一种富含大黄酚的复方口腔护理喷剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及口腔护理喷剂。

背景技术

大黄(Rheum palmatum L)是多种蓼科大黄属的多年生植物的合称，也是中药材的名称。在中国地区的文献里，“大黄”指的往往是马蹄大黄。在中国，大黄主要作药用，但在欧洲及中东，他们的大黄往往指另外几个作食用的大黄属品种，茎红色，气清香，味苦而微涩，嚼之粘牙，有砂粒感。秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖。除去细根，刮去外皮，切瓣或段，绳穿成串干燥或直接干燥中药大黄具有攻积滞、清湿热、泻火、凉血、祛瘀、解毒等功效。

大黄酚(Chrysophanol，Chry)是从蓼科植物大黄中提取的有效成分之一，化学名称为1，8-二羟基-3-甲基蒽醌(1，8-dihydroxy-3-methyl anthraquinone)分子量为254.23。研究表明，大黄酚具有止咳、抗菌、止血作用，并能促进肠管动物的神经兴奋和肌肉麻痹。但至今未见在口腔护理喷剂上的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种富含大黄酚的复方口腔护理喷剂，以解决上述技术问题。

本发明的目的在于提供一种富含大黄酚的复方口腔护理喷剂的制备方法，以制备富含大黄酚的复方口腔护理喷剂。

本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：

一种富含大黄酚的复方口腔护理喷剂，其特征在于，按质量份数计，包括，大黄提取液30-40份、连翘提取液10-15份、蒲公英提取液20-25份、马齿苋提取液30-35份；

还包括薄荷脑0.5-0.6份、吐温80 0.2-0.3份或苯甲酸钠0.01-0.02份中的至少一种。

优选，大黄提取液35份、连翘提取液12份、蒲公英提取液22份、马齿苋提取液30份以及薄荷脑0.55份、吐温80 0.23份、苯甲酸钠0.02份，余量为提取液允许的误差。

薄荷脑可以用薄荷提取液代替。

大黄提取液可以用大黄酚纳米颗粒溶液代替。大黄酚纳米颗粒溶液由大黄酚纳米颗粒和溶剂构成。

大黄酚纳米颗粒，由聚乙二醇单甲醚衍生物、大黄酚衍生物和二硫醇单体经交联反应得到，

其中，所述聚乙二醇单甲醚衍生物具有式(I)结构：

式(I)中，R1为氢或甲基，20≤m≤500；

所述大黄酚衍生物具有式(II)结构：

式(II)中，R2为氢或甲基；

所述二硫醇单体具有式(III)结构：

式(III)中，n为2～10的整数。

溶剂为蒸馏水或质量百分比为50-75％的乙醇。

一种富含大黄酚的复方口腔护理喷剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)将大黄、连翘、蒲公英、马齿苋分别加入溶剂中，在在85-95℃下进行浸提，提取时间为40-80分钟，提取完成后进行过滤，将滤液进行冷藏保存，分别获得大黄提取液、连翘提取液、蒲公英提取液、马齿苋提取液；

2)将上述提取液按照质量分数计，大黄提取液30-40份、连翘提取液10-15份、蒲公英提取液20-25份、马齿苋提取液30-35份混合均匀；

在进行混合时，还加入薄荷脑0.5-0.6份、吐温80 0.2-0.3份或苯甲酸钠0.01-0.02份中的至少一种，获得混合液；

3)将混合液装瓶后，立即进行灭菌。

步骤一中，浸提所使用的溶剂为蒸馏水或质量百分比为50-75％的乙醇。所述大黄与溶剂的料液比为1:8-15g/mL；所述连翘与溶剂的料液比为1:90-110g/mL；所述蒲公英与溶剂的料液比为1:40-80g/mL；所述马齿苋与溶剂的料液比1:90-110g/mL。薄荷脑0.55份，可以用薄荷提取液代替。所述薄荷与溶剂的料液比1:90-110g/mL。所述的薄荷为薄荷的全草或叶。

所述大黄为大黄的根，所述连翘为连翘的茎叶，所述蒲公英为蒲公英的全草或根，所述马齿苋为马齿苋的全草。

大黄提取液可以用大黄酚纳米颗粒溶液代替。大黄酚纳米颗粒溶液由大黄酚纳米颗粒和溶剂构成。

大黄酚纳米颗粒的制备方法为，在有机碱作用下，聚乙二醇单甲醚衍生物、大黄酚衍生物和二硫醇单体在有机溶剂中发生交联反应，得到大黄酚纳米颗粒：

其中，所述聚乙二醇单甲醚衍生物具有式(I)结构：

式(I)中，R1为氢或甲基：20≤m≤500；

所述大黄酚衍生物具有式(II)结构：

式(II)中，R2为氢或甲基；

所述二硫醇单体具有式(III)结构：

式(III)中，n为2～10的整数。

优选，所述有机碱为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、三乙胺和正丙胺中的一种或多种。

优选，所述有机溶剂为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或四氢呋喃。

优选，所述聚乙二醇单甲醚衍生物和大黄酚衍生物的摩尔比为1:5～100；所述二硫醇单体的摩尔数为所述大黄酚衍生物中双键基团和所述聚乙二醇单甲醚衍生物中双键基团的总摩尔数的0.5～0.6倍。

优选，所述交联反应的温度为15～50℃，所述交联反应的时间为12h～98h。

大黄酚纳米颗粒溶液为将大黄酚纳米颗粒放入溶剂中，混合均匀即可，溶剂为蒸馏水或质量百分比为50-75％的乙醇。所述大黄酚纳米颗粒与溶剂的料液比1:400-600g/mL。

有益效果：本发明以大黄为主要原料，辅以连翘、蒲公英、马齿苋、薄荷等多种中药材，研制了一种气味清新，色泽均一，口感酸甜清爽、无异味，易于携带和使用的口腔喷剂，该喷剂的抑菌效果较好，为大黄等中药材的开发利用提供了理论依据。

附图说明

图1为大黄酚对P.gingivalis微观形态的影响对比图；

图2为大黄酚对P.gingivalis后胞内核酸外泄的影响对比图；

图3为大黄酚对P.gingivalis胞内蛋白质外泄的影响对比图；

图4为P.gingivalis的荧光显微镜图像对比图。

具体实施方式

为了本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图，进一步阐述本发明。

具体实施例1

富含大黄酚的复方口腔护理喷剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将大黄、连翘、蒲公英、马齿苋分别加入蒸馏水中，所述大黄与蒸馏水的料液比为1:10g/mL；所述连翘与蒸馏水的料液比为1:100g/mL；所述蒲公英与蒸馏水的料液比为1:50g/mL；所述马齿苋与蒸馏水的料液比1:100g/mL。

在在90℃下进行浸提，提取时间为60分钟，提取完成后进行过滤，将滤液进行冷藏保存，分别获得大黄提取液、连翘提取液、蒲公英提取液、马齿苋提取液；

2)将上述提取液按照质量分数计，大黄提取液30-40份、连翘提取液10-15份、蒲公英提取液20-25份、马齿苋提取液30-35份混合均匀；

在进行混合时，还加入薄荷脑0.5-0.6份、吐温80 0.2-0.3份或苯甲酸钠0.01-0.02份中的至少一种，获得混合液；

3)将混合液装瓶后，立即进行灭菌。

具体实施例2

富含大黄酚的复方口腔护理喷剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将大黄、连翘、蒲公英、马齿苋分别加入质量百分比为63％的乙醇中，所述大黄与质量百分比为63％的乙醇的料液比为1:12g/mL；所述连翘与质量百分比为63％的乙醇的料液比为1:90g/mL；所述蒲公英与质量百分比为63％的乙醇的料液比为1:60g/mL；所述马齿苋与质量百分比为63％的乙醇的料液比1:110g/mL。

在85℃下进行浸提，提取时间为40分钟，提取完成后进行过滤，将滤液进行冷藏保存，分别获得大黄提取液、连翘提取液、蒲公英提取液、马齿苋提取液；

2)将上述提取液按照质量分数计，大黄提取液30-40份、连翘提取液10-15份、蒲公英提取液20-25份、马齿苋提取液30-35份混合均匀；

在进行混合时，还加入薄荷脑0.5-0.6份、吐温80 0.2-0.3份或苯甲酸钠0.01-0.02份中的至少一种，获得混合液；

3)将混合液装瓶后，立即进行灭菌。

上述两个具体实施例所获得的富含大黄酚的复方口腔护理喷剂的指标测定情况如下：

感官理化指标，参照QBT 2945-2012口腔清洁护理液产品的感官理化指标，酸甜清爽，有薄荷清凉口感，无异味。

微生物指标，参照QBT 2945-2012检测，致病菌未检出。

防腐剂，口腔喷雾剂为多剂量口服液体制剂，应加入适当防腐剂，GB2760-2014规定苯甲酸限量为0.2g/kg，故而本实验选取0.02％苯甲酸钠作为防腐剂。

通过实验，确定复方口腔护理喷剂的最佳配比为：大黄提取液35％、连翘提取液12％、蒲公英提取液22％、马齿苋提取液30％以及薄荷脑0.55％、吐温80 0.23％、苯甲酸钠0.02％。制备出的口腔喷剂外观呈淡黄色液体，均匀一致，酸甜清爽，具有薄荷清凉口感，无异味。抑菌实验表明，本产品对口腔厌氧菌有良好的抑菌作用，为今后其在口腔护理品中的应用提供了很好的实验研究依据。

薄荷脑0.55份，可以用薄荷提取液代替。所述薄荷与溶剂的料液比1:90-110g/mL。所述的薄荷为薄荷的全草或叶。

所述大黄为大黄的根，所述连翘为连翘的茎叶，所述蒲公英为蒲公英的全草或根，所述马齿苋为马齿苋的全草。

大黄提取液可以用大黄酚纳米颗粒溶液代替。大黄酚纳米颗粒溶液由大黄酚纳米颗粒和溶剂构成。

大黄酚纳米颗粒的制备方法为，在有机碱作用下，聚乙二醇单甲醚衍生物、大黄酚衍生物和二硫醇单体在有机溶剂中发生交联反应，得到大黄酚纳米颗粒：

其中，所述聚乙二醇单甲醚衍生物具有式(I)结构：

式(I)中，R1为氢或甲基：20≤m≤500；

所述大黄酚衍生物具有式(II)结构：

式(II)中，R2为氢或甲基；

所述二硫醇单体具有式(III)结构：

式(III)中，n为2～10的整数。

所述有机碱为1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、三乙胺和正丙胺中的一种或多种。所述有机溶剂为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或四氢呋喃。所述聚乙二醇单甲醚衍生物和大黄酚衍生物的摩尔比为1:5～100；所述二硫醇单体的摩尔数为所述大黄酚衍生物中双键基团和所述聚乙二醇单甲醚衍生物中双键基团的总摩尔数的0.5～0.6倍。所述交联反应的温度为15～50℃，所述交联反应的时间为12h～98h。

大黄酚纳米颗粒溶液为将大黄酚纳米颗粒放入溶剂中，混合均匀即可，溶剂为蒸馏水或质量百分比为50-75％的乙醇。所述大黄酚纳米颗粒与溶剂的料液比1:400-600g/mL。

本专利所用的大黄提取液中富含大黄酚，为了验证本发明中所用的主要提取物中所富含的大黄酚的抑菌效果，申请人进行了如下实验：

1材料与方法

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)ATCC33277购于美国菌种保藏中心(ATCC)。

2实验方法

2.1抗口腔厌氧菌供试物抗菌活性的测定

取待测菌液1.5mL加入5mL培养基，置37℃恒温箱培养48h；2500rpm离心5min，弃去上清液，用PBS清洗两遍，菌体用培养基稀释，用紫外分光光度计测定OD600，培养基调整使OD600为0.5左右，此时菌浓约为1.5×108cfu/mL；将待测菌液在上述所得菌浓基础上再稀释150倍，使菌浓约为1×106cfu/mL，此时的菌浓即为上样悬菌液。

用96孔U型微孔稀释板进行测定，每排12孔，第2-6孔各加入100μL浓度梯度的药物，第8-12孔加入100μL系列浓度第二种药物；其中，第1、7孔加入100μL培养基作为阳性对照，每组浓度梯度加四排；第1-3、5-7排加100μL悬菌液，第4、8排加100μL无菌培养基作为空白对照；药液和菌液上样完毕后，振荡混合，盖好板盖，置37℃恒温箱培养一定时间(牙龈卟啉单胞菌60h，伴放线聚集杆菌18h)，用酶标仪测定OD600。与对照组相比，肉眼无可见菌体生长的最低浓度为最小抑菌浓度。

肉桂醛对牙龈卟啉单胞菌的最小抑菌浓度

2.2供试物对口腔厌氧菌形态的影响

收获生长至对数期的菌体，离心洗涤三次，用PBS缓冲液(pH＝7.4)重悬至OD600＝1，此时菌体浓度为1.5×108CFU/mL。吸取1mL至测试管中，加入一定浓度的药物，使菌体终浓度为1×108CFU/mL，在37℃厌氧孵育4h。5000rpm离心10min，弃去上清液，PBS清洗，用2.5％戊二醛4℃固定过夜。PBS清洗三遍洗去固定液，30％、40％、50％、70％、90％、100％乙醇梯度脱水，醋酸正戊酯置换，冷冻干燥后扫描电镜喷金观察。

图1中，a:Control，b:大黄酚；1:×20，000，2:×30，000。

2.3供试物对口腔厌氧菌胞内核酸泄露的影响，参照图2

细菌37℃厌氧环境中培养24h，收集对数生长期的菌体，5000rpm离心10min，PBS(pH＝7.4)溶液洗涤两次，重悬至OD600＝1.0。在厌氧管中加入悬菌液和药液，使菌体终浓度为1×108CFU/mL，药物终浓度为0、1×MIC、2×MIC、4×MIC。37℃孵育一定时间，分别于0、1h、2h、4h后取样，6000rpm离心10min，分光光度计测上清液在260nm处的吸光度。

2.4供试物对口腔厌氧菌可溶性蛋白泄露的影响，参照图3

细菌37℃厌氧环境中培养24h，收集对数生长期的菌体，5000rpm离心10min，0.9％NaCl溶液洗涤两次，重悬至OD600＝1.0。在厌氧管中加入悬菌液和药液，使菌体终浓度为1×108CFU/mL，药物终浓度为1×MIC、2×MIC、4×MIC，对照组加入100μLNaCl溶液。37℃孵育一定时间，分别于0、1h、2h、4h后取样，6000rpm离心10min，取上清液于4℃冰箱备用。

BCA蛋白定量。按BCA试剂A：试剂B＝50:1配制适量BCA工作液，充分混匀；将标准品贮存液用0.9％NaCl溶液稀释至31.25～1000μg/mL；将25μL标准品和样品分别添加于96孔板的微孔中，各孔加入200μLBCA工作液，充分混匀。盖上96孔板，37℃孵育30分钟。冷却到室温，用酶标仪测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。

Bradford蛋白浓度测定。各取10μL的标准品和未知样品至相应标记的微孔板中，滴加300μLBradford蛋白浓度测定染液至每孔混匀并充分震荡30秒。停止震荡，对于大多数情况，在室温下孵育样品10分钟；在读数仪器中测量595nm时的吸光值。将所有标准品及未知样品的数值减去595nm下零孔所对的平均值。绘制标准曲线：通过零孔平均值校正每个BSA标准品在其相对应浓度下所对应的数值，在用此标准曲线判断得出每个未知样品的蛋白浓度。

2.5供试物对细胞膜吸收荧光染料的影响，参照图4

细菌37℃厌氧环境中培养24h，收集对数生长期的菌体，5000rpm离心10min，PBS(pH＝7.4)溶液洗涤两次，重悬至OD600＝1.0。在厌氧管中加入悬菌液和药液，使菌体终浓度为1×108CFU/mL，药物终浓度为0、1×MIC、2×MIC。37℃厌氧环境孵育4h。5000rpm离心10min，弃去上清液，PBS清洗两遍，加入荧光染料碘化丙啶PI，黑暗处室温孵育20min，洗去染料，倒置荧光显微镜下观察。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。