没食子酸在治疗结直肠癌和促进Anti-PD-1介导抗肿瘤效应的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和临床医学领域，具体地，涉及没食子酸在治疗结直肠癌和促进Anti-PD-1介导抗肿瘤效应的应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是世界范围内第三常见的导致癌症死亡的癌种，2020年有超过190万的新增病例和93.5万的新增死亡病例，新增病例和新增死亡病例都接近所有癌症新增例数的10％。

结直肠癌在中国的防治形势更加严峻，根据国家癌症中心公布的最新数据，2015年中国有387600人被确诊为结直肠癌，占全部恶性肿瘤发病的9.87％。同时，由结直肠癌导致的死亡病例达到187100例，占全部恶性肿瘤死亡的8.01％。结直肠癌的发病率和死亡率都呈现年轻化的趋势。

虽然目前已经有一些治疗结直肠癌的药物，然而，治疗效果尚难以令人满意。例如，以Anti-PD-1抗体为代表的免疫治疗仅对少数病人有效，而且效果不一。

因此，本领域迫切需要新的更有效、更有针对性的治疗结直肠癌的药物和方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的更有效、更有针对性的治疗结直肠癌的药物和方法。

在本发明的第一方面，提供了一种活性成分或含所述活性成分制剂的用途，用于制备一药物组合物或制剂，所述活性成分为没食子酸、或没食子酸衍生物、或其药学上可接受的盐或酯，

所述组合物或制剂用于：

(a)治疗USP21高表达的肿瘤；

(b)抑制Treg细胞中USP21的表达；

(c)抑制肿瘤细胞中USP21的表达；

(d)促进PD-1抑制剂介导的抗肿瘤活性；

(e)下调FOXP3的表达；和/或

(g)抑制调节性T细胞(Treg)的功能。

在另一优选例中，所述USP21高表达的肿瘤选自下组：结直肠癌、肝癌、或其组合。

在另一优选例中，所述的“USP21高表达”指所述肿瘤细胞中USP21表达量E1与正常细胞中的USP21表达量E0的比值(E1/E0)≥1.5，较佳地≥2，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述制剂为去泛素化酶USP21抑制剂。

在另一优选例中，所述组合物或制剂用于抑制调节性T细胞功能。

在另一优选例中，所述组合物为药物组合物、膳食补充剂、食品组合物、保健品组合物。

在另一优选例中，所述的组合物还含有PD-1抑制剂。

在另一优选例中，所述的组合物还含有额外的抗肿瘤药物。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物选自下组：化疗药物(如顺铂、靶向药物)、抗体(如PD－1抗体，PD－L1抗体)。

在另一优选例中，所述组合物或制剂被施用于人和非人哺乳动物。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：

(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分选自下组：没食子酸、或没食子酸衍生物、或其药学上可接受的盐或酯；

(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为PD-1抑制剂；和

(Z3)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的PD-1抑制剂包括PD-1抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：

(P1)第一药物组合物，所述第一药物组合物包括：(Z1)第一活性成分，所述的第一活性成分选自下组：没食子酸、或没食子酸衍生物、或其药学上可接受的盐或酯；和药学上可接受的载体；和

(P2)第二药物组合物，所述第二药物组合物包括：(Z2)第二活性成分，所述的第二活性成分为PD-1抑制剂；和(Z3)药学上可接受的载体；

其中，所述的第一药物组合物是各自独立的。

在另一优选例中，所述的PD-1抑制剂包括PD-1抗体。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物和第一药物组合物为固态或液态制剂。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物的剂型选自下组：口服制剂、注射剂、冻干剂。

在另一优选例中，所述的第一药物组合物的剂型为口服制剂，较佳地为片剂、胶囊剂、颗粒剂。

在另一优选例中，所述的第二药物组合物的剂型选自下组：口服制剂、注射剂、冻干剂。

在另一优选例中，当PD-1抑制剂为PD-1抗体时，第二药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述药物组合物可用于制备治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述的肿瘤为USP21高表达的肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤是伴随Treg细胞中USP21高表达的肿瘤。

在本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括：

(U1)检测试剂，所述的检测试剂用于(a)检测所述患者或对象中的USP21的表达水平和/或活性，(b)检测所述患者或对象中的USP21的表达水平和/或活性；或其组合；

(U2)用于治疗肿瘤的第一活性成分，所述的第一活性成分选自下组：没食子酸、或没食子酸衍生物、或其药学上可接受的盐或酯。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有：

(U3)用于治疗肿瘤的第二活性成分，所述的第二活性成分为PD-1抑制剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂用于检测肿瘤细胞或Treg细胞中的USP21的表达；和/或用于检测肿瘤细胞或Treg细胞中的FOXP3的表达。

在另一优选例中，所述的检测试剂包括：用于定量检测USP21的mRNA表达水平的试剂。

在另一优选例中，所述检测试剂包括：引物、探针、芯片或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种体外抑制去泛素化酶USP21表达的方法，包括步骤：

(a)在没食子酸存在下，培养调节性T细胞(Treg)，从而抑制Treg细胞中去泛素化酶USP21的表达。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)检测所述Treg细胞中去泛素化酶USP21的mRNA表达水平。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)检测所述Treg细胞中去泛素化酶FOXP3的表达水平或活性。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)测定所述Treg细胞的免疫抑制功能。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了没食子酸对MC38皮下移植瘤生长影响的追踪。

图2显示了没食子酸对MC38皮下移植瘤生长的影响。

图3显示了没食子酸和Anti-PD-1抗体对MC38皮下移植瘤生长影响的追踪。

图4显示了没食子酸和Anti-PD-1抗体对MC38皮下移植瘤生长的影响。

图5显示了没食子酸和Anti-PD-1抗体对MC38皮下移植瘤小鼠生存的影响。

图6显示了没食子酸和Anti-PD-1抗体对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展的影响。

图7显示了没食子酸和Anti-PD-1抗体对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展的肿瘤数量统计。

图8显示了没食子酸和Anti-PD-1抗体对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展的肿瘤大小统计。

图9显示了没食子酸和Anti-PD-1抗体对对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌小鼠生存的影响。

图10显示了没食子酸处理iTreg后对泛素化酶和去泛素化酶转录水平的影响。

图11显示了没食子酸浓度梯度处理iTreg后对FOXP3蛋白水平的影响。

图12显示了没食子酸浓度梯度处理iTreg后对PD-L1蛋白水平的影响。

图13显示了没食子酸处理iTreg后对CD4+CD25-T细胞抑制功能的影响(横轴为CTV(Cell Trace Violet),纵轴为百分比。

图14显示了没食子酸处理iTreg后对CD4+CD25-T细胞抑制功能影响的统计情况。

图15显示了Treg特异性敲除USP21对MC38皮下移植瘤生长影响的追踪。

图16显示了Treg特异性敲除USP21对MC38皮下移植瘤生长的影响。

图17显示了Treg特异性敲除USP21对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展的影响。

图18显示了Treg特异性敲除USP21对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展的肠镜图。

图19显示了Treg特异性敲除USP21对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌的肿瘤数量统计。

图20显示了Treg特异性敲除USP21对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展的肿瘤大小统计。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外发现了没食子酸(GA)可以显著抑制调节性T细胞的免疫抑制功能。具体地，本发明人发现，没食子酸可以抑制Treg细胞中USP21的表达，进而下调FOXP3和PD-L1等蛋白的稳定性，进而抑制调节性T细胞(Treg)的功能。此外，当GA与PD-1抑制剂联用时，具有协同的抗肿瘤活性。在此基础上完成了本发明。

具体地，小鼠皮下MC38移植瘤模型和AOM/DSS化学试剂诱导自发结直肠癌模型的实验表明，没食子酸可以抑制结直肠癌的发生发展；进一步实验联合了没食子酸与Anti-PD-1抗体，证实了没食子酸可以促进Anti-PD-1介导抗肿瘤效应；特异性敲除小鼠肿瘤模型构建和体外细胞实验，证实了没食子酸可以抑制去泛素化酶USP21的表达来调控FOXP3和PD-L1的稳定性，进而抑制调节性T细胞(Treg)的功能。

没食子酸及其衍生物或其药学上可接受的盐或酯

没食子酸(Gallic acid，GA)又称五倍子酸，其化学名称为3，4，5-三羟基苯甲酸(式I)，是化学结构最简单的天然多酚类化合物。没食子酸广泛存在于自然农作物中，例如五倍子、茶叶、柠檬和香蕉中都有较高含量的没食子酸。

在本发明中，没食子酸可其药学上可接受的盐或衍生物的形式施用。代表性的药学上可接受的盐包括GA与碱金属(如Na、K)或碱土金属(如Ca、Mg、Fe)或铵离子等形成的盐。

代表性的没食子酸衍生物包括GA与酸和/或醇形成的衍生物。没食子酸的羟基可与多种基团形成酯或酯键的衍生物，例如没食子酸的一个或多个羟基可与有机酸(如乙酸，天冬氨酸，甲酸，柠檬酸，苯甲酸，苹果酸，马来酸，酒石酸和乳酸等)形成酯。此外，没食子酸的羧基可与多种基团形成酯或酰胺键的衍生物，例如，没食子酸的羧基可与C1-C6低级醇(如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇)或C6-C10的烷基醇形成酯。此外，没食子酸的羟基可脱H，亦可引入糖基(如葡萄糖，果糖和蔗糖组成的单糖、双糖)。

在本发明中，没食子酸及其衍生物或其药学上可接受的盐或酯可以以纯净物(纯化的化合物)、或提取物形式给药。

PD-1抑制剂

如本文所用，“PD-1抑制剂”指抑制PD-1表达、数量和/或活性的物质，包括小分子化合物或抗体。

代表性的PD-1抑制剂包括(但并不限于)：抗PD-1抗体；抗PD-1抗体小分子化合物；或其组合。

去泛素化酶USP21

USP21作为一个C19肽酶家族成员，于2000年被鉴定出来，并确定了其染色体定位，被命名为USP23。

研究发现，USP21不仅能依赖于其中的Cys-His结构域发挥去泛素化酶的活性，同时也能从底物上水解泛素类似小分子NEDD8来发挥功能。

去泛素化酶USP21抑制剂

基于本发明的研究，没食子酸及其衍生物或其药学上可接受的盐或酯可抑制Treg细胞中去泛素化酶USP21的表达，因此可作为去泛素化酶USP21抑制剂来下调Treg细胞中去泛素化酶USP21的表达，进而下调FOXP3稳定性和下调PD-L1稳定性。

在本发明中，没食子酸或其衍生物或盐可单独使用，也可与其他的去泛素化酶USP21抑制剂联用，从而有效地抑制Treg细胞中去泛素化酶USP21的表达。

组合物及应用

本发明发明还提供了含有本发明活性成分的多种不同的组合物，所述组合物包括(但并不限于)：药物组合物、膳食补充剂、食品组合物、保健品组合物

以药物组合物为例，如本文所用，术语“活性成分”指的是可用于本发明的没食子酸、或没食子酸衍生物、或其药学上可接受的盐或酯。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

伴随诊断方法和试剂盒

本发明还提供了一种伴随诊断的试剂盒和方法。

由于本发明的活性成分(如没食子酸、或没食子酸衍生物、或其药学上可接受的盐或酯)可高效抑制USP21的表达，因此可以特别适合治疗USP21可表达的肿瘤。因此，可以对患者(或对象)的瘤细胞或Treg细胞或其他组织(如血清)中USP21的表达或活性进行检测，从而确定USP21高表达或阳性的患者。这些USP21高表达或阳性的患者特别适合用本发明的活性成分进行。

此外，由于本发明的活性成分可以下调FOXP3，因此，可以对患者(或对象)的瘤细胞或Treg细胞或其他组织(如血清)中FOXP3的表达或活性进行检测，从而确定FOXP3高表达或阳性的患者。这些FOXP3高表达或阳性的患者特别适合用本发明的活性成分进行治疗。

优选地，本发明提供了一种药盒，这种药盒除了含有用于治疗的药物组合物之外，还含有伴随诊断的试剂，所述的伴随诊断的试剂用于(a)检测所述患者或对象中的USP21的表达水平和/或活性，(b)检测所述患者或对象中的USP21的表达水平和/或活性；或其组合。

优选地，本发明的药盒，除了含有第一活性成分(没食子酸、或没食子酸衍生物、或其药学上可接受的盐或酯)之外，还含有第二活性成分。代表性的第二活性成分包括(但并不限于)：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂等。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明通过构建小鼠皮下MC38移植瘤模型和AOM/DSS化学试剂诱导自发结直肠癌模型，验证了没食子酸在抑制结直肠癌的发生发展方面的良好应用前景。

(2)本发明通过体外实验，验证了没食子酸在抑制去泛素化酶USP21的表达来调控FOXP3和PD-L1的稳定性(下调)，进而抑制调节性T细胞(Treg)的功能方面的应用。

(3)本发明通过构建小鼠皮下MC38移植瘤模型和AOM/DSS化学试剂诱导自发结直肠癌模型，验证了没食子酸与PD-1抑制剂联用时，具有协同的抗肿瘤活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料和方法

MC38细胞株购自于中国科学院上海细胞所，LOVO细胞株购自于中国科学院上海细胞所，人PBMC细胞从健康献血者的血样中进行分离，HEK293T细胞株购自于中国科学院上海细胞所。DMEM培养基、X-VIVO培养基、DMSO、胎牛血清FBS、胰酶等购自Gibco公司，C57背景小鼠购自于赛业公司，Anti-PD-1抗体购自于优宁维公司。

(一)药液配制

Anti-PD-1抗体用PBS配制成10μg/mL的母液备用，给药时用PBS稀释成需要的浓度。没食子酸用DMSO配制成1mol/L的母液备用，给药时用DMEM培养基稀释成需要的浓度。

(二)细胞培养

HEK293T用含10％FBS血清的DMEM培养基培养，培养条件是5％二氧化碳及37℃恒温培养。MC38细胞系用含10％FBS血清的DMEM培养基培养，培养条件是5％二氧化碳及37℃恒温培养。

LOVO细胞系用含10％FBS血清的DMEM培养基培养，培养条件是5％二氧化碳及37℃恒温培养。

人PBMC细胞来源于上海市血液中心健康献血者。通过BD FACS AriaII流式细胞分选仪分选出人CD4+CD127hiCD45RAhi Naive T细胞和CD4+CD25-效应T细胞，分选纯度在95％-99％。

人Naive T细胞按4：1的比例加入anti-CD3/CD28 beads，并在含有5ng/ml TGF-β和500U/ml IL-2的X-Vivo完全培养基中诱导分化为iTreg细胞。

(三)实时荧光定量-PCR(采用TRIZOL试剂盒进行RNA抽提)

(1)每1×106-2×106个细胞用预冷的PBS洗细胞后，加入1ml TRIZOL,室温静置5分钟让其充分混匀裂解细胞。

(2)加入200μl三氯甲烷,剧烈震荡15秒混匀,室温静置5分钟,然后冰上再静置5分钟。

(3)4℃,12000g离心15分钟后，取最上层水相置于新的无RNA酶的1.5ml离心管中。

(4)每管加入500μl异丙醇，剧烈震荡混匀，室温静置5分钟，冰上静置5分钟。对于原代细胞RNA的提取，可以在体系中加入1μl的糖原，并在-20℃沉淀过夜，从而帮助RNA的沉淀。

(5)4℃,12000g离心10分钟后，弃除上清，每管加入1ml DEPC水配置的无RNA酶的75％乙醇，混匀。

(6)4℃,7500g离心5分钟后，小心且充分弃除上清，并将沉淀自然风干5分钟。

(7)加入适量体积无RNA酶的DEPC水溶解RNA沉淀(30-50μl)，混匀后用Nano drop仪器检测RNA浓度和纯度(A260/A280)。

(8)抽提出的RNA可以冻存于-80℃冰箱。

逆转录使用PrimeScript RT reagent Kit(Takara)：

1)反应体系：

2)反应条件

37℃15分钟(反转录过程)

85℃5秒钟(反转录酶失活)

4℃保持(收样)

3)反转产物cDNA用于Real-time q-PCR或储存于-20℃。

实时荧光定量PCR使用Takara公司的SYBR Premix Ex Tag试剂盒配制反应体系，并用AB Applied Biosystems ViiA7实时定量PCR仪器检测：

1)反应体系

2)反应条件

在AB Applied Biosystems ViiA7实时定量PCR仪上设置并运行以下程序：

95℃1分钟

95℃10秒钟

60℃30秒钟

40个循环

3)数据分析采用对于内参的相对定量统计计算：RQ＝2-△△Ct

(四)免疫蛋白印记具体操作步骤：

(1)蛋白裂解液与2×SDS上样缓冲液混匀后，100℃煮样10分钟，13000rpm离心1分钟，取20μl上清缓慢加入样品孔中。

(2)先用70V恒定电压进行电泳，待条带移动至下层胶界面后将恒定电压调整为120V，根据蛋白分子量大小来决定电泳时间，一般溴酚蓝刚跑出SDS-PAGE胶底部时可以停止电泳。

(3)在转膜缓冲液的浸泡下，从转移夹的负极面上逐渐叠加海绵垫、滤纸、SDSPAG胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵垫。注意，完全浸泡在转膜缓冲液中并避免产生气泡影响结果100V恒压电泳90分钟，并将转膜的电泳槽置于冰上降温。

(4)转膜完成后，将硝酸纤维素膜放在封闭液(5％脱脂奶粉)中，室温水平摇动孵育1小时。

(5)封闭完成后，用合适的一抗室温孵育硝酸纤维素膜1小时。

(6)TBST洗液重复清洗硝酸纤维素膜5次，每次5分钟。

(7)继续用稀释好的二抗室温孵育硝酸纤维素膜1小时。

(8)TBST洗液重复清洗硝酸纤维素膜5次，每次5分钟。

(9)将化学发光显色底物溶液A和B等体积混合后，加在硝酸纤维素膜上，进行显色。

(五)Treg的体外抑制实验具体步骤

(1)Treg细胞预处理。在实验前Treg细胞用抑制剂预先处理不同时间。

(2)将人PBMC细胞或者人CD4+CD25-细胞用PBS稀释至每毫升1×108个细胞。

(3)加入5-(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester,CFSE)或者Cell trace violet至其终浓度为5μM，混匀后37℃避光孵育10分钟。

(4)用25倍体积并含有5％血清的培养基洗涤细胞两次后计数，并将细胞稀释至合适的浓度。

(5)将Treg细胞加入U底的96孔板中，然后将其2倍系列稀释至其他孔。

(6)将CFSE或Cell trace violet染色的效应T细胞按一定比例加入到含有Treg细胞的孔中。

(7)培养4天后，收集细胞进行细胞死活的染色(fixable viability dye,eFluor780,eBioscience)和抗CD8-APC或者抗CD4-A700表面抗体(eBioscience)的染色。

(8)用BD Fortessa仪器进行检测，并用FlowJo软件进行结果分析。

实施例1：没食子酸-小鼠MC皮下移植肿瘤生长实验

小鼠皮下注射2×105MC38细胞，在第七天时小鼠出现可以目测的肿瘤大小。通过游标卡尺测量评估肿瘤体积。将没食子酸溶解于PBS中，并从第7天开始每日腹腔注射，剂量为每日5mg/kg。当肿瘤达到1500mm3时，处死小鼠并拍照统计。

实验组分为2组，给药情况如下：

对照组(n＝5)：给予PBS处理；

没食子酸组(n＝5)：每日施用5mg/kg没食子酸(GA)。

结果：

实验结果如图1和2所示。没食子酸具有一定的抑制肿瘤生长的效果，第18天的相对抑瘤率约为52.4％。

实施例2：没食子酸联合Anti-PD-1抗体抑制小鼠MC皮下移植肿瘤生长

MC38皮下移植瘤模型中，小鼠皮下注射2×105MC38细胞，在第七天时小鼠出现可以目测的肿瘤大小。通过游标卡尺测量评估肿瘤体积。将没食子酸(5mg/kg)溶解于PBS中，并从第7天开始每日腹腔注射。同时，每三天腹腔注射一次Anti-PD-1抗体，共三次。当肿瘤达到1500mm3时，处死小鼠并拍照统计。同时，另一批每组10只，统计生存曲线。

实验组分为4组，给药情况如下：

对照组(n＝8)：给予PBS处理；

Anti-PD-1组(n＝6)：每三天施用一次10mg/kg的Anti-PD-1抗体；

没食子酸组(n＝6)：每日施用5mg/kg；

没食子酸联合Anti-PD-1组(n＝6)：每日施用5mg/kg没食子酸+每三天施用一次10mg/kg的Anti-PD-1抗体。

结果

实验结果如表1和图3-5所示。

表1.没食子酸和Anti-PD-1抗体对MC38皮下移植瘤生长影响的实验数据

表1B

*：第18天的抑制率＝(对照组肿瘤体积-各给药组的肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100％

表1和图3-4的结果，与对照组或GA单用组或Anti-PD-1单用组相比，没食子酸联合Anti-PD-1可显著抑制肿瘤生长，具有协同作用。

图5的结果表明，与对照组或GA单用组或Anti-PD-1单用组相比，没食子酸联合Anti-PD-1可显著延长实验动物的生存期，尤其是联用组在第60天时，仍有4只小鼠存活。各组小鼠分别用同型IgG抗体、没食子酸、anti-PD-1抗体或没食子酸联合anti-PD-1抗体治疗。结果表明，没食子酸或anti-PD-1给药可减缓MC38肿瘤生长，而没食子酸和anti-PD-1联合治疗则更显著地限制MC38肿瘤生长，并延长MC38荷瘤小鼠的总体生存期

上述结果表明，没食子酸可以促进MC38皮下移植瘤模型中Anti-PD-1抗体抗肿瘤效果并延长生存期。

实施例3：没食子酸-AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展实验

在AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌模型中，诱导模型的第八十天起，没食子酸溶解于PBS中每日腹腔注射，剂量为5mg/kg。同时，每三天腹腔注射一次Anti-PD-1抗体，共五次，剂量为10mg/kg。同时，另一批每组8只小鼠，用于统计生存曲线。

同型对照组：n＝4；anti-PD-1组：n＝4；没食子酸：n＝4；没食子酸加anti-PD-1:n＝5，从第80天开始，每3天腹腔注射anti-PD-1(100ug/次，BioxCell，Cat#BE0146)或同型对照(100ug/次，BioxCell，Cat#BE0083)。没食子酸溶解于PBS中每日腹腔注射，剂量为5mg/kg。

结果：

实验数据如表2和图6-9所示。

表2.没食子酸(GA)和Anti-PD-1抗体对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展的实验数据

表2结果表明，没食子酸或anti-PD-1抗体治疗都可以显著减轻AOM-DSS诱导的结直肠癌的症状，而没食子酸和anti-PD-1抗体联合治疗则更显著地限制结直肠癌的进展，具体表现为肿瘤数量更少，肿瘤直径更小。

上述结果表明，没食子酸可以促进Anti-PD-1抗体在AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌模型中的抗肿瘤效果，并可延长生存期。

实施例4：没食子酸-iTreg实验

4.1没食子酸特异性下调Usp21转录水平

Naive CD4+T细胞诱导分化成iTreg，分别用DMSO和10μmol/L的没食子酸处理iTreg，24小时后，收集细胞用Trizol提取mRNA和反转录成cDNA，q-PCR检测各泛素化酶和去泛素化酶的转录水平。

结果表明，没食子酸处理能够特异性下调Usp21的转录水平(图10)。

此外，在10μmol/L GA浓度下，还检测了Foxp3、泛素化酶Rnf31、Mdm2、Stub1和去泛素化酶Usp7、Usp21、Usp22、Usp44的mRNA水平。实验表明，没食子酸不影响Foxp3和其他泛素化相关酶的转录水平，并且特异性地下调去泛素化酶Usp21的转录水平。

4.2没食子酸特异性下调FOXP3和PD-L1蛋白

设立浓度梯度的没食子酸处理iTreg，浓度分别为0、0.1、1、10μM/L。24小时后收集细胞裂解提取蛋白，利用免疫印迹检测FOXP3和PD-L1蛋白水平。

结果表明，没食子酸处理下调iTreg细胞中的FOXP3和PD-L1蛋白水平(图11-12)，并且FOXP3和PD-L1蛋白的水平下调是GA－浓度依赖性。

4.3没食子酸减弱Treg的抑制性功能

分别用DMSO和10μmol/L的没食子酸处理iTreg。24小时后，将经GA处理的iTreg和CD4+CD25-T细胞共培养。其中，在10μmol/L GA浓度下，在体外的Treg细胞抑制性实验中，两组iTreg再和CTV标记的effective CD4+T细胞以及Anti-CD3/CD28磁珠按一定比例共培养72小时，检测iTreg对effective CD4+T细胞增殖的抑制功能。

结果如图13-14所示，10μM没食子酸处理后的iTreg对effective CD4+T细胞增殖的抑制性减弱，具体表现为增殖的effective CD4+T细胞比例更高。这表明，没食子酸处理可减弱Treg的抑制性功能。

实施例5：Treg特异性敲除USP21-小鼠MC38皮下移植瘤生长实验

对于野生型和特异性敲除小鼠(即Treg特异性敲除USP21-小鼠)，皮下注射2×105MC38细胞，从第七天开始使用游标卡尺测量评估肿瘤体积。当肿瘤达到1500mm3时，处死小鼠并拍照统计。

结果

肿瘤追踪数据表明USP21fl/flFOXP3cre小鼠皮下移植瘤生长相比FOXP3cre小鼠更加缓慢，在第21天取出肿瘤拍照统计时，发现USP21fl/flFOXP3cre小鼠皮下移植瘤大小相比FOXP3cre小鼠显著减小。

上述结果表明，Treg特异性敲除USP21可以抑制MC38肿瘤的生长(图15-16)。

实施例6：Treg特异性敲除USP21-小鼠AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌发展实验

8周龄野生型和特异性敲除小鼠腹腔注射偶氮甲烷(AOM)，七天后，将2％右旋糖酐硫酸钠(DSS)添加到饮用水中7天，然后常规饮用水2周。DSS处理周期重复两次，第100天处死小鼠，取出整个肠道后纵向切开并用PBS清洗干净，拍照并统计肿瘤大小数量。

结果

如图17-20所示，USP21fl/flFOXP3cre小鼠的肿瘤发展比FOXP3cre小鼠表现为更轻缓，具体表现为肿瘤数量更少，肿瘤直径更小。这表明，Treg特异性敲除USP21可以抑制AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌的发生和发展。

讨论

没食子酸具有抗氧化性，发挥清除体内氧自由基的作用，对疾病的预防和治疗具有一定程度的帮助。没食子酸具有一定的抗肿瘤效果，对多种肿瘤细胞系具有杀伤作用的同时对正常的免疫细胞毒性较小。更重要的是，没食子酸广泛存在并且可以口服。在人体中，与结直肠癌进展有关的菌群之一就是解没食子酸链球菌。同时，没食子酸能够被植物乳酸杆菌和枯草芽孢杆菌产生，而这两种菌已被证实是肠道益生菌且抑制结直肠癌的发生发展。然而，目前尚没有没食子酸在治疗结直肠癌以及促进Anti-PD-1抗体介导抗肿瘤效应方面的报道。

免疫治疗已被证明是多种癌症的有效治疗方法。但是，尽管针对免疫调节因子CTLA4和PD-L1/PD-1的抗体在临床上取得了成功，但只有一部分人表现出持久的反应，这表明需要对肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)进行更广泛的研究。近些年来，随着单细胞测序技术的发展，我们已经可以利用这一手段鉴别实体瘤内及其肿瘤微环境中不同的细胞亚群以及相关基因的表达水平，来帮助我们进一步了解肿瘤发生、发展、转移、耐药和免疫逃逸的机制。De Simone等人利用单细胞测序技术将浸润结直肠癌的辅助性T细胞1(Th1)、辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Regulatory T cell，Treg)的转录组与正常组织中相同亚群的转录组进行比较，发现肿瘤浸润的Treg细胞具有高度抑制性，上调了几个免疫检查点例如PD-L1和PD-L2。这些免疫检查点的上调以前在Treg上没有被描述过，而且，这些上调也与不良预后相关。

同时，Shimon Sakaguchi等人发现两种Treg调控结直肠癌病人的预后：Foxp3highTreg和Foxp3low Treg。Foxp3low Treg抑制功能下降并且分泌IFN-γ的能力更强，Foxp3high Treg的比例与结直肠癌病人的预后负相关。这些研究结果暗示了结直肠癌肿瘤微环境中Treg在肿瘤微环境中扮演了重要的作用。

泛素化的可逆性和成员多样性使得参与泛素化调控的成员成为重要的疾病治疗靶点。尤其是作为一类具有明确的催化机制的酶，去泛素化酶作为潜在药物靶点具有内在吸引力，越来越多的证据表明去泛素化酶在多个水平上参与肿瘤的发生发展。同时，不断的有去泛素化酶被证实参与免疫调控，例如，USP21已被证明参与调节FOXP3的稳定性，而FOXP3的稳定性对Treg的功能具有决定意义。同时临床数据表明，USP21在肝癌和结直肠癌患者中过度表达并且与不良预后相关，这表明USP21是一个非常具有潜力的药物靶点。但是，目前依然没有针对USP21靶点的药物进入临床阶段。

结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。结直肠癌患者外周血和肿瘤微环境中FOXP3+Treg细胞比例上升，并且肿瘤浸润的调节性T细胞具有很强的抑制功能，这群调节性T细胞上调了PD-L1和PD-L2等抑制相关的限制点。因此，在综合治疗前，进一步探讨肿瘤微环境的调节性T细胞表型和特征并靶向调节性T细胞应用治疗是非常重要的。

在本发明中，本发明人通过构建小鼠皮下MC38移植瘤模型和AOM/DSS化学试剂诱导自发结直肠癌两个模型，验证了没食子酸可以治疗结直肠癌和促进Anti-PD-1介导抗肿瘤效应。

通过实时荧光定量-PCR、免疫印记、Treg体外抑制实验等分子生物学技术，验证了没食子酸可以抑制去泛素化酶USP21的表达来调控FOXP3和PD-L1的稳定性，进而抑制调节性T细胞(Treg)的功能。

进一步地，本发明人通过在特异性敲除小鼠和野生型小鼠上构建小鼠皮下MC38移植瘤模型和AOM/DSS化学试剂诱导自发结直肠癌两个模型，验证了Treg特异性敲除USP21可以抑制结直肠癌发生发展。

本发明的实验结果首次揭示了，没食子酸通过靶向抑制USP21，抑制结直肠癌和促进Anti-PD-1介导抗肿瘤效应。

本发明的发现可更好地指导给药方式和规范结直肠癌治疗指南。基于本发明研究结果，可根据临床结直肠癌患者肿瘤组织Usp21表达水平来进行相应的治疗，其中Usp21表达高的患者更适合联用没食子酸和Anti-PD-1联用治疗方案。

值得注意的是，没食子酸对于肿瘤细胞PD-L1蛋白水平的下调已被证实，当其对没食子酸如何下调PD-L1蛋白水平调控机制依然不甚明确，本发明研究发现没食子酸可以通过调控Treg的Usp21的表达，而USP21作为一个去泛素化酶，与PD-L1相互作用并调控PD-L1蛋白的稳定性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。