一株植物乳植杆菌及其在预防或治疗口腔疾病中的应用

技术领域

本发明属于口腔益生菌筛选与应用技术领域，具体涉及一株植物乳植杆菌及其在预防或治疗口腔疾病中的应用。

背景技术

口腔健康是人体健康的重要组成部分，世界卫生组织(WHO)将牙齿健康确定为 人体健康十大标准之一。牙齿健康的标准包含如下的内容：牙齿整洁、无龋齿、无 痛感，牙龈色泽正常，无出血现象。由此可见，口腔健康是指具有良好的口腔卫生， 健全的口腔功能及没有口腔疾病。

口腔健康直接或间接影响全身健康。口腔内存在多种厌氧和好氧微生物，如唾 液链球菌，发酵乳杆菌，变异链球菌，血链球菌等，这样微生物相互之间制衡，维 持健康，一旦致病的微生物大量繁殖，就会导致各种口腔疾病，如龋病、牙周疾病， 口腔溃疡，口臭等，病原菌分泌的胞外产物还会破坏牙齿硬组织和牙齿周围支持组 织，除影响咀嚼、言语、美观等功能外，还会引起社会交往困难和心理障碍。有些 微生物长期存在于口腔中，可导致或加剧某些全身疾病如冠心病、糖尿病等，危害 全身健康，影响生命质量。

龋齿是一种常见的口腔疾病，主要是变异链球菌和粘性放线菌引起的，病原菌 在牙齿表面形成生物膜，并快速生长分泌胞外产物如酸类物质腐蚀牙齿，随着腐蚀 时间的延长，会破坏整个牙齿表面，并暴露牙神经与外界接触，引起牙疼。

牙周病是另一种口腔疾病组合，影响一种或多种牙周组织，迄今为止最常见的是斑 块诱导炎症性疾病(牙龈炎，牙周炎)，牙龈出血，主要是有牙龈卟啉单胞菌，伴 放线聚集放线菌和中间普氏菌等引起。

现阶段对于口腔健康护理方面，最常用的牙膏、漱口水等产品，其原理在于清 除口腔中所有的微生物，对口腔进行彻底的清洗。但对于口腔微生物菌群已经失调 的机体，此方法无法有效改善口腔健康状况，口腔菌群失调的状态依然存在，原因 就在于在进行口腔微生物“清洗”后，口腔微生物会有重建的过程，重建过程中， 由于有害菌往往具有相对的生长优势，便会再次出现口腔微生物菌群失调的情况， 口腔健康问题无法得到很好地解决。

益生菌对口腔病原菌的抑制和口腔微生态系统重建起着非常重要的作用。益生菌能够与病原菌通过竞争粘附位点总数，竞争营养物质和生长因子，产生抗菌物质， 破坏病原菌形成的生物膜，抑制病原菌的生长，从而可以达到维持口腔健康的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一株植物乳植杆菌及其在预防或治疗口腔疾病中的应用，所提供的植物乳植杆菌可以有效的用于预防治疗口腔中由于致病微生物导致的相关 疾病。

本发明首先提供一株植物乳植杆菌，为植物乳植杆菌VHProbi V38(Lacticaseibacillus plantarum VHProbi V38)株，于2022年3月1日保藏于 中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022173。

所述的植物乳植杆菌VHProbi V38株，其16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。

所述的植物乳植杆菌VHProbi V38株，其Riboprinter指纹图谱如图1所示；

所述的植物乳植杆菌VHProbi V38株，其Motitof蛋白质谱如图2所示；

本发明另一个方面还提供所述的植物乳植杆菌VHProbi V38株的一种用途，是 在制备具有清除自由基功能的制品中的用途；

本发明再一个方面还提供所述的植物乳植杆菌VHProbi V38株在制备用于抑制口腔病原菌的制品中的应用；

所述的口腔病原菌，包含但不限定于变异链球菌、粘性放线菌、牙龈卟啉单胞 菌、伴放线聚集杆菌、具核梭状杆菌；

本发明还一个方面是提供一种用于抑制口腔病原菌的制品，所述的制品中包含有上述的植物乳植杆菌VHProbi V38株的活菌；

更进一步的，所述的用于抑制口腔病原菌的制品，其中还可以包含有植物乳植 杆菌VHProbi V38株的裂解液。

所述的制品为保健品、药品或口腔护理用品。

所述的口腔护理用品，为牙用凝胶、牙粉、牙膏、漱口剂、口喷剂、口香糖、 牙线、牙齿清洁液、牙齿清洁泡沫中的任意一种。

本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V38生物安全性良好，具有抗人工胃液和 人工肠液的能力，能够在肠道内发挥益生作用。该菌株具备较强的抗氧化功能，其 中对DPPH自由基和羟基自由基的清除率分别为20.9％和36.3％。

本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V38对引起龋齿的变异链球菌和粘性放线菌，引起牙周疾病的牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌等病原菌具 有明显的抑制作用，可以作为口腔益生菌使用，有效预防和改善口腔疾病。其中， 该菌株对变异链球菌和粘性放线菌的抑制作用最强，其发酵菌液的抑菌圈直径达到 27.5mm和21mm，且发酵菌液的抑菌效果要优于裂解液，取得了意料不到的技术 效果。

植物乳植杆菌VHProbi V38能够与常见口腔病原菌有效结合，显著抑制其粘附 到牙齿或者牙龈上。其中，该菌株对变异链球菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌 的共凝集效果最好，6h时的共凝集率高达60.04％-76.99％。该菌株还能在口腔中实 现有效定植，6h时的自凝集率达到68.40％。

植物乳植杆菌VHProbi V38能高效去除变异链球菌形成的生物膜，有效预防和 治疗龋齿。其中，该菌的发酵液和裂解液对生物膜的去除效果最好，高达100％，显 著高于菌悬液。该菌株还能显著抑制变异链球菌的增殖。对照组的变异链球菌在接 种10h后开始快速增长，生长20h左右达到稳定期；而添加了植物乳植杆菌VHProbi V38裂解液上清的实验组，变异链球菌在24h内几乎没有增长，取得了意料不到的 技术效果。

细胞实验结果进一步证实，植物乳植杆菌VHProbi V38对人正常牙龈上皮细胞 没有毒性，且能够粘附在细胞上，在口腔内实现有效定植，平衡口腔菌群。该菌株 能够显著抑制牙周致病菌(牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌)在 人正常牙龈上皮细胞上的粘附生长，有效预防和改善所述致病菌引起的牙周炎，牙 龈出血等症状。

所述植物乳植杆菌VHProbi V38可广泛应用于预防或治疗口腔疾病的保健品或药品中，以及漱口水、牙膏等口腔护理用品中，有助于维持口腔健康。

附图说明

图1为植物乳植杆菌VHProbi V38的Riboprinter指纹图谱；

图2为植物乳植杆菌VHProbi V38的蛋白质谱图；

图3为植物乳植杆菌VHProbi V38与四株致病菌的凝集试验；其中，A为植物乳 植杆菌对照，B为植物乳植杆菌+变异链球菌；C为植物乳植杆菌+牙龈单胞卟啉菌； D为植物乳植杆菌+具核梭状杆菌；E为植物乳植杆菌+半放线聚集杆菌；

图4为植物乳植杆菌VHProbi V38对变异链球菌的抑制粘附试验；其中，A为对 照组，B为实验组；

图5为植物乳植杆菌VHProbi V38对变异链球菌的抑制生长曲线；

图6为植物乳植杆菌VHProbi V38抑制牙龈卟啉单胞菌粘附到人正常牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组；

图7为植物乳植杆菌VHProbi V38抑制具核梭状杆菌粘附到人正常牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组；

图8为植物乳植杆菌VHProbi V38抑制半放线聚集杆菌粘附到牙龈上皮细胞图片；其中，A为对照组，B为实验组。

具体实施方式

本发明筛选获得的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum VHProbiV38) VHProbi V38株经多相分类学鉴定为一新型的乳杆菌属菌株，其安全性符合相关法规要求，可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险。本 发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V38能有效抑制常见的口腔病原菌，具有重要的应 用价值。

申请人于2022年3月1日将所述植物乳植杆菌VHProbi V38保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022173。

本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。 在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替 换，均属于本发明的范围。

实施例只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发 明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本 发明的范围。

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。

实施例1菌株的分离筛选

1、初筛

取10g发酵酸白菜，捣碎机捣碎，然后用90mL生理盐浸泡10min，放入无菌 样品袋中用均质机拍打混匀，将所得悬浊液进行梯度稀释；分别取10

2、抗变异链球菌菌株复筛

(1)准备底层平板

提前准备好底层1.5％琼脂平板，晾干。

(2)变异链球菌菌液制备

分别在BHI平板上划线活化三株变异链球菌(ATCC 25175，CCTCC AB 99010，BNCC700610)，然后挑取单菌落到BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，然后 按照1％的比例转接到新的BHI肉汤培养基中，37℃有氧培养24h，得到新鲜菌液； 将上述三种变异链球菌的新鲜菌液按照1：1：1等体积混匀，即得到实验用变异链 球菌菌液。

以下实施例中所使用的变异链球菌菌液均与本实施例相同。

采用三株不同的变异链球菌作为指示菌株，更能体现筛选的乳酸菌对变异链球菌的抑菌能力。

(3)牛津杯抑菌实验

准备0.7％的琼脂含量的BHI培养基，灭菌，等温度降到47℃以下，加入0.3％ (体积比)混合好的变异链球菌混合菌液，摇匀；取7ml倾倒底层琼脂平板上，等 凝固后，放上牛津杯，在孔里加入150μL初筛乳酸杆菌的发酵菌液，37℃培养48h， 观察有无抑菌圈。

结果显示，本发明初筛获得的38株乳酸杆菌中，只有2株菌对变异链球菌有抑 制效果，出现明显的抑菌圈。其中V38菌株对变异链球菌的抑制作用最显著，其发 酵菌液产生的抑菌圈直径达到27.5mm。

考虑到V38菌株具有极好的抑制变异链球菌的效果，对该菌株进行进一步分析。

实施例2V38菌株的鉴定

1、菌落形态鉴定

将V38菌株接种于MRS琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见单菌落呈 乳白色或浅黄色，菌落有光泽，不透明，菌落表面平整湿润，边缘整齐，菌落直径 在1-2mm。显微镜下呈短杆状。

2、碳源代谢试验鉴定

利用API 50CHL试剂条测定V38菌株对49种碳源的代谢作用。

在无菌条件下，取适量新鲜菌液，5000rpm离心5min，用pH7.0磷酸缓冲液洗 2次，再用同体积缓冲液重悬后，制得菌悬液。新鲜菌悬液按照10％的添加量加到 API试剂盒的培养基中，然后按照试剂盒的操作，把培养基加到试纸条的孔里面， 石蜡封口，然后把试纸条放到一个盒子里面，盒子底物加大约10mL的无菌去离子 水，盖上盖子，放置到37℃培养箱中培养24-48h，观察颜色变化，若菌生长则颜 色由蓝色变成黄色，不生长颜色维持不变。然后记录试验结果，上传到鉴定软件 APIweb。

结果显示，V38菌株能利用核糖、D-侧金盏花醇、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘 露糖、山梨糖、甘露糖醇、山梨糖醇、α-甲基-葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏 仁苷、黄柏素、七叶苷、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、菊粉、 松三糖、龙胆二糖、D-土伦糖、D-塔格糖和葡萄糖酸盐；不能利用甘油、赤藓糖醇、 D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、β-甲基-D-木糖苷、鼠李糖、卫矛醇、 肌醇、α-甲基-D-甘露糖苷、密二塘、棉子糖、淀粉、糖原、木糖醇、D-来苏糖、 D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-阿拉伯糖醇、L-阿拉伯糖醇、2-酮基葡萄糖酸钾和5-酮葡 糖酸钾。

API鉴定结果为该菌株为植物乳植杆菌，ID＝99.9％,T值＝0.93。

3、分子生物学鉴定

3.1.1基因组DNA提取

挑取平板上V38菌株的单菌落于MRS培养基中，37℃培养24h，然后取500μL 发酵菌液，参照天根细菌基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP302)操作，得到该 菌株的基因组。

3.1.2 16s rDNA基因扩增

(1)引物序列:

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA；

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

(2)反应体系(50μL)

表1：16s rDNA PCR扩增体系表

(3)电泳验证PCR产物核酸电泳结果为1500bp左右时符合要求。

(4)PCR产物测序

通过测序获得V38菌株的16s rDNA序列SEQ ID NO:1，并将该序列在NCBI数 据库中进行比对，确定V38菌株为植物乳植杆菌。

3.2 Riboprinter指纹图谱

用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入缓冲液的样品管中，用手持搅拌棒使其在缓冲液中悬浮，然后将样品放入加热器中灭活后放 入Riboprinter系统中，样品经过DNA制备、转模、成像检测及数据处理后，得到 细菌鉴定结果。

鉴定结果显示，V38菌株为植物乳植杆菌，其指纹图谱见图1。

3.3蛋白质谱鉴定

用牙签沾取平板上的V38单菌落于蛋白质谱板上，然后用牙签把菌泥涂布均匀 在质谱板上的圆盘内，涂布菌泥不需要太厚，然后按照蛋白质谱试剂盒说明书要求 加入1μL质谱样本预处理盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干。晾干后的质 谱板放置到Motitof蛋白质谱仪上进行鉴定。

蛋白质谱鉴定结果如图2，经过鉴定该菌株为植物乳植杆菌，匹配率为94.23％。

3.4全基因组测序

把V38菌株的菌液按照1％的体积比例接种到500mL MRS肉汤培养基中，37℃ 培养22h，然后8000rpm离心10min，收集菌体。菌体送到测序中心，得到该菌的 全基因组序列。将全基因组序列上传至NCBI基因数据库，GenBank号为CP092501、 CP092502、CP092503、CP092504、CP092505、CP092506、CP092507、CP092508 和CP092509，其中CP092502到CP092509为菌体内质粒的序列。

将该菌株的菌落形态以及生理生化特性结果进行比对，综合分子生物学的鉴定结果，确定该菌株为一株新型的植物乳植杆菌，将其命名为植物乳植杆菌VHProbi V38(Lactiplantibacillus plantarum VHPribo V38)。

实施例3植物乳植杆菌VHProbi V38的溶血性试验

1、血细胞培养基准备：

称取TBS基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷 却到50℃的时候，加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。

2、划线培养：

将菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观是否有溶血现象。

3、实验结果：

血细胞平板没有变化，说明植物乳植杆菌VHProbi V38不产生溶血素，不能够 溶解血细胞；满足安全性的要求。

实施例4植物乳植杆菌VHProbi V38抗氧化能力测定

1、菌悬液制备

将生长状态优良的植物乳植杆菌VHProbi V38单菌落接种于3mL的MRS液体 培养基中，37℃条件下培养24h，以此培养液为接种液，按照2％的接种量接种于 50mL的MRS液体培养基中，静置培养24h，获得新鲜菌液。吸取1mL新鲜菌液， 离心收集菌体，用1mL pH7.0磷酸缓冲液洗涤菌体2遍后，再加入2mL磷酸缓冲 液重悬菌体备用。

2、菌株清除DPPH自由基能力的测定

取1mL待测菌株的菌悬液，加入1mL 0.4mM的现配的DPPH自由基溶液，混 合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸 光度A样品，测3次平行。对照组样品以等体积缓溶液和DPPH·乙醇混合液， 并以等体积菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1- (A样品-A空白)/A对照]×100％。

结果显示，植物乳植杆菌VHProbi V38对DPPH自由基的清除率为20.9％。

3、菌株清除羟基自由基能力的测定

将100μL 5mM的水杨酸钠-乙醇溶液，100μL 5mM的硫酸亚铁，500μL去离 子水和200μL乳酸菌菌悬液混匀后加入100μL 3％过氧化氢溶液，37℃水浴15min 后，4000rpm离心10min收集上清在510nm波长处测量样品吸光度。羟基自由基清 除率按照下列公式进行计算。

清除率％＝(A样品-A控制)/(A空白-A控制)×100％。

其中：A控制为硫酸亚铁、过氧化氢和水杨酸钠混合溶液的吸光度，A空白为 硫酸亚铁和水杨酸钠混合溶液的吸光度。

结果显示，植物乳植杆菌VHProbi V38对羟基自由基的清除率为36.3％。

实施例5植物乳植杆菌VHProbi V38对人工胃液和人工肠液的耐受性

1、菌液制备：

将冷冻保存的植物乳植杆菌VHProbi V38菌株划线接种于MRS固体培养基中， 37℃培养24～48h，再经MRS液体培养基传代培养1次后，以5％的接种量把植物乳 植杆菌VHProbi V38接种到新鲜的MRS液体培养基中40℃振荡培养24～48h，获得 新鲜的菌液。

2、人工胃液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和NaCl 2g，加入1000mL 蒸馏水，用稀盐酸调pH3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜 胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床温浴1h，以模拟人体温度。

3、人工肠液的配制

分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、KH

4、试验方法

取2mL新鲜菌液，5000rpm离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次， 再用2mL生理盐水重悬，作为接种液。取1mL接种液，加入到9mL已温浴1h 的人工胃液中，置于37℃水浴摇床以200rpm转速振荡2h，分别于0h和2h时取 样1mL，检测活菌量。然后取1mL消化2h后的人工胃液，加入到24mL人工肠液 中，置于37℃水浴摇床(200rpm)3h，取样1mL，检测活菌量。

活菌计数方法按照国标《GB4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定 菌量，该菌株经过人工胃液和人工肠液后的活菌量的LOG(CFU/mL)如表2。

表2：人工胃肠液消化后的活菌量表

从表2中可以看出，植物乳植杆菌VHProbi V38经过人工胃肠液消化后活菌量 仅有少量下降，说明该菌株对人工胃液和人工肠液具有较强的耐受性。

实施例6植物乳植杆菌VHProbi V38菌液对口腔病原菌的抑菌效果试验

1、裂解液制备

按照1％的接种量(体积比)把待测菌种接种到MRS肉汤培养基，37℃培养24 h后停止培养，即得新鲜菌液。将部分菌液用超声破碎仪超声破碎20min，超声条 件：功率30％，超声2s，停止2s；80℃水浴锅中灭活60min，得到无活菌的裂解 液。

参照实施例1中牛津杯抑菌法实验步骤，分别测定植物乳植杆菌VHProbi V38 活菌和裂解液对变异链球菌(三株)、粘性放线菌ATCC27044，牙龈卟啉单胞菌 BNCC353909、半放线聚集杆菌BNCC336945和具核梭状杆菌BNCC 336949这五 种口腔常见病原菌的抑菌效果。抑菌圈直径见表3。

表3：植物乳植杆菌VHProbi V38对口腔病原菌的抑菌效果表

从表3的结果可知，本发明的植物乳植杆菌VHProbi V38对变异链球菌、粘性 放线菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌和具核梭状杆菌这五种口腔病原菌都有 明显的抑制效果，具有较广的抑菌谱。其中，该菌株对变异链球菌和粘性放线菌的 抑制作用最强，其发酵菌液的抑菌圈直径达到27.5mm和21mm，且发酵菌液的抑 菌效果要优于裂解液，取得了意料不到的技术效果。

实施例8植物乳植杆菌VHProbi V38对口腔病原菌的凝集效果试验

共聚集是细胞和细胞蛋白质之间的相互作用。益生菌可以通过与病原微生物凝集，防止其在口腔中定植和粘附，从而预防龋齿。

凝集试验分为两种，一种是根据乳酸杆菌在一定条件下是否与病原菌结合形成可见的絮状沉淀及沉淀的大小来判断凝集作用，另一种是通过测定凝集率来确定共 凝集效果。

1、菌悬液制备

按照1％的接种量(体积比)把植物乳植杆菌VHProbi V38接种到MRS肉汤培 养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm转速离心10min， 收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌 体，至菌悬液的初始吸光度OD600为0.5-0.6之间，备用。

2、病原菌菌悬液制备：

按照1％的接种量(体积比)把变异链球菌菌液接种到BHI肉汤培养基，37℃ 有氧培养24h后停止培养，得新鲜菌液；

按照1％的接种量(体积比)把牙龈单胞卟啉菌，半放线聚集杆菌和具核梭状杆 菌菌液分别接种到BHI肉汤培养基(添加5％的牛血清)，37℃厌氧培养48h后停 止培养，得新鲜菌液；

将上述病原菌的新鲜菌液8000rpm离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷 酸缓冲液洗涤两次，然后用pH7.0磷酸缓冲液重悬菌体，调整菌悬液的初始吸光度 OD600为0.5-0.6之间，备用。

3、凝集点试验

取植物乳植杆菌VHProbi V38菌悬液300μL加入24孔板，再加入300μL病原 菌菌悬液作为反应样本，另取等量的乳酸菌菌悬液和缓冲液混合作为对照，每个对 照及样本设2平行。将24孔板置于微孔板恒温振荡器，400rpm，室温，振荡孵育。 每振荡30min，停机30min，拍照记录初始孔板状态及每次停机时的孔板状态。

从图3的结果可知，2h内植物乳植杆菌VHProbi V38与变异链球菌、牙龈卟啉 单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌都有凝集点出现。其中对变异链球菌有较 多较大的凝集点，对牙龈卟啉单胞菌和具核梭状杆菌都有较多较小的凝集点，对半 放线聚集杆菌是一个大的凝集点。从而说明植物乳植杆菌VHProbi V38能够与常见 口腔病原菌有效结合，显著抑制其粘附到牙齿或者牙龈上。

3、乳酸菌自凝集率和共凝集率的测定

(1)自凝集率测定

将制备的乳酸菌悬液取1ml加入24孔板内，室温静置。取100μL在波长600nm 条件测定初始吸光值A0，在随后的6h内每隔2h吸取菌悬液上层，在波长600nm 条件下测量吸光值At，计算自聚力(R

自聚力(R自)的计算公式：R

式中：R

表4：植物乳植杆菌VHProbi V38的自凝集率表

从表4的结果可以看出，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V38 6h时的自凝 集率达到68.40％。从而说明植物乳植杆菌VHProbi V38能够在口腔中有效定植。

(2)共凝集率测定

取100μL植物乳植杆菌VHProbi V38菌悬液和病原菌菌悬液测定初始吸光值OD600，然后将等量的植物乳植杆菌VHProbi V38菌悬液和病原菌菌悬液混合，摇匀， 室温静置，每个样品三个平行，每隔2h取上层悬浮液100μL测定吸光值OD600。计 算共聚力(R

R

式中：R

表5：植物乳植杆菌VHProbi V38对口腔病原菌的共凝集效果表

从表5的结果可以看出，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V38可与变异链 球菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌四种常见的口腔病原菌高 效结合，2-6h时内共凝集率达到23.95％-76.99％。其中，植物乳植杆菌VHProbi V38 对变异链球菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌的共凝集效果最好，6h时的共凝集 率高达60.04％-76.99％。

植物乳植杆菌VHProbi V38与病原菌有效结合，可以随着唾液流动和口腔清洁 等行为，减少口腔内病原菌的数量，进而达到减少病原菌在口腔内荷载的效果。

实施例9植物乳植杆菌VHProbi V38对变异链球菌的拮抗粘附试验

变形链球菌是目前公认的龋病主要病原菌，其在口腔内的定植和黏附是龋齿形成的主要原因。因此，口腔益生菌通过与病原菌形成凝集，抑制其生长和粘附，并 有效减少口腔疾病。

1、菌悬液制备

按照1％的接种量(体积比)把植物乳植杆菌VHProbi V38接种到MRS肉汤培养 基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜菌液；将新鲜菌液8000rpm离心10min，收 集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重 悬。

2、变异链球菌菌悬液制备

参照实施例1所述方法制备变异链球菌菌液；将新鲜菌液8000rpm离心10min， 收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液 重悬。

将500μL植物乳植杆菌VHProbi V38菌悬液及500μL变异链球菌菌悬液混合均 匀，静置5min后，取500μL上层溶液添加至已置入无菌细胞爬片的24孔板中， 于37℃的温度下培养2h，再移除该上层溶液，以pH7.0磷酸盐缓冲液清洗后，加 入0.5mL甲醇固定10min，然后弃去。最后加入300μL吉姆萨染液染色10min， 然后弃去染液，用pH7.0磷酸缓冲液冲洗一遍，将细胞爬片置于载玻片上观察细胞 爬片上的菌量。

结果如图4，对照组变异链球菌爬满了细胞爬片，而添加了植物乳植杆菌 VHProbiV38的实验组细胞爬片上可视范围看不到变异链球菌，只有粘附力比较强 的植物乳植杆菌，植物乳植杆菌的菌体比变异链球菌大，在显微镜下很容易辨认， 说明植物乳植杆菌VHProbi V38菌体能够显著抑制变异链球菌粘附到细胞爬片上。 从而说明，本发明提供的植物乳植杆菌VHProbi V38能够有效阻止病原菌粘附到牙 齿上，有助于预防龋齿的发生。

实施例10植物乳植杆菌VHProbi V38对变异链球菌的生物膜消除作用

变形链球菌通过与牙齿表面获得性膜上的结合位点结合的表面蛋白形成斑块生物膜，抑制和去除牙菌斑生物膜是预防龋齿的重要组成部分。

1、参照实施例1所述方法制备新鲜的变异链球菌菌液。

2、按照1％的接种量(体积比)把植物乳植杆菌VHProbi V38接种到MRS肉 汤培养基，37℃培养24h后停止培养，得新鲜发酵液。将发酵液分三部分进行如下 处理：

(1)将部分发酵液8000rpm离心10min，收集菌体；将菌体用pH7.0磷酸缓冲 液洗涤两次，然后用同体积pH7.0磷酸缓冲液重悬，制备得到活菌菌悬液；

(2)将部分发酵液用超声破碎仪超声破碎20min，超声条件：功率30％，超 声2s，停止2s；80℃灭活60min，得到无活菌的裂解液；

(3)部分发酵液不进行任何处理。

3、准备无菌的带细胞爬片的24孔板

每孔加入600μL变异链球菌的菌液，培养24h后，变异链球菌在细胞爬片上 粘附形成一层生物膜，然后弃除孔内培养液和未粘附的菌体，用pH7.0磷酸缓冲液 洗涤两次；孔内分别加入600μL的植物乳植杆菌VHProbi V38发酵液、菌悬液和无 活菌的裂解液，其中每组做3个平行，并以等量MRS肉汤培养基作对照。

让待测样品和变异链球菌形成的生物膜37℃共培养24h，然后弃去孔内的液体后，加入600μL pH7.0磷酸缓冲液清洗，将每孔清洗3次，清洗时需不断强烈振动 以除去未粘附的细菌，然后通过细胞爬片上变异链球球的数量对比来判断待测样品 生物膜去除率。

将细胞爬片置于无菌均质袋内，超声清洗10min，使菌体扩散到缓冲液中，然 后通过一系列稀释，取100μL涂布到添加了200U/L杆菌肽的轻质唾液链球菌培养 基上，37℃有氧培养24小时，检测变异链球菌的菌量，通过以下公式计算变异链球 菌生物膜的去除率：

去除率(％)＝(1-实验组菌量/对照组菌量)×100％。

具体结果见表6。

表6：植物乳植杆菌VHProbi V38对变异链球菌生物膜的去除效果表

从表6的数据可知，植物乳植杆菌VHProbi V38能高效去除变异链球菌形成的 生物膜。其中，菌悬液即单纯的菌体对生物膜的去除率为53.07％，说明菌体细胞膜 上有变异链球菌的结合位点，单纯的菌体自身也能够与变异链球菌结合，短时间内 去除部分生物膜；而发酵液和裂解液中除了含有菌体自身外，还含有较多的代谢物 质，能够更高效去除变异链球菌形成的生物膜，去除率高达100％。因此，植物乳植 杆菌VHProbi V38能有效预防和治疗由变异链球菌引起的龋齿，其裂解液可广泛用 于牙膏和漱口水等口腔护理用品中。

实施例11植物乳植杆菌VHProbi V38对变异链球菌的抑制生长试验

1、裂解液上清制备

将植物乳植杆菌VHProbi V38新鲜菌液用超声细胞破碎仪破碎细胞壁，然后80℃处理60min，然后用0.22μL微孔滤膜过滤除去不溶物，制备得到裂解液上清。

2、接种液制备

将新鲜变异链球菌菌液用pH7.0磷酸缓冲液洗涤两次，同体积重悬。然后稀释 5倍，作为接种液。

3、96孔板培养

每孔加入50μL BHI肉汤培养基和10μL变异链球菌菌液，其中实验组加入20 μL裂解液上清液，对照组加入20μL无菌水；然后每孔用无菌水补充体积到200μL， 加入50μL液体石蜡，每组设置4个平行。将96孔板放置于37℃酶标仪中，设置 每间隔10min测定一次OD600，测定24h，得到变异链球菌的生长曲线，如图5 所示。

从图5上看出，对照组的变异链球菌在接种10h后开始快速增长，生长20h 左右达到稳定期；而添加了植物乳植杆菌VHProbi V38裂解液上清的实验组，变异 链球菌在24h内几乎没有增长，从而说明植物乳植杆菌VHProbi V38裂解液能够抑 制变异链球菌的增殖。

实施例12植物乳植杆菌VHProbi V38对人正常牙龈上皮细胞的毒性试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，二氧化碳培养箱培养至所需量，待细胞密 度生长至80％左右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5× 10

2、灭活菌液制备

植物乳植杆菌VHProbi V38新鲜菌液置于80℃水浴锅中灭活20min，然后用 pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤三次，用细胞培养液重悬菌体，并调整菌体浓度 OD600＝0.4-0.5之间。

3、细胞培养

实验组：将灭活后的菌液按MOI(Multiplicity of Infection，感染复数)值为10的比例加入24孔板的细胞中，

空白对照组：加入与灭活菌液等体积的细胞培养液。

在待检测的每个细胞培养孔中加入MTT溶液，使其终浓度为0.3g/L；将24孔 板放置于二氧化碳培养箱中孵育3h，小心弃掉上清；每个24孔板细胞培养孔中加 入500μL的DMSO，37℃下孵育30min，使紫色结晶充分溶解；在波长490nm下 检测吸光度值。

结果显示，空白对照组的吸光值是0.668，而实验组的吸光值是0.701，基本相 当。从而说明植物乳植杆菌VHProbi V38对人正常牙龈上皮细胞的增殖活性均无显 著影响，安全性良好，无细胞毒性。

实施例13植物乳植杆菌VHProbi V38对牙龈上皮细胞的粘附性

粘附性是益生菌在口腔中定植的重要先决条件，粘附性高在这个生态系统中有竞争优势。

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80％左 右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、菌悬液制备

将植物乳植杆菌VHProbi V38新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后 用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600＝0.4-0.5之 间。

3、细胞培养

在已准备好的含人原代牙龈上皮细胞的24孔板内加入菌悬液500μL，于二氧 化碳培养箱中共生培养2h，终止培养，用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤3次，去除未 粘附的乳杆菌。

4、镜检

细胞爬片用甲醇固定15min，然后吉姆萨染液染色5min，pH 7.0磷酸盐缓冲 液洗涤冲洗干净后，取出细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数，随机选择 50个细胞，并计算其可视细胞表面的植物乳植杆菌，运用统计学方法计算粘附指数 的均数和标准差。

粘附指数＝粘附细菌数/细胞数×100％。

结果显示，一个牙龈上皮细胞上大约粘附9个植物乳植杆菌VHProbi V38菌体， 粘附指数是8.67。从而说明，植物乳植杆菌VHProbi V38对牙龈上皮细胞粘附力很 强，能够在口腔中高效定植。

实施例14植物乳植杆菌VHProbi V38在细胞水平上对牙周病原菌的拮抗粘 附试验

1、细胞预培养

将人正常牙龈上皮细胞液氮中复苏，培养至所需量，待细胞密度生长至80％左 右时，胰酶消化成单细胞悬液，血球计数板计数，细胞数为5×10

2、菌悬液制备

将植物乳植杆菌VHProbi V38新鲜菌液用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤两次，然后 用含10％小牛血清的1640培养液同体积重悬，调整吸光度，使OD600＝0.4-0.5之 间。

采用同样方法分别制备得到牙龈卟啉单胞菌、具核梭状杆菌和半放线聚集杆菌菌悬液。

3、细胞培养

实验组：将植物乳植杆菌VHProbi V38菌液和病原菌菌悬液按照体积比1:1的 比例混匀，然后取500μL加入到上述准备好的24孔板内。

对照组：将病原菌菌悬液和磷酸缓冲液按照1:1的比例混匀，然后取500μL 加入到上述准备好的24孔板内。为同菌量的病原菌菌液加上相应体积的缓冲液。将 24孔板置于二氧化碳培养箱中共生培养2h，终止培养，用pH7.0磷酸盐缓冲液洗涤 3次，去除未粘附的乳杆菌。

5、镜检

每个孔加入500μL甲醇固定15min，然后吉姆萨染液染色5min，pH7.0磷酸盐 缓冲液洗涤冲洗干净后，取出孔内的细胞爬片到载玻片上。在显微镜下观察并计数， 随机选择50个细胞，并计算其可视细胞表面的病原菌数量，运用统计学方法计算粘 附指数的均数和标准差。具体结果见表7。镜检结果如图6-8所示。

粘附指数(％)＝粘附细菌数/细胞数×100％。

表7：植物乳植杆菌VHProbi V38对牙周病原菌的拮抗粘附效果表

从图6-8以及表7的数据可以看出，与对照组相比，添加植物乳植杆菌VHProbi V38菌悬液的实验组半放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭状杆菌对牙龈上皮 细胞的粘附指数普遍下降89％-97％，其中，半放线聚集杆菌的粘附指数最低，仅有 1.1，几乎无法粘附到牙龈上皮细胞上。从而说明，植物乳植杆菌VHProbi V38能显 著抑制常见牙周病原菌对牙龈上皮细胞的粘附作用，且对半放线聚集杆菌的粘附抑 制效果最强，取得了意料不到的技术效果。

上述细胞实验结果表明，植物乳植杆菌VHProbi V38对人正常牙龈上皮细胞没 有毒性，且能够粘附在细胞上，在口腔内实现有效定植，平衡口腔菌群。植物乳植 杆菌VHProbi V38能够显著抑制牙周病原菌(牙龈卟啉单胞菌、半放线聚集杆菌和 具核梭状杆菌)在人正常牙龈上皮细胞上的粘附生长，有效预防和改善所述病原菌 引起的牙周炎，牙龈出血等症状。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物股份有限公司

青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一株植物乳植杆菌及其在预防或治疗口腔疾病中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> 植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)

<400> 1

gactttgggt gttacaaact ctcatggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg 60

tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta ctagcgattc cgacttcatg taggcgagtt 120

gcagcctaca atccgaactg agaatggctt taagagatta gcttactctc gcgagttcgc 180

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gccgtactcc ccaggcggaa tgcttaatgc gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc 600

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tacccatact ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga cagccgcctt cgccactggt 720

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cttaaaaaac cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta 900

cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttaaa taccgtcaat 960

acctgaacag ttactctcag atatgttctt ctttaacaac agagttttac gagccgaaac 1020

ccttcttcac tcacgcggcg ttgctccatc agactttcgt ccattgtgga agattcccta 1080

ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggccg attaccctct 1140

caggtcggct acgtatcatt gccatggtga gccgttacct caccatctag ctaatacgcc 1200

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ccacgtgtta ctcaccagtt cgccactcac tcaaatgtaa atcatgatgc aagcaccaat 1380

caa 1383