会出现中枢神经系统受损，表现为精神萎靡、易惊、抽搐等，重症病例临床表现为心率和呼吸增快、脑功能衰竭、血压降低或休克等。非典型HFMD(atypical HFMD,aHFMD)主要由柯萨奇病毒A6(CV A6)引起，临床表现包括非典型部位或全身性的皮疹，脱皮、脱甲症以及成人感染等。

HFMD的病原组成复杂，多为小RNA病毒科肠道病毒属成员，肠道病毒A71型(EnterovirusA71，EV A71)、柯萨奇病毒A组(CoxsackievirusA，CV A)2-10，12，14，16，21，24型、柯萨奇病毒B组(CoxsackievirusB，CV B)1-6型、埃可病毒(Echovirus，Echo)1，4-7，9，11，13，18，19，24，25，30型等均有报道。自1957年世界首次报道HFMD以来，CV A16和EVA71为HFMD主要的致病原，但随着近几年我国EV A71疫苗的应用及HFMD病原谱的变迁，CVA6己逐渐替代EV A71和CV A16成为导致HFMD的又一重要的致病原。CV A6属小核糖核酸病毒科肠道病毒属A组，呈二十面体球型，无包膜，为单股正链RNA，基因组全长约7400bp，包含1个开放阅读框及5′和3′非编码区，P1区编码4种结构蛋白(VP1～VP4)，P2和P3区编码7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)；4种结构蛋白中，VP4位于病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接，VP1～VP3暴露在病毒颗粒表面，包含了主要的抗原决定簇。

有研究分析CV A6的基本传染数R0(Basic reproduction number)为5.04，高于EVA71和CV A16，且CV A6感染比EV A71和CV A16感染引发的高热比例更高，皮损也更严重，感染病例中脱甲症发生的概率也比EV A71和CV A16高。此外，CV A6还可引起抽搐、瞳孔异常和心动过速等重症症状在成人中也高度流行。不同临床症状可能与病毒基因重组有关，导致CV A6感染出现重症病例数的增加增大了防控难度。随着EV A71疫苗的推广，EV A71感染的HFMD正逐渐较少，CV A6己经取代EV A71成为我国HFMD的主要病原，这虽更加肯定了疫苗的保护作用，但由CV A6感染引起的HFMD临床治疗较为困难，而目前尚无有效治疗药物。因此，制备高效、价廉、副反应小的被动免疫制剂、研发多价联合疫苗、开发能够检测肠道病毒A6血清型的检测试剂盒等对预防和控制CV A6血清型相关HFMD具有十分重要的作用，这些方面最关键的技术也在于筛选到合适的单克隆抗体，继而可利用该单克隆抗体用于疾病治疗药物开发，建立一套有效的疫苗抗原评价系统，进行临床疾病的检测诊断，这对于HFMD的防控、减轻社会医疗经济负担有重大意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供特异性结合柯萨奇病毒A6的单克隆抗体及其用途，以期解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

本发明的第一方面保护特异性结合柯萨奇病毒A6的单克隆抗体，包括轻链和重链，所述重链的互补决定区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链的互补决定区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，

HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:1～SEQ ID No:3所示序列中的任一个；

HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:4～SEQ ID No:6所示序列中的任一个；

HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:7～SEQ ID No:9所示序列中的任一个；

LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:10～SEQ ID No:12所示序列中的任一个；

LCDR2的序列包括氨基酸序列如GTS、AAT、AVT所示中的任一个；

LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:13～SEQ ID No:15所示序列中的任一个。

在某些实施方式中，HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:1所示序列，HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:4所示序列，HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQIDNo:7所示序列；LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:10所示序列，LCDR2的序列包括氨基酸序列如GTS所示序列，LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:13所示序列。

在某些实施方式中，HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:2所示序列，HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:5所示序列，HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQIDNo:8所示序列；LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:11所示序列，LCDR2的序列包括氨基酸序列如AAT所示序列，LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:14所示序列。

在某些实施方式中，HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:3所示序列，HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:6所示序列，HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQIDNo:9所示序列；LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:12所示序列，LCDR2的序列包括氨基酸序列如AVT所示序列，LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:15所示序列。

在某些实施方式中，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:40～SEQ ID No:42所示序列中的任一个。

在某些实施方式中，所述单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:43～SEQ ID No:45所示序列中的任一个。

在某些实施方式中，所述重链包括氨基酸序列如SEQ ID No:46～SEQ ID No:48所示序列中的任一个。

在某些实施方式中，所述轻链包括氨基酸序列如SEQ ID No:49～SEQ ID No:51所示序列中的任一个。

本发明的第二方面保护与如上文所述的单克隆抗体相关的生物材料，所述生物材料包括如下中的一种或多种：

1)编码如上文所述单克隆抗体的核苷酸；

2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体；

3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌，或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。

在某些实施方式中，1)中，编码重链的核苷酸包括SEQ ID No.52～SEQ ID No.54序列中的任一种。

在某些实施方式中，1)中，编码轻链的核苷酸包括SEQ ID No.55～SEQ ID No.57序列中的任一种。

本发明的第三方面保护一种药物组合物，所述药物组合物包括如上文所述的单克隆抗体和/或如上文所述的生物材料，以及药学上可接受的载体。

本发明的第四方面保护一种产品，所述产品包含如上文所述的单克隆抗体或如上文所述的生物材料。

在某些实施方式中，所述产品选自检测试剂、试剂盒、芯片和膜条。

优选地，所述试剂盒还包括兔抗CV A6 VLP多抗血清和HPR标记的鼠二抗。

本发明的第五方面保护如上文所述的单克隆抗体或如上文所述的生物材料在制备病毒检测产品、制备预防或治疗病毒感染产品、用于病毒疫苗筛选与检测或病毒疫苗活性评价中的用途。

在某些实施方式中，所述病毒为柯萨奇病毒。

优选的，所述病毒为柯萨奇病毒A6型。

优选的，所述单克隆抗体用于制备手足口病检测产品、制备预防或治疗手足口病产品、、用于手足口病疫苗筛选或疫苗抗原定性定量的检测或疫苗活性检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本申请通过将灭活的A6病毒免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合后，筛选得到了三株杂交瘤细胞株，其分别能够稳定分泌特异性抗CV A6单克隆抗体1H2、6G4、12C9。

2)本申请的单克隆抗体均能特异性识别A6病毒样颗粒(VLP)，但均不能识别变性后的CV A6 VLP，提示单克隆抗体识别的表位可能均为构像表位。

3)本申请的单克隆抗体对A6病毒样颗粒最低检测限度为3.9ng/ml～31.25ng/ml，为将其开发成A6病毒检测试剂盒及疫苗抗原定量试剂盒提供了有利的理论依据。

4)本申请的单克隆抗体显示了强大的中和活性，其中和浓度为70.4ng/ml～1250ng/ml，是抗病毒药物及治疗性单克隆抗体的可靠候选者。

附图说明

图1显示为本发明实施例2中单克隆抗体1H2、6G4、12C9的SDS-PAGE图。

图2显示为本发明实施例2中单克隆抗体1H2、6G4、12C9的特异性分析结果图。

图3显示为本发明实施例2中单克隆抗体1H2、6G4、12C9的Western blot分析结果图。

图4显示为本发明实施例3中单克隆抗体1H2、6G4、12C9的夹心ELISA分析结果图。

图5显示为本发明实施例5中单克隆抗体1H2、6G4、12C9序列确认示意图。

具体实施方式

本发明中术语解释

单克隆抗体

抗体

表位

HFMD是危害全球儿童健康的重要疾病，目前我国多地HFMD病原谱系已发生改变，柯萨奇病毒A6(CV A6)逐渐占据主导地位，由CV A6感染引起的HFMD临床治疗较为困难，而目前尚无有效治疗药物。因此，开发CV A6的检测工具和抗病毒药物对CV A6感染的监控和治疗有着重要的意义。

为了上述目的，本发明利用CV A6灭活病毒作为免疫原，通过杂交瘤技术制备A6特异单克隆抗体的方法。经筛选检测，得到了三株能够特异结合A6病毒样颗粒(VLP)的单克隆抗体：1H2、6G4、12C9，在此基础上完成了本申请。

本发明的第一方面保护特异性结合柯萨奇病毒A6的单克隆抗体，包括轻链和重链，所述重链的互补决定区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述轻链的互补决定区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，

HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:1～SEQ ID No:3所示序列中的任一个；

HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:4～SEQ ID No:6所示序列中的任一个；

HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:7～SEQ ID No:9所示序列中的任一个；

LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:10～SEQ ID No:12所示序列中的任一个；

LCDR2的序列包括氨基酸序列如GTS、AAT、AVT所示序列中的任一个；

LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:13～SEQ ID No:15所示序列中的任一个。

本发明中，所述单克隆抗体还可以是通过基因工程重组技术获得。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。转染后的宿主细胞在特定条件下培养并表达目标抗体。

本发明的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列见表1。

表1

优选地，HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:1所示序列，HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:4所示序列，HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:7所示序列；LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:10所示序列，LCDR2的序列包括氨基酸序列如GTS所示，LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:13所示序列。

优选地，HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:2所示序列，HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:5所示序列，HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:8所示序列；LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:11所示序列，LCDR2的序列包括氨基酸序列如AAT所示，LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:14所示序列。

优选地，HCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:3所示序列，HCDR2的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:6所示序列，HCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:9所示序列；LCDR1的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:12所示序列，LCDR2的序列包括氨基酸序列如AVT所示，LCDR3的序列包括氨基酸序列如SEQ ID No:15所示序列。

本发明中，所述重链可变区还包括框架区FR1-FR4。FR1的氨基酸序列包括如SEQIDNo:16-SEQ ID No:18所示序列中的任一个，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:19-SEQIDNo:21所示序列中的任一个，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:22-SEQ ID No:24所示序列中的任一个，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:25-SEQ ID No:27所示序列中的任一个。重链可变区的框架区FR1-FR4的序列见表2。

表2

优选地，所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No:16所示序列，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:19所示序列，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:22所示序列，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:25所示序列。

优选地，所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No:17所示序列，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:20所示序列，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:23所示序列，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:26所示序列。

优选地，所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No:18所示序列，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:21所示序列，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:24所示序列，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:27所示序列。

本发明中，所述轻链可变区还包括框架区FR1-FR4。FR1的氨基酸序列包括如SEQIDNo:28-SEQ ID No:30所示序列中的任一个，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:31-SEQIDNo:33所示序列中的任一个，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:34-SEQ ID No:36所示序列中的任一个，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:37-SEQ ID No:39所示序列中的任一个。轻链可变区的框架区FR1-FR4的序列见表3。

表3

优选地，所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No:28所示序列，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:31所示序列，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:34所示序列，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:37所示序列。

优选地，所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No:29所示序列，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:32所示序列，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:35所示序列，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:38所示序列。

优选地，所述FR1的氨基酸序列包括如SEQ ID No:30所示序列，FR2的氨基酸序列包括如SEQ ID No:33所示序列，FR3的氨基酸序列包括如SEQ ID No:36所示序列，FR4的氨基酸序列包括如SEQ ID No:39所示序列。

本发明中，所述单克隆抗体的重链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:40～SEQIDNo:42所示序列中的任一个或多个。重链可变区的序列见表4，其中

本发明中，所述单克隆抗体的轻链可变区包括氨基酸序列如SEQ ID No:43～SEQIDNo:45所示序列中的任一个或多个。轻链可变区的序列见表4，其中

表4

优选地，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如SEQ ID No:40所示序列的重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID No:43所示序列的轻链可变区。

优选地，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如SEQ ID No:41所示序列的重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID No:44所示序列的轻链可变区。

优选地，所述单克隆抗体包括氨基酸序列如SEQ ID No:42所示序列的重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID No:45所示序列的轻链可变区。

本发明中，所述重链包括氨基酸序列如SEQ ID No:46～SEQ ID No:48所示序列中的任一个或多个。重链的序列见表5，其中

本发明中，所述轻链包括氨基酸序列如SEQ ID No:49～SEQ ID No:51所示序列中的任一个或多个。轻链的序列见表5，其中

表5

优选地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No:46所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNo:49所示。

优选地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No:47所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNo:50所示。

优选地，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID No:48所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ IDNo:51所示。

为了上述目的，本发明另一方面提供与如上文所述的单克隆抗体相关的生物材料，所述生物材料包括如下中的一种或多种：

1)编码如上文所述单克隆抗体的核苷酸；

2)含有1)所述核苷酸的重组表达载体；

3)含有1)所述核苷酸的生物工程菌，或含有2)所述重组表达载体的生物工程菌。

本发明中，1)中，编码重链的核苷酸包括SEQ ID No.52～SEQ ID No.54序列中的任一个。

重链核苷酸序列(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：

重链核苷酸序列(其中，单下划线部分为信号肽序列，斜体部分为可变区序列，虚线下划线为恒定区序列)：

重链核苷酸序列(其中，

本发明中，1)中，编码轻链的核苷酸包括如SEQ ID No.55～SEQ ID No.57所示序列中的任一个。

轻链核苷酸序列(其中，

轻链核苷酸序列(其中，

轻链核苷酸序列(其中，

优选地，所述单克隆抗体包括核苷酸如SEQ ID No:52所示序列的重链和核苷酸如SEQ IDNo:55所示序列的轻链。

优选地，所述单克隆抗体包括核苷酸如SEQ ID No:53所示序列的重链和核苷酸如SEQ IDNo:56所示序列的轻链。

优选地，所述单克隆抗体包括核苷酸如SEQ ID No:54所示序列的重链和核苷酸如SEQ IDNo:57所示序列的轻链。

本发明中，2)中，所述重组表达载体可以由所述核苷酸插入到表达载体的多克隆位点构建而成。表达载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。所述重组表达载体为病毒载体或非病毒载体。例如，非病毒载体包括：质粒，噬菌粒，柯斯质粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)，噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。病毒载体包括：逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。

本发明中，3)中，所述生物工程菌为导入上文所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的上文所述的核苷酸。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为生物工程菌，例如，所生物工程菌可以是原核细胞，如细菌细胞等；或是低等真核细胞，如酵母细胞等；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞等。所述生物工程菌包括如下许多细胞类型，如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞的动物细胞。

为了上述目的，本发明另一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括如上文所述的单克隆抗体和/或如上文所述的生物材料，以及药学上可接受的载体。

本发明中，所述药学可接受的载体指不会在所施用的病人身上引发过敏反应或其他不适影响的载体。药学可接受的载体包括，例如，一种或多种水、生理盐水、磷酸缓冲液、左旋糖、甘油、乙醇和其他类似物，以及上述物质的组合。

本发明中，所述药学可接受的载体可进一步包括能提高抗体的保存期限或效用的微量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液。

为了上述目的，本发明另一方面提供一种产品，所述产品包含如上文所述的单克隆抗体和/或上文所述的生物材料。

本发明中，所述产品选自检测试剂、试剂盒、芯片和膜条。

本发明中，所述产品通常可以针对作用柯萨奇病毒A6，以柯萨奇病毒A6作为生物标志物进行诊断。

优选地，所述试剂盒还包括兔抗CV A6 VLP多抗血清和HPR标记的鼠二抗。所述试剂盒还包括酶标板、包被液、封闭液、稀释液、显色液、洗涤液、终止液等。

为了上述目的，本发明另一方面提供如上文所述的单克隆抗体或如上文所述的生物材料在制备病毒检测产品、制备预防或治疗病毒感染产品、用于病毒疫苗筛选与检测或病毒疫苗活性评价中的用途。

本发明中，所述病毒为柯萨奇病毒。优选的，所述病毒为柯萨奇病毒A6型。

本发明中，所述单克隆抗体用于制备手足口病检测产品、制备预防或治疗手足口病产品、、用于手足口病疫苗筛选或用于疫苗抗原定性定量的检测或疫苗活性检测。

本发明的单克隆抗体1H2、6G4、12C9经Elisa和Western blot分析，能特异性识别CV A6，而不能识别CV A10、CV A16及EV A71，也不能识别变性后的CV A6、CV A10、CV A16及EV A71；接着，通过夹心Elisa分析，对CV A6的最低检出限度分别为3.9ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL；进一步，通过中和实验分析，对CV A6的中和浓度分别为192ng/mL、1250ng/mL、70.4ng/mL，综合说明本申请得到的单克隆抗体对柯萨奇病毒A6病毒(CV A6)具有高特异性、高灵敏度、高效价等特性，本申请的单克隆抗体也可以用于CV A6病毒疫苗的研发、生产和质检环节，例如在研发中可以用于筛选病毒疫苗，在质检环节作为参比品进行疫苗活性的评价。本申请的单克隆抗体可制备成检测CV A6病毒的产品，例如检测试剂、试剂盒、膜条或芯片，但不限于检测试剂、试剂盒、膜条或芯片，任何能针对CV A6病毒实现检测的产品都属于本申请的保护范围。

在疫苗筛选过程中，为了确保检测的抗原为活性表位抗原，需要高灵敏度、高特异性和高中和活性的检测单抗，在本申请的一具体实施例中，所述灵敏度例如可以通过夹心Elisa实验得到最低检出限度。所述特异性例如可以通过Western blot实验检测单抗与抗原的特异性结合。所述中和活性例如可以通过中和实验。所述疫苗抗原的定性定量检测例如可以通过夹心Elisa实验得到。

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

本申请实施例中A6 VLP、A10 VLP、A16 VLP、A71 VLP和兔抗EV A71 VLP多抗血清的制备参见专利CN114836444。

本申请实施例中鼠二抗和5’RACE试剂盒的信息见表4。

表4试剂信息

实施例1杂交瘤细胞株及单克隆抗体的制备

本实施例中，制备杂交瘤细胞并获得单克隆抗体，包括如下步骤：

1.1抗原制备及小鼠免疫

1.1.1抗原制备：

我们合成A6病毒的全长序列(GenBank:KR706309.1)，通过反向遗传学的手段获得了A6病毒；将A6病毒使用RD(人横纹肌肉瘤细胞)细胞进行大量扩培，扩培后的病毒使用β-丙内酯进行灭活，灭活的病毒采用超速离心的方式进行纯化(超速离心方法可参见专利CN114836444)，最终获得了A6灭活病毒。

1.1.2抗原免疫小鼠

将1μg的A6灭活活病毒与60μg铝佐剂混合，混合后的制剂通过腹腔免疫6周雌性Balb/c小鼠，共免疫三次，每次免疫剂量均为1μg的A6灭活活病毒与60μg铝佐剂混合后的制剂并通过腹腔免疫，两次免疫之间间隔1周。最后一次免疫后10天，尾静脉注射5μgA6灭活病毒进行加强免疫。

1.2杂交瘤细胞株的制备和筛选

小鼠尾静脉加强免疫3天后，将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0使用PEG1450进行融合以制备杂交瘤细胞。

杂交瘤细胞培养8天之后，取杂交瘤培养液，采用酶联免疫吸附试验及中和试验筛选特异性分泌针对CV A6 VLP的杂交瘤细胞株。

酶联免疫吸附试验步骤为：将CV A6 VLP包被96孔酶标板(200ng/孔)，4℃孵育过夜；用含有5％脱脂牛奶的PBST封闭后每孔加50μL杂交瘤培养液，37℃孵育2小时；接着用HRP标记的二抗孵育1小时，最后进行显色反应，读取OD450nm的吸光值。

中和试验步骤为：取50μL杂交瘤培养液与100TCID50/50μL柯萨奇病毒A6(参见专利CN114836444)充分混匀后，放入5％CO

根据与A6 VLP结合能力及中和活性，筛选出三株杂交瘤细胞株，鉴定信息如表6所示。

表6分泌单抗的杂交瘤细胞株鉴定

用于分析的样品均为50μL杂交瘤培养细胞上清。

*中，+代表OD450＞0.15；++代表OD450＞0.3；+++代表OD450＞0.5。

#中，+代表有中和活性；－代表无中和活性。

1.3杂交瘤产生小鼠腹水的制备和抗体纯化

每只雌性Balb/c小鼠(10周龄)腹腔注射500μl液体石蜡油，一周后，小鼠分为3组，一组中每只小鼠通过腹腔注射80万个步骤1.2得到的杂交瘤细胞株1H2，一组中每只小鼠通过腹腔注射80万个步骤1.2得到的杂交瘤细胞株6G4，一组中每只小鼠通过腹腔注射80万个步骤1.2得到的杂交瘤细胞株12C9。

腹腔注射1-2周后，用针头分别收集每只小鼠的腹水，腹水于4000rpm离心10min，去除上层油脂和下层沉淀，取澄清的腹水进行抗体纯化。根据说明书，利用iProtein GPurose 4Fast Flow亲和柱(千纯生物)纯化腹水获得三种纯化的单克隆抗体1H2、6G4和12C9。

实施例2单克隆抗体的特异性研究

本实施例中，采用实施例1得到的纯化的单克隆抗体进行特异性分析，包括如下：

2.1聚丙烯酰胺凝胶电泳

使用聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)方法鉴定实施例1得到的纯化的单克隆抗体的纯度和完整性。

包括如下：单克隆抗体与SDS-PAG上样缓冲液混合后，煮沸处理5min，经12％聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品，结果见图1。

如图1所示，单克隆抗体1H2、6G4、12C9均显示了两个条带，大小分别为55kDa和25kDa左右，对应重链和轻链。

2.2ELISA鉴定

然后，采用Elisa方法检测了单克隆抗体1H2、6G4、12C9分别与不同抗原的反应活性，抗原包括CV A6 VLP、CV A10 VLP、CV A16 VLP及EV A71 VLP。

通过酶联免疫试验(Elisa)筛选实施例1中步骤1.2得到的杂交瘤培养液，形成待测样品。分别用A6、A10、A16和A71 VLP包被96孔酶标板酶标板(200ng/孔)，4℃孵育过夜；加入5％脱脂牛奶的PBST，37℃封闭1个小时；加入待检测样品，37℃孵育2小时；接着加入HRP标记的二抗，孵育1小时，最后读取吸光值OD450nm，结果见图2。

如图2所示，单克隆抗体1H2、6G4、12C9均可以特异性识别CV A6VLP，而不能识别CVA10 VLP、CV A16 VLP及EV A71 VLP。

2.3Western blot分析

通过Western blot分析纯化的单克隆抗体1H2、6G4、12C9分别与CV A6 VLP、CVA10VLP、CV A16 VLP及EV A71 VLP的结合情况。

通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带或者将蛋白转移到PVDF膜上进行Westernblot分析。单克隆抗体浓度5μg/mL，兔抗VP3多克隆抗体1:1000稀释使用，接着用HPR标记的二抗进行孵育，最后用发光图像分析仪进行记录，结果见图3。

从图3所示，三株单克隆抗体均不能识别变性后的CV A6 VLP、CV A10 VLP、CVA16VLP及EV A71 VLP，提示识别的表位可能是构象表位。

实施例3单克隆抗体对病毒的检测及检测试剂盒

本实施例中，采用实施例1得到的纯化的单克隆抗体对柯萨奇病毒CV A6 VLP进行检测，包括如下：

3.1夹心Elisa检测实验

通过夹心Elisa方法测定纯化的单克隆抗体对CV A6 VLP的最低检出限度(当OD450nm＞0.15时，判为阳性)。

包括如下：将兔抗CV A6 VLP多抗血清1:8000稀释后包被96酶标板(100μL/孔)，4℃孵育过夜；加入含5％脱脂牛奶的PBST，37℃封闭1小时后，加入CV A6 VLP，37℃孵育2个小时；然后，分别加入实施例1纯化的单克隆抗体(10ng/μL)，37℃孵育2小时；接着用HPR标记的鼠二抗进行孵育，最后读取吸光值OD450nm，结果见图4。

从图4可知，单克隆抗体1H2、6G4、12C9均可灵敏地检测到柯萨奇病毒A6VLP，其最低检出限度分别为3.9ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml，说明单克隆抗体1H2、6G4、12C9能用于柯萨奇病毒A6感染的诊断。

3.2试剂盒

试剂盒包括：

酶标板；

检测抗体试剂：兔抗CV A6 VLP多抗血清和HPR标记的鼠二抗；

抗体试剂：单克隆抗体1H2、6G4、12C9；

封闭液：5％脱脂牛奶的PBST。

实施例4中和实验

本实施例中，通过中和试验考察实施例1得到的纯化的单克隆抗体1H2、6G4、12C9对柯萨奇病毒A6的中和活性。

包括如下：将纯化的单克隆抗体1H2、6G4、12C9分别加入含2％FBS DMEM的96孔稀释板中吹打混匀，并向下进行倍数梯度稀释，分别取8个梯度浓度的抗体稀释液50μL加入到96孔培养板中，其中1H2两倍稀释，梯度范围为：312ng/50μL～2.4ng/50μL；6G4两倍稀释，梯度范围为：1000ng/50μL～7.8ng/50μL；12C9五倍稀释，梯度范围为：2200ng/50μL～0.028ng/50μL，每个稀释度设置2个复孔；取100TCID50/50μL柯萨奇病毒A6病毒工作液加到对应的96孔板稀释好的阳性抗体中，充分混匀后，放入5％CO

结果表明，单克隆抗体1H2、6G4、12C9均对柯萨奇病毒A6具有较强的潜在中和活性，其中和浓度分别为192ng/mL、1250ng/mL、70.4ng/mL，说明单克隆抗体1H2、6G4、12C9均能用于柯萨奇病毒A6的抗病毒药物开发或疫苗活性评价的参比品。

实施例5单克隆抗体的基因序列分析、重组表达及鉴定

本实施例中，对实施例1得到的杂交瘤细胞株提取RNA，扩增重链和轻链全长基因。包括如下：

5.1RNA提取

分别将杂交瘤细胞株1H2、6G4、12C9的细胞用Trizol试剂提取总RNA，按照5’RACE试剂盒说明书扩增出重链和轻链全长基因。

单克隆抗体1H2的重链的核苷酸序列包括如SEQ ID No:52，单克隆抗体1H2的轻链的核苷酸序列包括如SEQ ID No:55；单克隆抗体1H2的重链的氨基酸序列包括如SEQ IDNo:46，单克隆抗体1H2的轻链的氨基酸序列包括如SEQ ID No:49。

1H2单抗重链核苷酸序列(其中，

1H2单抗轻链核苷酸序列(其中，

1H2单抗重链的氨基酸序列(其中，

1H2单抗轻链链的氨基酸序列(其中，

进一步分析单克隆抗体1H2的重链可变区和轻链可变区序列，单克隆抗体1H2的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No:40所示，轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ IDNo:43所示。

1H2单抗重链可变区的氨基酸序列(

上述重链可变区属于IGHV1亚群。

1H2单抗轻链可变区的核苷酸序列(

上述轻链可变区属于IGKV4亚群。

单克隆抗体6G4的重链的核苷酸序列包括如SEQ ID No:53，单克隆抗体6G4的轻链的核苷酸序列包括如SEQ ID No:56；单克隆抗体6G4的重链的氨基酸序列包括如SEQ IDNo:47，单克隆抗体1H2的轻链的氨基酸序列包括如SEQ ID No:50。

6G4单抗重链核苷酸序列(其中，

/>

6G4单抗轻链核苷酸序列(其中，

6G4单抗重链氨基酸序列(其中，

6G4单抗轻链氨基酸序列(其中，

进一步分析单克隆抗体6G4的重链可变区和轻链可变区序列，单克隆抗体6G4的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No:41所示，轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQ IDNo:44所示。

6G4单抗重链可变区氨基酸如下(

上述重链可变区属于IGHV1亚群。

6G4单抗轻链可变区氨基酸如下(

上述轻链可变区属于IGKV12亚群。

单克隆抗体12C9的重链的核苷酸序列包括如SEQ ID No:54，单克隆抗体6G4的轻链的核苷酸序列包括如SEQ ID No:57；单克隆抗体12C9的重链的核苷酸序列包括如SEQ IDNo:48，单克隆抗体6G4的轻链的核苷酸序列包括如SEQ ID No:51。

12C9单抗重链核苷酸序列(其中，

12C9单抗轻链核苷酸序列(其中，

12C9单抗重链氨基酸序列(其中，

12C9单抗轻链氨基酸序列(其中，

进一步分析单克隆抗体12C9的重链可变区和轻链可变区序列，单克隆抗体12C9的重链可变区的氨基酸序列包括如SEQ ID No:42所示，轻链可变区的氨基酸序列包括如SEQIDNo:45所示。

12C9单抗重链可变区的氨基酸如下(

上述重链可变区属于IGHV1亚群。

12C9单抗轻链可变区的氨基酸如下(

上述轻链可变区属于IGKV12亚群。

5.2重组表达的构建

然后采用同源重组的方式将本实施例中步骤4.1扩增得到的重链和轻链基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.3(thermo)EcoRI和XhoI多克隆位点之间，筛选出阳性克隆测序，构建成真核表达载体pcDNA3.3-1H2-H和pcDNA3.3-1H2-L、pcDNA3.3-6G4-H和pcDNA3.3-6G4-L、pcDNA3.3-12C9-H和pcDNA3.3-12C9-L。

5.3单克隆抗体基因的重组表达鉴定

为了验证所克隆出的1H2、6G4、12C9单抗的基因是否正确，利用脂质体的方法分别共转染pcDNA3.3-1H2-H和pcDNA3.3-1H2-L、pcDNA3.3-6G4-H和pcDNA3.3-6G4-L、pcDNA3.3-12C9-H和pcDNA3.3-12C9-L到293T细胞，3d后收取培养上清进行分析，通过Elisa方法检测细胞上清中是否有特异性结合A6 VLP的抗体存在，结果见图5。

从图5可知，表达1H2、6G4、12C9单抗序列的细胞上清均与A6 VLP有很高的结合信号，且随着稀释度的升高OD450nm逐渐降低；而没有转染相关质粒的对照细胞的上清没有结合信号，该结果说明了所扩增和表达的序列确实为单克隆抗体1H2、6G4、12C9的基因。

本申请以灭活的A6病毒免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合后，筛选得到了三株能够稳定分泌特异性抗CV A6单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并获得了特异性抗CV A6单克隆抗体，运用Western blot、Elisa、体外中和等技术手段对该抗体进行检测。通过间接Elisa方法检测了单抗与不同抗原的反应活性，显示单克隆抗体1H2、6G4、12C9可以特异性识别CV A6 VLP，而不能识别EV A71 VLP、CV A10 VLP和CV A16 VLP，表明了这些抗体均具有良好的特异性。Western blot结果显示，三株单克隆抗体均不能识别变性后的CV A6 VLP，提示识别的表位可能是构象表位。夹心Elisa结果表明，单克隆抗体1H2、6G4、12C9均可灵敏地检测到柯萨奇病毒A6 VLP，其最低检出限度分别为3.9ng/ml、31.25ng/ml和15.625ng/ml，这为将单克隆抗体开发成A6病毒检测试剂盒及疫苗抗原定量试剂盒提供了有利的理论依据。此外，单克隆抗体1H2、6G4、12C9对CV A6的中和能力存在较大差异，中和浓度分别为192ng/ml、1250ng/ml、70.4ng/ml，表明识别中和表位的差异性，提示该抗体可用于病毒鉴定及抗病毒药物的开发及治疗性单克隆抗体研发。

综上所述，1H2、6G4、12C9抗体具有良好的特异性及灵敏度且具有病毒中和能力，不仅可以作为实验室有用的检测工具，而且在病毒鉴定、诊断、治疗及多价疫苗开发方面显示出巨大潜力。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。