一种高经营强度山核桃种植区干腐病的防治方法

技术领域

本发明涉及山核桃种植技术领域，具体涉及一种高经营强度山核桃种植区干腐病的防治方法。

背景技术

山核桃是中国特有的经济树种，其果实不仅营养价值高，而且是一种药食同源的滋补品。山核桃树受病害影响较大，尤其是山核桃干腐病，其潜伏期长，发病周期短，病情发展迅速，难以及时治疗，严重影响山核桃产量，一直是果农们关注的问题。

干腐病，又称溃疡病、墨汁病、墨水病，由弱寄生菌引起，对植物(尤其是木本植物)存在普遍危害，每年在世界范围内造成大量的经济损失。干腐病的严重程度与很多因素有关，比如Management of citrus canker in argentina，asuccess story[J].PlantPathology Journal，2017，33(5)：441-449记载了柑橘溃疡病的严重程度受环境和厄尔尼诺现象(ENSO)的影响；‘冰糖橙’溃疡病发生因子分析及预测模型的建立[J].果树学报，2015，(5)：977-984.记载了气候因素能显著影响冰糖橙溃疡病田间发病规律。

目前山核桃种植区林分结构趋向单一化，人工纯林占比较高，使得山核桃林地植被多样性降低，导致山核桃林抗干腐病害能力显著降低。此外，集约型经营方式下化肥和除草剂的大量施用导致种植区土壤pH快速降低，对山核桃树形成酸胁迫，严重影响树体抗病能力。据调查，浙江省近90％的山核桃树已受到该病害的影响，该现象已经严重影响到山核桃产业的经济效益以及可持续发展。

目前，未有文献探究经营强度和土壤理化性质对山核桃树抗干腐病能力的影响，因此，亟需开发一种对高经营强度样地中山核桃树干腐病的防治方法。

发明内容

本发明提供了一种高经营强度山核桃种植区干腐病的防治方法，通过探究经营强度和土壤理化性质对山核桃树抗干腐病能力的影响。对高经营强度样地中已发病的山核桃树周围土壤进行土壤酸碱处理，利用碳水化合物的组织化学定位方法比较两种土壤改良方法的优缺点。

本发明解决技术问题提供的技术方案如下：

一种高经营强度山核桃种植区干腐病的防治方法，包括如下步骤：

(1)检测山核桃种植区不同位置山核桃树体树冠垂直投影范围内土壤pH或铵硝比；

(2)根据土壤pH或铵硝比对不同位置山核桃周围土壤进行土壤酸碱处理，实现高经营强度山核桃种植区干腐病的防治。

所述的土壤pH为浅层pH值、深层pH值或平均pH值。

所述铵硝比为20～40cm土层的铵硝比。

所述的根据土壤pH或铵硝比调整不同位置山核桃树体进行土壤酸碱处理，实现高经营强度山核桃种植区干腐病的防治，具体为：对浅层pH值、深层pH值或平均pH值的取值在5.0以下或者铵硝比或5～8的山核桃树体周围土壤进行土壤酸碱处理。

所述的土壤酸碱处理为施加生石灰和钙镁磷肥。

所述的生石灰和钙镁磷肥的施加量为4.5kg∶2kg～7.5kg∶5kg。

所述的生石灰和钙镁磷肥之间质量比为1∶1.5～2.25。

在雨后生石灰和钙镁磷肥被冲刷掉落的情况下，及时再次施加生石灰和钙镁磷肥。

与现有技术相比，有益效果在于：本发明所述防治方法可快速预测山核桃干腐病的发生并提前防治。

附图说明

图1为不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤pH差异。

图2为不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中交换性酸总量、交换性H和交换性铝含量差异。

图3为不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中水解氮、有效P和速效K含量差异。

图4为不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中铵态氮含量差异。

图5为不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中硝态氮含量差异。

图6为不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中铵硝比差异。

图7为高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥和海藻酸+硫酸钾镁处理后周皮+皮层碳水化合物组织化学定位细胞图，标尺＝50μm；A为生石灰+钙镁磷肥CK组；B为生石灰+钙镁磷肥低剂量组；C为生石灰+钙镁磷肥高剂量组；D为海藻酸+硫酸钾镁CK组；E为海藻酸+硫酸钾镁处理组。

图8为高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥和海藻酸+硫酸钾镁处理后韧皮部碳水化合物组织化学定位细胞图，标尺＝50μm；A为生石灰+钙镁磷肥CK组；B为生石灰+钙镁磷肥低剂量组；C为生石灰+钙镁磷肥高剂量组；D为海藻酸+硫酸钾镁CK组；E为海藻酸+硫酸钾镁处理组。

图9为高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥处理后栓内层碳水化合物组织化学定位R值(A)、G值(B)、B值(C)、平均灰度值(D)和加权灰度值(E)的变化。

图10高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥处理后皮层薄壁细胞碳水化合物组织化学定位R值(A)、G值(B)、B值(C)、平均灰度值(D)和加权灰度值(E)的变化。

图11高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥处理后韧皮射线细胞碳水化合物组织化学定位R值(A)、G值(B)、B值(C)、平均灰度值(D)和加权灰度值(E)的变化。

图12高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经海藻酸+硫酸钾镁处理后栓内层碳水化合物组织化学定位R值、G值、B值、平均灰度值和加权灰度值的变化。

图13高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经海藻酸+硫酸钾镁处理后皮层薄壁细胞碳水化合物组织化学定位R值、G值、B值、平均灰度值和加权灰度值的变化。

图14高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经海藻酸+硫酸钾镁处理后韧皮射线细胞碳水化合物组织化学定位R值、G值、B值、平均灰度值和加权灰度值的变化。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

在浙江省杭州市桐庐县以及临安区的湍口镇、昌化开展实验。

临安4号样地、临安5号样地和临安6号样地为高经营强度样地，去除林下灌木、杂草，翻耕土壤，施用化肥和除草剂等，山核桃植株生长状况较差。

临安1号样地和桐庐2号样地为低经营强度样地，自然条件为主，少量或无外加化肥、农药和除草剂等。

汇总临安l～6号样地山核桃植株的生长状况，并取样临安1～6号样地中易感病株以及健康病株树下土壤检测土壤理化性质。

土壤采样方法：在取样树体树冠垂直投影范围内，随机选5个点，采集0-40cm深度土壤样品，将每株树5个点采集的土样充分混匀后，用四分法取1kg混合土样带回实验室。样品经风干后过20目筛，测定pH、交换性酸、交换性H

参照《土壤农业化学分析方法》和《土壤分析技术规范》检测土壤理化性质。

A.土壤pH值检测：取风干土壤10g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入除CO

B.土壤交换性酸(氢、铝)的测定，采用氯化钾交换-中和滴定法。

C.土壤水解氮含量检测，采用碱解扩散法。

D.土壤有效磷检测，采用盐酸-氟化铵提取-钼锑抗比色法。

E.土壤速效钾检测，采用乙酸铵浸提-火焰光度计法。

F.土壤铵态氮检测。

G.土壤硝态氮检测，采用酚二磺酸比色。

不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤理化性质差异如图1～6所示。

不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤pH差异如图1所示，从图1可知，低经营强度条件下，健康株和易感病株的土壤pH没有显著差异；高经营强度条件下，健康株的土壤pH显著高于易感病株，且高经营强度条件下易感病株的土壤pH与低经营强度条件下的土壤pH处于同一水平。

不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中交换性酸含量差异如图2所示，由图2可知，不同经营强度下交换性酸总量和交换性铝离子含量差异显著，低经营强度条件下两者含量较高；同一经营强度之间，健康株和易感病株之间也有显著差异但规律不同，低经营强度条件下健康株土壤交换性酸总量和交换性铝离子含量高于易感病株，而高经营强度条件下易感病株高于健康株；交换性氢离子的规律性不明显，低经营强度条件下健康株和易感病株之间无显著差异，而高经营强度条件下健康株和易感病株之间有显著差异，易感病株土壤中交换性H离子含量较高。

不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中N、P、K含量差异如图3所示，由图3可知，经营方式对土壤中的N、P、K元素有较明显的影响，高经营强度条件下，土壤中水解氮的含量显著增高，速效K的含量显著降低，而有效P的含量未受明显影响；水解氮含量在相同经营方式之间并没有显著差异，但是易感病株土壤中的水解氮含量均高于健康株；有效P的含量规律类似于水解氮，易感病株土壤中含量略高；速效K在同一经营方式之间有差异，健康株土壤中速效K的含量均高于易感病株，但差异不显著。

不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中铵态氮含量差异如图4所示，从图中来看，20cm土层铵态氮含量的规律与40cm土层的规律相似：不同经营强度下，高经营强度的土壤铵态氮含量显著高于低经营强度土壤；同一经营强度之间，易感病株土壤中铵态氮含量略高于健康株，无显著差异。

不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中硝态氮含量差异如图5所示，由图5可知，硝态氮的含量差异较为显著，总体来说，20cm土层和40cm土层规律类似：在低经营强度条件下硝态氮含量较高；比较同一经营强度条件之间的含量可知，低经营强度条件下健康株土壤中硝态氮含量高于易感病株，而高经营强度条件下易感病株土壤中硝态氮含量高于健康株。

不同经营强度山核桃种植区健康株和易感病株土壤中铵硝比差异如图6所示，由图6可知，土壤中铵硝比差异较为显著，20cm土层和40cm土层中高经营强度条件下健康株土壤中铵硝比最高，低经营强度条件下健康株土壤中铵硝比最低；比较同一经营强度之间铵硝比差异可知，低经营强度时感病株土壤铵硝比高于健康株，而高经营强度时健康株土壤的铵硝比较高。

通过Pearson相关系数得知，低经营强度条件下土壤理化指标与山核桃树抗干腐病能力无显著相关性；高经营强度条件下土壤pH值和铵硝比与山核桃抗干腐病能力呈显著正相关，交换性酸总量与山核桃抗干腐病能力呈显著负相关，交换性H离子含量和硝态氮含量与山核桃抗干腐病能力呈极显著负相关。

表1

*P＜0.05；**P＜0.01。

由表1可知，高经营强度条件下，土壤pH与山核桃抗干腐病能力呈显著正相关，交换性酸总量与山核桃抗干腐病能力呈显著负相关，交换性H离子含量与山核桃抗干腐病能力呈极显著负相关，硝态氮含量与山核桃抗干腐病能力呈极显著负相关，铵硝比与山核桃抗干腐病能力呈显著正相关。

高经营强度条件下感病种植区土壤酸碱实验处理：对高经营强度山核桃种植区感病后的山核桃树分别进行土壤酸碱处理，具体方法如下：

海藻酸+硫酸钾镁处理：选取感病程度严重且近似的山核桃树，分为对照(CK)组和处理组，每组3株山核桃树；对照组不做外源处理，处理组每株施加海藻酸5kg和硫酸钾镁2kg，距树干1m外至树冠滴水线范围内的地面均匀浇施。

生石灰+钙镁磷肥处理：选取感病程度严重且近似的山核桃树，分为对照(CK)组、低剂量(Low Level)组和高剂量(High Level)组，每组3株山核桃树；对照组不做外源处理；低剂量组每株施加生石灰7.5kg和钙镁磷肥4kg，沿树冠滴水线沟施；高剂量组每株施加生石灰15kg和钙镁磷肥8kg，施用方法同低剂量组。

山核桃树皮采集：所有树皮均采自西南方向0.5m处，采取后用单面刀片切成1-2mm

I.石蜡切片法

(1)取材取健康、标准的材料，切成1-2mm3的小块。

(2)固定把采下的材料立即固定在FAA固定液中，放置24小时以上，以防止细胞收缩变形，之后用真空泵抽气至无气泡产生。

(3)脱水固定完以后，依次经过70％、85％、95％、100％酒精脱水，前两级酒精脱水时应用真空泵抽气至无气泡。脱水酒精的用量约为材料体积的3-5倍，每级酒精停留时间为1-2小时(视材料而定，脱水困难的材料可适当延长时间，但每级不超过4h)，为了使材料彻底脱水，最后需再更换一次纯酒精。

(4)透明经两次纯酒精脱水以后，依次经2/3酒精+1/3二甲苯(体积占比)、1/2酒精+1/2二甲苯、1/3酒精+2/3二甲苯、二甲苯，对材料进行透明化处理，每级2小时(视材料而定，透明较困难的材料可适当延长时间，但每级不超过4h)。在酒精与二甲苯体积各半的步骤时，加入少许番红干粉，使材料着色，以便于材料包埋在石蜡中后容易看见，便于切片时掌握材料的方向。

(5)浸蜡先用单面刀片将过炉过的石蜡切成小块，然后在盛有材料及透明剂(二甲苯)的青霉素小瓶内放入一条纸带(宽度略小于青霉素小瓶)，将石蜡小块放在纸带上(避免石蜡与材料直接接触引起收缩)，石蜡的量约与透明剂相同，盖上瓶塞，放入35℃烘箱过夜。过夜后打开瓶塞放入60℃烘箱中让透明剂慢慢挥发，等透明剂完全挥发完后将原溶液倾去，更换两次熔融状态的纯蜡(温度不宜太高)，每次间隔4小时，之后即可包埋。

(6)包埋包埋之前先准备包埋用的纸盒，纸盒用较硬而光滑的纸折成。之后准备镊子、一桶冷水、酒精灯及火柴。包埋时将融化的石蜡连同材料一起倒入纸盒内，然后将镊子在酒精灯上烧热，迅速把材料按需要的切面排列整齐。等石蜡表面出现一层蜡膜后平平放入冷水中，使其很快凝固。

(7)修块已经包埋好的材料，用刀片切成每一小块蜡块包含一个材料，并将小块修成六面体，用熔融状态的石蜡固定在长方形硬木块(其中一面锯出纵横沟纹)上，待石蜡冷凝后用单面刀片将材料四周多余的蜡修去。

(8)切片使用转轮式切片机(YD-1508A，金华市益迪医疗设备有限公司)进行切片，厚度为8-10μm。

(9)粘片用迈耶粘贴剂(Meyer affixative)(配方：新鲜的鸡蛋白25ml、甘油25ml、麝香草酚0.5g)粘片，粘片完成后先在烘片机(KD-H，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)上将表面水分烘干，再放入37℃恒温箱中，烘大约一周。

糖的组织化学定位高碘酸-席夫反应法(PAS法)步骤如下：

在酒精灯上烤烘干的石蜡切片至石蜡熔化——二甲苯I15min(40℃恒温箱中)——二甲苯II 15min——1/2二甲苯+1/2酒精2min——100％酒精I5min——100％酒精II 5min——95％酒精5min——85％酒精5min——70％酒精5min——蒸馏水5min——自来水冲洗5min——0.5％高碘酸水溶液5min——蒸馏水洗涤3s——席夫试剂15min——漂洗液3min，3次——自来水冲洗3min——蒸馏水2min——70％酒精10s——85％酒精10s——95％酒精10s——100％酒精I 5s——100％酒精II 5s——二甲苯I 2min——二甲苯II2min——中性树胶封片。经此反应处理后，植物的组织可染成不同程度的鲜红色。

封片完成后，将用中性树胶封固完的切片置于光学显微镜(Nikon ECLIPSE E100)下，分别以100倍和400倍放大倍数进行观察。100倍下挑选典型切片，分别对周皮+皮层和韧皮部进行拍照，每个样本重复拍三次，采集的图像利用Image J软件提取RGB颜色特征值、平均灰度值和加权灰度值，读取范围：1cm×1cm。400倍下挑选典型切片，分别对周皮、皮层和韧皮部各类细胞拍照，每个样本重复拍三次，采集的图像利用Image J软件提取各类细胞RGB颜色特征值、平均灰度值和加权灰度值，读取范围：单个细胞。

RGB颜色空间中平均灰度值(Mean Gray Value)＝(R+G+B)/3；

加权灰度值(Weighted Gray Value)＝0.299R+0.587G+0.114B。

高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥处理和海藻酸+硫酸钾镁后周皮+皮层碳水化合物组织化学定位细胞图如图7～8所示。

如图7～8所示，随着生石灰+钙镁磷肥剂量增加，周皮+皮层和韧皮部碳水化合物组织化学定位颜色逐渐变深；海藻酸+硫酸钾镁处理后，颜色变化幅度大于生石灰+钙镁磷肥低剂量组，小于生石灰+钙镁磷肥高剂量组。

高经营强度山核桃种植区感病山核桃树土壤经进行土壤酸碱处理后栓内层、皮层薄壁细胞和韧皮射线细胞碳水化合物组织化学定位R值、G值、B值、加权灰度值和平均灰度值的变化如图9～14所示。由图9可知，感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥处理后栓内层碳水化合物含量显著升高，且高剂量处理组效果显著高于低剂量处理组。由图10可知，感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥处理后皮层薄壁细胞碳水化合物含量显著升高，且高剂量处理组效果显著高于低剂量处理组。由图11可知，感病山核桃树土壤经生石灰+钙镁磷肥处理后韧皮射线细胞碳水化合物含量显著升高，且高剂量处理组效果显著高于低剂量处理组。由图12可知，海藻酸+硫酸钾镁处理后山核桃树栓内层碳水化合物含量增加，但增加量不显著。由图13可知，感病山核桃树土壤经海藻酸+硫酸钾镁处理后皮层薄壁细胞中碳水化合物含量显著升高。由图14可知，感病山核桃树土壤经海藻酸+硫酸钾镁处理后韧皮射线细胞中碳水化合物含量显著升高。

结论：生石灰+钙镁磷肥处理后，山核桃栓内层、皮层薄壁细胞和韧皮射线细胞中碳水化合物含量增高，抗干腐病能力增强，且高剂量生石灰+钙镁磷肥处理效果更为显著，但是从起效时间来看生石灰+钙镁磷肥处理起效较慢但持续时间较长；海藻酸+硫酸钾镁处理后，山核桃皮层薄壁细胞和韧皮射线细胞中的碳水化合物含量也增高，抗干腐病能力增强，对比生石灰+钙镁磷肥处理组，其增幅小于高剂量生石灰+钙镁磷肥处理组，且从起效时间来看，海藻酸+硫酸钾镁起效时间快，但持续时间不长，此外，海藻酸+硫酸钾镁处理在干腐病病斑消退效果上不如生石灰+钙镁磷肥处理。

高经营强度条件下，土壤进行生石灰+钙镁磷肥处理对山核桃干腐病的防治效果较好，抗干腐病的关键细胞层(栓内层、皮层薄壁细胞和韧皮射线细胞)中碳水化合物含量显著升高，高剂量生石灰+钙镁磷肥处理组含量显著高于低剂量组；土壤进行海藻酸+硫酸钾镁处理后，皮层薄壁细胞和韧皮射线细胞中碳水化合物显著升高，但栓内层中碳水化合物含量无显著变化，总体效果较生石灰+钙镁磷肥处理差。

高经营强度条件下，土壤生石灰+钙镁磷肥处理对山核桃干腐病防治效果优于海藻酸+硫酸钾镁处理。