用于治疗植物中病原性感染的组合物和方法

本发明是在美国农业部国家食品和农业研究所(NIFA)柑橘绿化奖#2015-70016-23028–S15191的政府支持下完成的。

本申请在35U.S.C.§119下要求2018年10月1日提交的美国申请16/148,848的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请包括用于治疗植物中的病原性感染的新型系统、方法和组合物。公开可以具体地包括用于治疗和预防柑橘类植物中的病原性感染诸如黄龙病(Huanglongbing)和/或葡萄植物中的病原性感染诸如皮尔斯病(PD)的新型系统、方法和组合物。进一步的实施例包括新型工程改造的抗微生物肽组合物及其用途。

背景技术

植物中的病原性感染每年都会造成植物的严重破坏和损失。事实上，联合国粮食及农业组织(FAO)估计，每年全球作物产量的20％至40％因虫害而损失。此外，植物疾病每年给全球经济造成约2200亿美元的损失，并且入侵性的昆虫造成约700亿美元的损失。

病原性感染引起的对植物的破坏可以通过黄龙病(HLB)a/k/a/柑橘绿变(CG)病来例示。HLB是一种媒介传播疾病，由木虱类昆虫传播革兰氏阴性韧皮部杆菌属(CandidatusLiberibacter)引起。亚洲柑桔木虱(ACP)和亚洲韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacteasiaticus，CLas)分别是美国HLB的传播媒介和致病生物体。除了树木移除之外，树木被感染后，没有有效的控制措施，也没有已知的疾病的治愈方法。被感染的树木可能产生畸形、滞销和苦涩的果实。HLB降低了柑橘类水果的数量和质量，最终使被感染的树木变得无用。在世界上受HLB影响的地区中，柑橘树的平均生产寿命已经从50年或更长时间下降到15年或更短时间。果园中的树木通常在被感染后3-5年死亡，并且需要移除和重新种植。

被HLB菌感染的柑橘类植物在感染后数年内可能不会显示出症状。最初的症状通常包括树上出现黄色嫩枝。当细菌在树内移动时，整个树冠逐渐形成黄色。HLB最典型的症状是叶斑驳和叶脉发黄，其出现于嫩枝的叶子上，呈现整体黄色外观。

自从大约七年前首次遭遇HLB病以来，该病已经摧毁了弗罗里达州的柑橘产业。尽管它在得克萨斯州和加利福尼亚州尚未广泛传播，但HLB正在这两个柑橘生产州大规模发生。如上所述，在没有已知的治愈方法的情况下，在防止HLB传播方面进行了重大努力。与所有媒介传播的疾病一样，首先尝试使用杀虫剂来阻止HLB的传播。然而，在弗罗里达州，携带韧皮杆菌属的木虱的数量太多，而且对于通过杀虫剂控制木虱来说数量太过庞大。事实上，超过百分之八十的佛罗里达柑橘树目前已经被感染。在德克萨斯州和加利福尼亚州等州，仍在尝试木虱控制，但成效有限。然而，不断增加的疾病压力可能很快使木虱控制无效。

另一种用于改善HLB感染的柑橘的方法包括直接应用抗生素化合物。目前，喷洒抗生素链霉素以减少被感染的柑橘类植物的韧皮杆菌属载量。然而，链霉素的使用带来了几个缺点，即：(i)韧皮杆菌属清除的活性差；(ii)对柑橘和人类具有潜在毒性；以及(iii)在柑橘中产生韧皮杆菌属耐药性，其可以转移到人。因此，需要一种有效的解决方案来保护500亿美元的美国柑橘产业免受HLB的影响。

约30年前，发现宿主两亲性线性螺旋肽(ALHP)对病毒、细菌和真菌病原体具有抗微生物活性[38-40]。在人类中，这些ALHP既作为分离的实体(例如，独立分子，诸如LL-37)存在，又作为蛋白质中的隐藏元件(例如，作为其他蛋白质的一部分)存在[41-42]。在昆虫和哺乳动物中，ALHP可能作为独立的分子存在。然而，在植物中，这些ALHP仅作为隐藏元件存在于蛋白质中[43]。然而，这些植物肽在合成并在病原体(特别是革兰氏阴性菌)上处理时显示出抗微生物活性。

在约30年前发现其后，这些ALHP作为抗生素的优良替代品带来了很大希望，原因如下：

首先，虽然传统的抗生素靶向细菌内部的DNA、RNA、蛋白质和/或细胞壁合成机制，但ALHP从外部靶向细菌的细胞膜。因此，它们可能对抗生素耐药菌有效。第二，ALHP可能来自宿主，使得它们可能适度无毒。第三，ALHP易于合成。并且最后，ALHP被视为药物(而非生物制品)，因此它们不受严格的监管和其他法律约束。

尽管有这些优势，但使用传统的ALHP作为抗微生物剂仍存在若干重要的缺点。例如，传统的ALHP仅在它们可能对宿主有毒的高浓度下显示出杀菌活性。此外，细菌通过修饰它们的外膜产生对ALHP的耐药性。应当注意，特定的膜修饰会阻碍ALHP作用的三个关键步骤，即细菌膜的附着、插入和破裂。

其他人已经尝试使用此类传统的ALHP作为抗微生物剂，但成效有限。例如，一些人已经提出了靶向某些细菌感染的传统ALHP的治疗用途。还存在其他来源于植物或非植物宿主的转基因植物ALHP的示例(参见，例如，美国专利第6,235,973号，美国专利第8,906,365号，PCT申请号PCT/US2008/070612，美国专利第5,861,478号，美国专利申请第9,807,720号和美国专利第9,522,942号，每个参考文献均以其整体并入本文)。无论如何，这样的传统系统和技术无法解决上述限制。因此，需要开发用于治疗和/或预防植物中的病原性感染的组合物。

本申请通过提供独特设计的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)肽(例如，两亲性抗微生物肽(AAP))以及这些肽用于治疗和/或预防植物中的病原性感染的用途来满足这一需要。这些工程改造的肽优于抗生素的使用，因为它们没有上述缺点。如下所述，HTH肽(例如，AAP)来源于宿主两亲性抗微生物肽(宿主AAP)，其存在于昆虫、植物、哺乳动物和人类中并且充当先天性免疫系统的重要部分。

如下文所述，公开包括基于内源性植物HALP和/或非植物ALHP的HTH肽(例如，AAP)。与内源性ALHP相比，这些HTH肽在引起细菌膜的附着、插入和/或破裂方面更有效，和/或对宿主细胞无毒或毒性更低。此外，HTH肽具有额外的益处，即对细菌耐药性的敏感性降低或没有敏感性，这是因为它们可以克服细菌耐药性造成的细菌膜的附着、插入和破裂的障碍。

发明内容

本发明技术的一个方面包括用于治疗病原性感染(例如，HLB病，优选地在柑橘类植物中；或PD，优选地在葡萄植物中)的新型系统、方法和组合物。本发明的一个一般方面可以包括具有螺旋-转角-螺旋支架构形(helix-turn-helix scaffold formation)的新型抗微生物肽，其表现出：i)增加的杀菌作用；2)增加的附着和/或插入细菌膜的效率；以及iii)对细菌耐药性的较低的敏感性。在一个优选的方面中，此类新型螺旋-转角-螺旋支架抗微生物肽可以用作用于治疗细菌感染的治疗组合物。在一个优选的方面中，此类新型螺旋-转角-螺旋支架抗微生物肽可以用作治疗组合物，用于治疗植物中的革兰氏阴性细菌感染。最后，在另一个优选的方面中，此类新型螺旋-转角-螺旋支架抗微生物肽可以用作治疗组合物，用于治疗CLas——一种柑橘类植物中的HLB病的病原体。

本发明技术的一个方面可以包括新型抗微生物肽，其包含通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，其中所述螺旋-转角-螺旋支架构形具有：1)与单个内源两亲性螺旋肽相比增加的杀菌作用；2)与单个内源两亲性螺旋肽相比，增加的附着和/或插入细菌膜的效率；3)与单个内源两亲性螺旋肽相比，对细菌耐药性的较低的敏感性；和4)对哺乳动物细胞低毒性或无毒性；以及5)对植物细胞的低植物毒性或无植物毒性。

本发明技术的一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽均为来自葡萄植物的内源两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中第一两亲性螺旋肽和/或第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中第一两亲性螺旋肽和/或第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中接头结构域包含具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽是相同的两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽选自由以下组成的群组：P26、26P1、26P2、26P3、26P4、26P5、cysP30、41P、28P、28P1、28P1-2、28P4、24P和58-P。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中所述抗微生物肽选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.3-12、16-18、20、22-23和28-32或其变体。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽由包含核酸序列的多核苷酸编码。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中所述抗微生物肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸被进一步连接至启动子以产生表达载体。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中所述抗微生物肽由与启动子可操作地连接的多核苷酸编码，并且其中植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。在优选的方面中，这样的植物或植物细胞可以包括柑橘类植物或柑橘类植物细胞。在另一个实施例中，这样的植物或植物细胞包括葡萄植物或葡萄植物细胞。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。在一些实施例中，细菌病原体是革兰氏阴性菌。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中所述抗微生物肽可以用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中所述抗微生物肽可以用作被木质部难养菌(Xylella fastidiosa，X.fastidiosa)感染和/或有被木质部难养菌感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以被局部地施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以被局部地施用于被木质部难养菌感染和/或有被木质部难养菌感染风险的植物。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以用作用于治疗和/或预防皮尔斯病(PD)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。在优选的实施例中，细菌膜可以是革兰氏阴性细菌膜。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

本发明技术的另一个方面可以包括一种新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，被鉴定为氨基酸SEQ IDNO.3。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中P11两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源性P11两亲性螺旋肽。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个P12两亲性螺旋肽，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.16。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中P12两亲性螺旋肽均为来自葡萄植物的内源性P12两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中接头结构域包含具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中来自每个P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中来自每个P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键，并且可以进一步被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中第二接头结构域可以偶联两个P11两亲性螺旋肽形成环状支架构形，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽由包含核酸序列的多核苷酸编码。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽由多核苷酸编码并与启动子连接以产生表达载体。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中包含上述多核苷酸的遗传改变的植物或植物细胞可以被配置成产生抗微生物肽并可操作地连接到启动子，其中所述植物或植物细胞可以产生抗微生物肽。在优选的方面中，这样的植物或植物细胞可以包括柑橘类植物或柑橘类植物细胞。在另一个实施例中，这样的植物或植物细胞是葡萄植物或葡萄植物细胞。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中所述抗微生物肽可以用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以被局部地施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中所述抗微生物肽可以用作被木质部难养菌感染和/或有被木质部难养菌感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以被局部地施用于被木质部难养菌感染和/或有被木质部难养菌感染风险的植物。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中抗微生物肽可以用作用于治疗和/或预防皮尔斯病的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。在优选的实施例中，细菌膜可以是革兰氏阴性细菌膜。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

本发明技术的另一个方面可以包括一种新型抗微生物肽，其包含通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括抗微生物肽的实施例，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括抗微生物肽的实施例，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽均为来自葡萄植物的内源两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合。

本发明技术的附加的方面可以包括上述的抗微生物肽，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中接头结构域包含具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽是相同的两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中所述抗微生物肽被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9。

本发明技术的附加的方面可以包括由包含核酸序列的多核苷酸编码的上述抗微生物肽。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述多核苷酸与启动子连接以产生表达载体。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中包含上述多核苷酸的遗传改变的植物或植物细胞与启动子可操作地连接，并且其中植物或植物细胞产生抗微生物肽。在优选的方面中，这样的植物或植物细胞可以包括柑橘类植物或柑橘类植物细胞。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述组合物或抗微生物肽可以被局部地施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述组合物可以用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，并且与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，并且与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以进一步包含第二接头结构域，所述第二接头结构域将两个P11两亲性螺旋肽偶联形成环状支架构形，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11。

本发明技术的另一方面可以包括一种新型抗微生物肽，其包含通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，并且其中来自每个P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中P11两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源性P11两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中接头结构域包含具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

本发明技术的附加的方面可以包括由包含核酸序列的多核苷酸编码的上述抗微生物肽。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述多核苷酸与启动子连接以产生表达载体。

本发明技术的附加的方面可以包括遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的上述多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。在优选的方面中，这样的植物或植物细胞可以包括柑橘类植物或柑橘类植物细胞。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述组合物可以被局部地施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述组合物可以用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，并且与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，并且与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以进一步包含第二接头结构域，所述第二接头结构域将两个P11两亲性螺旋肽偶联形成环状支架构形，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其包含通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一和第二接头结构域分别包含具有至少四个氨基酸的第一肽接头和第二肽接头。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一接头结构域和第二接头结构域包含具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽是相同的两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中所述抗微生物肽被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽由包含核酸序列的多核苷酸编码。

本发明技术的附加的方面可以包括与启动子连接以产生表达载体的上述多核苷酸。

本发明技术的附加的方面可以包括遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的上述多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。在优选的方面中，这样的植物或植物细胞可以包括柑橘类植物或柑橘类植物细胞。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以是用于被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽可以用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属感染风险的植物的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述组合物可以被局部地施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述组合物可以用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，并且与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。

本发明技术的附加的方面可以包括这样的实施例，其中上述抗微生物肽具有通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，并且与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其包含通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，被鉴定为氨基酸SEQ IDNO.11。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中P11两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源性P11两亲性螺旋肽。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中接头结构域包含具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

本发明技术的附加的方面可以包括由包含核酸序列的多核苷酸编码的上述抗微生物肽。

本发明技术的附加的方面可以包括与启动子连接以产生表达载体的上述多核苷酸。

本发明技术的附加的方面可以包括遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的上述多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。在优选的方面中，这样的植物或植物细胞可以包括柑橘类植物或柑橘类植物细胞。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽作为用于被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂的用途。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽作为被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属感染风险的植物的治疗剂的用途。

本发明技术的附加的方面可以包括上述组合物作为局部施用物用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物的用途。

本发明技术的附加的方面可以包括上述组合物作为治疗剂用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的用途。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其中来自每个P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.3。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.4。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.5。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.6。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.7。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.8。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述螺旋-转角-螺旋支架构形由第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽之间的至少一个二硫键稳定，所述抗微生物肽包括SEQ ID NO.9。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.10。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过第一和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.11。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一个方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.12。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.16。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.17。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.18。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.20。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括新型抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.22。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述新型抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

本发明技术的附加的方面可以包括上述抗微生物肽，其用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。

本发明技术的另一方面可以包括预测抗微生物肽的相对杀菌活性的新方法，其包括以下步骤：鉴定两亲性螺旋肽；产生经修饰的肽，所述经修饰的肽基本上由通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两种两亲性螺旋肽组成；确定脂质:水双层参数，以生成模拟的细菌膜；进行分子动力学(MD)模拟以确定两亲性螺旋肽和修饰的肽附着到模拟的细菌膜，或插入到模拟的细菌膜中，或在附着或插入之后保持它们的构型的相对效率；以及比较两亲性螺旋肽和经修饰的肽的相对杀菌活性。

本发明技术的附加的方面可以包括上述方法，其中鉴定第一两亲性螺旋肽的步骤包括鉴定对于植物是内源性的两亲性螺旋肽的步骤。

本发明技术的附加的方面可以包括上述方法，其中鉴定对于植物是内源性的两亲性螺旋肽的步骤包括鉴定对柑橘类植物是内源性的两亲性螺旋肽的步骤。

本发明技术的附加的方面可以包括上述方法，其中两亲性螺旋肽是二聚体。

本发明技术的附加的方面可以包括上述方法，其中接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

本发明技术的附加的方面可以包括上述方法，其中具有至少四个氨基酸的肽接头包含GPGR-转角。

本发明技术的附加的方面可以包括上述方法，并且进一步包括施加GROMOS力场以监测两亲性螺旋肽和经修饰的肽从水到脂质的附着的步骤。

本发明技术的附加的方面可以包括上述方法，其中确定脂质:水双层参数以产生模拟的细菌膜的步骤进一步包括确定选自由以下组成的群组中的一个或多个参数的步骤：确定脂质核中水分子的数量；确定翻转到脂质核中的极性脂质头基团的数量；确定疏水性核中的残基比例；以及确定螺旋内容。

本发明技术的附加的方面将从下面给出的详细描述和附图中变得明显。

附图说明

从以下结合附图的详细描述中，将更好地理解本公开的新颖方面、特征和优点，所有这些仅作为说明给出，并且不限制当前公开的实施例，其中：

图1–在其一个实施例中，基于宿主类似物的新型抗微生物肽的设计和结构。

图2–(A)在分子动力学(MD)中使用的水-脂质双层的尺寸；和(B)POPE:POPG的化学结构和尺寸。

图3–在其一个实施例中P11和P26的(A)附着和(B)插入的比较。

图4A至4B–来自(图4A)被感染的柑橘叶和(图4B)被感染的木虱的抗微生物肽对CLas的清除百分比。CK＝阴性对照；Triton(0.1％)＝阳性对照；TMOF＝木虱肠结合肽(对CLa清除没有特异性)。

图5A至5B–显示了不同浓度的不同示例性的抗微生物肽的溶血百分比

图6A–螺旋-转角-螺旋P26，通过转角将两个内源性P11连接而被工程改造。

图6B–分离的叶测定显示P26比链霉素更具活性。在P11-R中，所有的基本Ks都被R取代。

图7–示例性的工程改造的抗微生物肽：P26、cysP26和P30的序列和结构螺旋-转角-螺旋基序。

图8–展示人类细胞系(特别是红细胞、HL60细胞)中MIC和毒性效应的数据集，以及展示示例性的工程改造的抗微生物肽：P26、cysP26和P30的低植物毒性的测量结果。

图9–不同肽对本氏烟草(N.benthamiana)叶肉原生质体的活力的影响，表明P26和cysP26的低植物毒性。

图10–两种大肠杆菌(E.coli)菌株的突变对通过11P肽的膜附着、插入和破裂的影响。

图11–在肽处理下葡萄原生质体的毒性分析。

图12–选择用于表达分析的PTI、ETI、SA、JA和ET途径中的选定基因的示意图。

图13–用Pst、28P-2和Pst+28P-2处理的烟草中基因表达的热图谱。

图14A–相对于图13所示的未处理的/未感染的烟草的基因，每个基因的平均倍数变化。

图14B–相对于初始接种细菌感染和感染加治疗的Pst的清除率百分比。

图15–在有(红色)和没有(青色)处理的情况下被感染的叶片中的木质部难养菌的载量。(插图)实验设计。

图16–使用34株被感染的葡萄藤的小规模田间药效研究的设计。

图17A–在28P-2和28P-4处理后，木质部难养菌从葡萄藤树皮中的清除率。

图17B–在28P-2和28P-4处理后，木质部难养菌从葡萄叶中的清除率。

图18–在喷洒28P-2和28P-4的3个月后，处理的和未处理的被感染的植物的症状。

本发明包括多个方面，这些方面可以以不同的方式组合。提供以下描述以列出要素并描述本发明的一些实施例。这些要素与初始实施例一起列出，然而应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建附加的实施例。各种描述的示例和优选的实施例不应被解释为将本发明仅限制于明确描述的系统、技术和应用。进一步地，这一描述应被理解为支持并包含对所有各种实施例、系统、技术、方法、装置和应用的描述和权利要求，这些实施例、系统、技术、装置和应用具有任何数量的所公开的要素(其中每个要素是单独的)，并且还具有在这一或任何后续应用中的所有要素的任何和所有各种排列和组合。

本文公开了用于治疗植物中细菌感染的新型系统、方法和组合物。这些发明可以进一步包括用于治疗植物中革兰氏阴性细菌感染的新型系统、方法和组合物。在一个具体实施例中，本发明可以包括用于治疗HLB病(优选地在柑橘类植物中)的新型系统、方法和组合物。在本实施例中，本发明可以包括可以用于治疗易感的或已感染的柑橘类植物的新型抗微生物肽，其可以治愈或降低细菌载量并增加柑橘类植物的生产年数。附加的实施例可以包括产生表达一种或多种本文所述的抗微生物肽的转基因HLB抗性柑橘类植物，用于长期疾病保护。

工程改造的抗微生物肽

如本文所使用的，术语“工程改造的抗微生物肽”(EAP)、“螺旋-转角-螺旋肽”(HTH肽)和抗微生物两亲性肽(AAP)可以互换使用。通常，HTH肽是指来源于宿主(例如，植物或非植物细胞、组织或生物体)并与非天然接头连接的肽。非天然接头是指不与来源于宿主的肽同时天然存在的肽序列。

一般而言，HTH肽包含(a)第一螺旋结构域；(b)接头结构域；以及(c)第二螺旋结构域。在一些实施例中，HTH肽进一步包含1、2、3或4个或更多个附加的接头。在一些实施例中，HTH肽进一步包含1、2、3、4或更多个附加的螺旋结构域。

在一些实施例中，HTH肽包含8-50、8-40、8-30、8-20、8-15、10-50、10-40、10-30、10-20或10-15个氨基酸。在一些实施例中，HTH肽包含10-45、10-35、10-25、10-20、11-15、11-28、11-13或10-15个氨基酸。在一些实施例中，HTH肽包含至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个氨基酸。在一些实施例中，HTH肽包含50、45、40、37、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、20个或更少的氨基酸。

在一些实施例中，一个或多个螺旋结构域包含植物蛋白的抗微生物螺旋结构域。在一些实施例中，一个或多个螺旋结构域包含非植物蛋白的抗微生物螺旋结构域。

在一些实施例中，一个或多个螺旋结构域由10-50、10-40、10-30、10-20或10-15个氨基酸组成。在一些实施例中，一个或多个螺旋结构域由10-45、10-35、10-25、10-20、11-15、11-28、11-13或10-15个氨基酸组成。在一些实施例中，螺旋结构域包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个氨基酸。在一些实施例中，一个或多个螺旋结构域包含50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12个或更少的氨基酸。

在一些实施例中，一个或多个螺旋结构域是两亲性螺旋结构域。在一些实施例中，两亲性螺旋结构域包含交替的非极性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基。

在一些实施例中，两亲性螺旋结构域包含(X

在一些实施例中，两亲性螺旋结构域包含(X

在一些实施例中，本文公开的螺旋结构域包括下式：X

在一些实施例中，本文公开的螺旋结构域包含下式：X

在一些实施例中，本文公开的螺旋结构域包含第一螺旋结构域，和/或第二螺旋结构域，包含下式：X

在一些实施例中，非极性残基选自由以下组成的群组：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和异亮氨酸(I)。在一些实施例中，非极性残基选自由以下组成的群组：A、L和I。在一些实施例中，非极性氨基酸选自由以下组成的群组：L和I。

在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基选自K和R。

在一些实施例中，本文公开的任何螺旋结构域各自包含由0-4个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述氨基酸残基选自由以下组成的群组：极性的不带电荷的残基、带负电荷的残基和非极性的芳族残基。在一些实施例中，螺旋结构域包含4、3、2或1个或更少的极性不带电荷的残基、带负电荷的残基和/或非极性的芳族残基。

在一些实施例中，极性的不带电荷的残基选自由以下组成的群组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。

在一些实施例中，带负电荷的残基选自由以下组成的群组：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。

在一些实施例中，非极性的芳族残基选自由以下组成的群组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。

在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域是相同的。在一些实施例中，一个或多个另外的螺旋结构域与第一螺旋结构域和/或第二螺旋结构域相同。

在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域不同。在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域相差1-4个氨基酸残基。在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域相差1、2、3、4、5个氨基酸残基。在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域相差5、4、3、2或1个或更少的氨基酸残基。

在一些实施例中，HTH肽的至少两个螺旋结构域不同。在一些实施例中，螺旋结构域相差1、2、3或4个氨基酸残基。在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域相差5、4、3、2或1个或更少的氨基酸残基。

在一些实施例中，第二螺旋结构域由与第一螺旋结构域的氨基酸序列相反的氨基酸序列组成。

在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域的长度相同。在一些实施例中，至少两个螺旋结构域具有相同的长度。

在一些实施例中，第一螺旋结构域和第二螺旋结构域的长度不同。在一些实施例中，至少两个螺旋结构域的长度不同。在一些实施例中，至少两个螺旋结构域的长度相差1、2、3、4或5个氨基酸。

在一些实施例中，本文公开的螺旋结构域包含接头，所述接头包含2-15、2-12、3-9、3-6、4-12或4-8个氨基酸残基。在一些实施例中，本文公开的螺旋结构域包含接头，所述接头包含至少2、3、4或5个氨基酸残基。在一些实施例中，本文公开的螺旋结构域包含接头，所述接头包含15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个或更少的氨基酸残基。

在一些实施例中，接头包含40-80％不带电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，本文公开的螺旋结构域包含接头，所述接头包含35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％不带电荷的氨基酸残基。

在一些实施例中，接头包含10-60％带正电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，接头包含至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％带正电荷的氨基酸残基。在一些实施例中，接头包含60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％或更少的带正电荷的氨基酸残基。

在一些实施例中，螺旋结构域包含带正电荷的氨基酸残基和非极性氨基酸残基的混合物。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基与非极性氨基酸残基的比率为0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.9:1或1:1。在一些实施例中，带正电荷的氨基酸残基与非极性氨基酸残基的比率为1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1和15:1。

在一些实施例中，HTH肽进一步包含1、2、3、4或5个接头。在一些实施例中，HTH肽包含2个接头。在一些实施例中，HTH肽包含3个接头。

在一些实施例中，接头包含SEQ ID NO:23或38的氨基酸序列。

在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列相差不超过1个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ IDNo:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列相差不超过2个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列相差不超过3个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列相差不超过4个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列相差不超过5个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列相差不超过6个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:16-18和28-32的氨基酸序列相差6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-9的氨基酸序列相差6、5、4、3、2或1个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施例中，氨基酸序列的差异发生在螺旋结构域中。在一些实施例中，氨基酸残基的差异是在相同极性或电荷的氨基酸残基之间。例如，在一些实施例中，氨基酸残基的差异在两个不同的非极性氨基酸残基(例如，G、A、V、L、M和I)之间。在一些实施例中，氨基酸残基的差异在两个不同的带正电荷的氨基酸残基(例如，K、R和H)之间。在一些实施例中，氨基酸残基的差异在两个极性不带电荷的残基(例如，S、T、C、P、N和Q)之间。在一些实施例中，氨基酸残基的差异在两个带负电荷的残基(例如，D和E)之间。在一些实施例中，氨基酸残基的差异在两个非极性的芳族残基(例如，F、Y和W)之间。

在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:16-18和28-32的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含与选自SEQ ID No:3-9的氨基酸序列至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

本发明可以包括治疗HLB病(优选地在柑橘类植物中)的工程改造的抗微生物肽。在本实施例中，本发明可以包括衍生自两亲性螺旋肽的新型抗微生物肽，其可以进一步用于治疗柑橘类植物中的HLB病。在一个实施例中，本发明可以包括通过偶联两个两亲性螺旋肽形成的工程改造的抗微生物肽。具体地，本申请的广义抗微生物肽可以包括通过接头结构域与第二两亲性螺旋肽偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽。此类两亲性螺旋肽可以对于目标宿主(优选地柑橘类植物)是内源性的。在另一个优选的实施例中，此类工程改造的抗微生物肽可能对细胞宿主无毒。在本实施例中，工程改造的抗微生物肽在人体中可能是无毒的。例如，如图8所示，示例性的工程改造的抗微生物肽P26和cysP26未证明对人红细胞或HL60细胞的毒性。

如上所述，通过植物和其他生物体可以产生多种内源性单个两亲性螺旋肽以防御细菌感染。因此，在一个实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，其中每个两亲性螺旋肽可以选自由以下组成的群组：可以对宿主植物(诸如柑橘类植物)是内源性的两亲性螺旋肽。在一个实施例中，第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽各自可以选自由以下组成的两亲性螺旋肽群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合。

例如，在一个优选的实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一P11两亲性螺旋肽和第二P11两亲性螺旋肽。附加的实施例可以包括其附加的相同的以及不相同的组合，并且因此，不应该认为是对在本发明的范围内预期的两亲性螺旋肽的组合的宽范围的限制。

在一个附加的实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，其中两亲性螺旋肽是相同的。在本实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽选自由以下组成的群组：P26、26P1、26P2、26P3、26P4、26P5、cysP30、41P、28P、28P1、28P1-2、24P和58-P，如本文一般所述。应当注意，如通篇所使用的术语“相同(same)”或“相同(identical)”可以包括具有相同的或相似的序列、结构或相同的名称以及如本文定义的同源序列或结构的两亲性螺旋肽。

在另一个实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一肽和第二肽，其中每个两亲性螺旋肽可以各自选自由以下组成的氨基酸序列群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合。例如，在一个优选的实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽(被鉴定为SEQ IDNO.3)和第二两亲性螺旋肽(被鉴定为SEQ ID NO.3)。附加的实施例可以包括其附加的相同的以及不相同的氨基酸序列的组合，因此，不应被认为是对在本发明范围内预期的氨基酸序列的组合的广泛范围的限制。

在一个附加的实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性肽和第二两亲性肽，其中第一和第二肽序列相同。在本实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.3-12、16-18、20、22-23和28-32或其变体，如本文一般所述的。此类变体可以包括具有约75％至99％序列同源性的序列。

如上所述，接头结构域可以将第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽偶联在一起。在一个实施例中，这一接头结构域可以包括氨基酸序列，其被配置为在如本文一般所述的螺旋-转角-螺旋支架构形中产生“转角”。这一接头结构域可以包括具有至少四个氨基酸的肽接头。在一个优选的实施例中，这一接头结构域可以包括具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

如上所述，本发明可以包括治疗植物中的细菌感染的一种或多种本文鉴定的抗微生物肽。例如，本发明可以包括一种或多种本文所述的抗微生物肽，作为被细菌病原体(优选地革兰氏阴性细菌病原体)感染和/或有被细菌病原体(优选地革兰氏阴性细菌病原体)感染风险的植物的治疗剂。在本实施例中，本文鉴定的一种或多种抗微生物肽可以用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)——一种HLB病的病原体感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

在一个具体的实施例中，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.3的抗微生物肽P26可以包括通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一P11两亲性螺旋肽和第二P11两亲性螺旋肽。这一工程改造的P26抗微生物肽可以是植物的治疗剂，并且更具体地，是被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的柑橘类植物的治疗剂。在本实施例中，与单个内源两亲性螺旋肽P11亚组分相比，此类工程改造的P26抗微生物肽可以通过增强的杀菌作用表现出针对CLas或其他革兰氏阴性菌的治疗作用。更具体地，与内源性单个两亲性螺旋肽P11亚组分相比，此类工程改造的P26抗微生物肽可以表现出增加的附着和/或插入细菌膜的效率。在这一构型中，工程改造的P26抗微生物肽可以更有效地附着至并将其自身插入到革兰氏阴性细菌病原体(诸如CLas)的细菌膜中，引起细菌的裂解。此外，如其他地方所述，由于新型螺旋-转角-螺旋支架结构的结构及其更有效的杀菌图谱，与单个P11内源两亲性螺旋肽亚组分相比，这种示例性的工程改造的P26抗微生物肽可以表现出对细菌耐药性和蛋白酶降解的较低的敏感性。

在一个优选的实施例中，这一工程改造的P26抗微生物肽可以形成组合物，所述组合物可以被施用于植物，并且更具体地被施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。以这一方式，可以将示例性的P26抗微生物肽作为治疗剂施用于有此需要的植物，用于治疗和/或预防HLB病。在本优选的实施例中，示例性的P26抗微生物肽可以以组合物作为治疗剂被局部地施用于有此需要的植物，用于治疗和/或预防HLB病。

本发明可以包括新型抗微生物肽，所述新型抗微生物肽具有两个两亲性螺旋肽，所述两亲性螺旋肽通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形，并且被进一步修饰，使得来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。在本实施例中，二硫键可以稳定或增强螺旋-转角-螺旋支架构形，使得其可以表现出增强的杀菌活性，以及增强的稳定性和对蛋白酶降解的抗性。此类两亲性螺旋肽对目标宿主(优选地柑橘类植物)可以是内源性的或者可以来源于目标宿主(优选地柑橘类植物)。

这种二硫键稳定的抗微生物肽可以用于治疗细菌感染及其相关病症。在一个实施例中，如本文一般描述的二硫键稳定的抗微生物肽可以用于治疗HLB病，优选地在柑橘类植物中。如上所述，通过植物和其他生物体可以产生多种内源性单个两亲性螺旋肽以防御细菌感染。因此，在一个实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，其中每个两亲性螺旋肽可以选自由以下组成的内源两亲性螺旋肽群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合，并且其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。例如，在具体的优选实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一P11两亲性螺旋肽和第二P11两亲性螺旋肽，其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键，如通常在图1中所示。附加的实施例可以包括其附加的相同的以及不相同的组合，因此，不应该被认为是对在本发明的范围内预期的可以通过二硫键稳定的两亲性螺旋肽的组合的宽范围的限制。

在一个附加的实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键，其中两亲性螺旋肽是相同的。在本实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽选自由以下组成的群组：P26、26P1、26P2、26P3、26P4、26P5、cysP30、41P、28P、28P1、28P1-2、24P和58-P，如本文一般所述。在另一个实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一肽和第二肽，其中每个两亲性螺旋肽可以选自由以下组成的氨基酸序列群组：SEQID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合，其中来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

在一个具体的优选实施例中，包含来源于柑橘类植物的两个P11两亲性螺旋肽的抗微生物肽可以通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形，被鉴定为氨基酸SEQID NO.3，并且可以进一步被修饰，其中来自每个P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键，可以被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9。如上一般所述，被鉴定为cysP26的具有二硫键稳定的螺旋-转角-螺旋支架的抗微生物肽可以进一步包括可以偶联第一和第二P11两亲性螺旋肽的接头结构域。在一个实施例中，这一接头结构域可以包括氨基酸序列，其被配置为在如本文一般所述的螺旋-转角-螺旋支架构形中产生“转角”。在本实施例中，这一接头结构域可以包括具有至少四个氨基酸的肽接头。在一个优选的实施例中，这一接头结构域可以包括具有被鉴定为SEQ IDNO.23.的氨基酸序列的GPGR-转角。

此外，在一个具体的实施例中，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9的抗微生物肽cysP26可以是植物的治疗剂，并且更具体地是被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的治疗剂。在本实施例中，与单个内源两亲性螺旋肽P11亚组分相比，此类工程改造的cysP26抗微生物肽可以通过增强的杀菌作用表现出针对CLas或其他革兰氏阴性菌的治疗作用。更具体地，与内源性单个两亲性螺旋肽P11亚组分相比，此类工程改造的cysP26抗微生物肽可以表现出增加的附着和/或插入细菌膜的效率。在这一构型中，工程改造的cysP26抗微生物肽可以更有效地附着至并将其自身插入到CLas的细菌膜中，导致细菌的裂解。此外，如其他地方所述，由于本发明的工程改造的螺旋-转角-螺旋支架结构的结构被在每个两亲性螺旋肽之间的二硫键进一步稳定，与单个P11内源两亲性螺旋肽相比，此类示例性的工程改造的cysP26抗微生物肽可以表现出对细菌耐药性的较低的敏感性以及对细胞蛋白酶降解的增强的抗性。

在一个优选的实施例中，这一工程改造的cysP26抗微生物肽可以形成组合物，所述组合物可以被施用于植物，并且更具体地被施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。以这一方式，可以将示例性的cysP26抗微生物肽作为治疗剂施用于有此需要的植物，用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)。在本优选的实施例中，示例性的cysP26抗微生物肽组合物可以作为治疗剂被局部地施用于有此需要的植物，用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)。

本发明还可以包括新型的抗微生物肽，其具有通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽。在本实施例中，此类环状支架构形可以表现出增强的杀菌活性，以及增加的稳定性和对细胞蛋白酶的抗性。此类修饰的两亲性螺旋肽对目标宿主(优选地柑橘类植物或葡萄植物)可以是内源性的或者可以来源于目标宿主(优选地柑橘类植物或葡萄植物)。在附加的实施例中，在环状支架构形中，来自每个两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基可以被半胱氨酸残基取代，在两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

这种环状支架构形的抗微生物肽可以用于治疗植物中的细菌感染及其相关病症。在一个实施例中，如本文一般描述的环状支架构形的抗微生物肽可以用于治疗HLB病(优选地在柑橘类植物中)。在一个实施例中，如本文一般描述的环状支架构形的抗微生物肽可以用于治疗皮尔斯病(优选地在葡萄植物中)。如上所述，通过植物和其他生物体可以产生多种内源性单个两亲性螺旋肽以防御细菌感染。因此，在一个实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，其具有通过至少两个接头结构域偶联形成环状支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽(通常如图1所示的)，其中每个两亲性螺旋肽可以选自由以下组成的内源两亲性螺旋肽群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P、28P或其任意组合。

例如，在一个优选的实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过两个相对的接头结构域偶联形成环状支架构形的第一P11两亲性螺旋肽和第二P11两亲性螺旋肽，通常如图1所示。如上所述，附加的实施例可以包括通过至少两个接头结构域偶联形成环状支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，其中两个两亲性螺旋肽是相同的，而在备选的实施例中，第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽可以包括两亲性螺旋肽的不同的组合。在另一个实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过至少两个接头结构域偶联形成环状支架构形的第一肽和第二肽，其中每个两亲性螺旋肽可以选自由以下组成的氨基酸序列群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合，其与被鉴定为SEQ ID NO.23的第二接头结构域偶联。

在一个附加的实施例中，本发明可以包括抗微生物肽，所述抗微生物肽具有通过至少两个接头结构域偶联形成环状支架构形的第一P11两亲性螺旋肽和第二P11两亲性螺旋肽，其被鉴定为cycP30，如图1一般所示。在另一个具体的实施例中，包含来源于柑橘类植物的两个P11两亲性螺旋肽的抗微生物肽可以通过至少两个接头结构域偶联，形成环状支架构形，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11。如上一般所述，这种环状支架构形的抗微生物肽可以进一步包括如本文一般所述的二硫键稳定的环状支架构形。在一个实施例中，这些接头结构域可以包括被配置为在环状支架构形中产生“转角”的氨基酸序列，如本文一般所述。在本实施例中，这些接头结构域可以包括具有至少四个氨基酸的肽接头。在一个优选的实施例中，这些接头结构域可以包括具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

此外，在一个具体实例中，被鉴定为cycP30、被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9的抗微生物肽可以用作植物的治疗剂，并且更具体地，可以用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的治疗剂。在本实施例中，与单个内源两亲性螺旋肽P11亚组分相比，此类工程改造的cycP30抗微生物肽可以通过增强的杀菌作用表现出针对CLas或其他革兰氏阴性菌的治疗作用。更具体地，与内源性单个两亲性螺旋肽P11亚组分相比，此类工程改造的cycP30抗微生物肽可以表现出增加的附着和/或插入细菌膜的效率。在这一构型中，工程改造的cycP30抗微生物肽可以更有效地附着至并将其自身插入到CLas的细菌膜中，导致细菌的裂解。此外，如其他地方所述，由于本发明的工程改造的环状支架构形结构的结构(其可以通过每一个两亲性螺旋肽之间的二硫键被进一步稳定)及其更有效的杀菌图谱，这种示例性的工程改造的cycP30抗微生物肽可以表现出与单个P11内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的较低的敏感性以及对蛋白酶降解的增强的抗性。

在一个优选的实施例中，这一工程改造的cycP30抗微生物肽可以作为组合物被施用于植物，并且更具体地，被施用于被CLas(或优选地其他革兰氏阴性菌)感染和/或有被CLas(或优选地其他革兰氏阴性菌)感染风险的柑橘类植物。以这一方式，可以将示例性的cycP30抗微生物肽作为治疗剂施用于有此需要的植物，用于治疗和/或预防HLB病。在本优选的实施例中，示例性的cycP30抗微生物肽可以以组合物作为治疗剂被局部地施用于有此需要的植物，用于治疗和/或预防HLB病。

在一个具体的实施例中，HTH肽(诸如被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.28-32的P28序列变体)可以包括通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一P12两亲性螺旋肽和第二P12两亲性螺旋肽。这一工程改造的P28抗微生物肽可以是植物的治疗剂，并且更具体地是被木质部难养菌感染和/或有被木质部难养菌感染风险的葡萄植物的治疗剂。在本实施例中，与单个内源两亲性螺旋肽P12亚组分相比，此类工程改造的P28HTHl肽可以通过增强的杀菌作用而表现出针对木质部难养菌或其他革兰氏阴性菌的治疗作用。更具体地，与内源性单个两亲性螺旋肽P28亚组分相比，此类工程改造的P28抗微生物肽可以表现出增加的附着和/或插入细菌膜的效率。在这一构型中，工程改造的P28抗微生物肽可以更有效地附着至并将其自身插入到革兰氏阴性细菌病原体(诸如木质部难养菌)的细菌膜中，引起细菌的裂解。此外，如其他地方所述，由于新型螺旋-转角-螺旋支架结构的结构及其更有效的杀菌图谱，与单个P12内源两亲性螺旋肽亚组分相比，这种示例性的工程改造的P28抗微生物肽可以表现出对细菌耐药性和蛋白酶降解的较低的敏感性。

本文进一步公开了包含本文公开的一种或多种HTH肽的组合物。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，组合物包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个或更多个包含选自SEQ IDNo:1-2、16-18和24-32或其变体的氨基酸序列的HTH肽，被施用于植物。在一些实施例中，组合物包含2种或更多种包含选自SEQ ID No:1-2、16-18和24-32或其变体的氨基酸序列的HTH肽，被施用于植物。在一些实施例中，组合物包含3个或更多个包含选自SEQ ID No:1-2、16-18和24-32或其变体的氨基酸序列的HTH肽，被施用于植物。在一些实施例中，组合物包含4种或更多种包含选自SEQ ID No:1-2、16-18和24-32或其变体的氨基酸序列的HTH肽，被施用于植物。在一些实施例中，组合物包含5种或更多种包含选自SEQ ID No:1-2、16-18和24-32或其变体的氨基酸序列的HTH肽，被施用于植物。

工程改造的抗微生物肽的用途

本文公开了使用本文公开的工程改造的抗微生物肽(例如，HTH肽或AAP)的方法。在一些实施例中，本文公开的HTH肽用作用于治疗和/或预防植物中病原性疾病的治疗剂。在一些实施例中，所述病原性疾病是细菌感染。在一些实施例中，病原性感染由革兰氏阴性菌引起。在一些实施例中，将一种或多种HTH肽局部地施用于植物。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-9或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:13-15或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，将本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽施用于植物。在一些实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个或更多个包含选自SEQ ID No:1-2、16-18和24-32或其变体的氨基酸序列的HTH肽施用于植物。

在一些实施例中，本文公开的HTH肽用作被病原体感染和/或有被病原体感染风险的植物的局部治疗剂。在一些实施例中，将一种或多种HTH肽局部地施用于植物。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-9或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:13-15或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，将本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽施用于植物。在一些实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个或更多个包含选自SEQ ID No:1-2、16-18和24-32或其变体的氨基酸序列的HTH肽施用于植物。

在一些实施例中，本文公开的HTH肽用于治疗被病原体感染和/或有被病原体感染风险的植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被病原体感染和/或有被病原体感染风险的植物。在一些实施例中，将HTH肽局部地施用于植物。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-9或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:13-15或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，组合物包含本文公开的一种或多种HTH肽。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-9或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或多个HTH肽包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或多个HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。

本文进一步公开了HTH肽用于增强宿主针对病原体的先天免疫防御的用途。在一些实施例中，HTH肽诱导宿主先天免疫防御基因的表达。在一些实施例中，通过检测一种或多种先天免疫防御基因的表达水平来测量宿主先天免疫防御的增强。在一些实施例中，一种或多种先天免疫防御基因的表达水平增加了50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％或200％或更多。

在一些实施例中，HTH肽通过防止病原体诸如革兰氏阴性菌对相应的HTH肽产生耐药性来治疗植物或防止感染。

在一些实施例中，本文公开的HTH肽用作用于治疗和/或预防植物诸如柑橘类植物中的黄龙病(HLB)的治疗剂。在一些实施例中，将HTH肽局部地施用于植物，诸如柑橘类植物。在一些实施例中，组合物包含本文公开的一种或多种HTH肽。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-9或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或更多个HTH肽包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文公开的HTH肽用作用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。在一些实施例中，将HTH肽局部地施用于植物，诸如柑橘类植物。在一些实施例中，组合物包含本文公开的一种或多种HTH肽。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-9或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或更多个HTH肽包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文公开的HTH肽用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物。在一些实施例中，将HTH肽局部地施用于植物，诸如柑橘类植物。在一些实施例中，组合物包含本文公开的一种或多种HTH肽。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:3-9或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或更多个HTH肽包含选自SEQ ID No:1-2和24-27或其变体的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文公开的HTH肽用作用于治疗和/或预防植物诸如葡萄植物中的皮尔斯病(PD)的治疗剂。在一些实施例中，将HTH肽局部地施用于植物，诸如葡萄植物。在一些实施例中，组合物包含本文公开的一种或多种HTH肽。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:13-15或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包括28P2 HTH肽(SEQ ID NO:16)或28P4 HTH肽(SEQ ID NO:29)。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或更多个HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文公开的HTH肽被用作用于被木质部难养菌感染和/或有被木质部难养菌感染风险的葡萄植物的局部治疗剂。在一些实施例中，将HTH肽局部地施用于植物，诸如葡萄植物。在一些实施例中，组合物包含本文公开的一种或多种HTH肽。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQ ID No:13-15或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包括28P2 HTH肽(SEQ ID NO:16)或28P4 HTH肽(SEQ ID NO:29)。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或更多个HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。

在一些实施例中，本文所公开的HTH肽用于治疗被木质部难养菌感染和/或有被木质部难养菌感染风险的葡萄植物的方法中，所述方法包括以下步骤：将上述组合物施用于被木质部难养菌感染和/或有被木质部难养菌感染风险的葡萄植物。在一些实施例中，将HTH肽局部地施用于植物，诸如葡萄植物。在一些实施例中，组合物包含本文公开的一种或多种HTH肽。在一些实施例中，组合物包含本文公开的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽。在一些实施例中，HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包含螺旋结构域，所述螺旋结构域包含选自SEQID No:13-15或其变体的氨基酸序列。在一些实施例中，HTH肽包括28P2 HTH肽(SEQ ID NO:16)或28P4 HTH肽(SEQ ID NO:29)。在一些实施例中，组合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个HTH肽，其中所述一个或更多个HTH肽包含选自SEQ ID No:16-18和28-32或其变体的氨基酸序列。

定义

本文所用的术语“施用(applying)”、“施用(application)”、“施用(administering)”、“施用(administration)”及其所有同源词是指用于使植物与本文所讨论的抗微生物肽组合物接触的任何方法。施用通常是通过将组合物以与待处理的植物相容的媒介物(即植物相容的媒介物或载体)诸如水性媒介物的形式施用到植物或植物周围的土壤中或者通过注入到植物中来实现。可以使用任何施用，但是一种施用方法包括本文所述的树干注入和叶面喷洒。其他方法包括通过注入、浸泡或喷洒施用到植物周围的土壤中，使得所施用的化合物可以与植物根接触并且可以被根吸收。也可以考虑其他局部施用。本文公开的组合物可以以下列任何方式被配制用于种子或植物处理：干粉、水可浆化的粉末、液体溶液、可流动的浓缩物或乳液、乳液、微胶囊、凝胶或水可分散的颗粒。

本文所述的抗微生物肽组合物也可以选自多种制剂类型，包括分离的抗微生物肽，其可以进一步与可粉化的粉末(DP)、可溶性粉末(SP)、水溶性颗粒(SG)、水分散性颗粒(WG)、可湿性粉末(WP)、颗粒(GR)(缓释或速释)、可溶性浓缩物(SL)、油混溶性液体(OL)、超低容量液体(UL)、可乳化浓缩物(EC)、可分散浓缩物(DC)、乳液(水包油(EW)和油包水(EO))、微乳液(ME)、悬浮液浓缩物(SC)、油基悬浮液浓缩物(OD)、气溶胶、雾化/烟雾制剂、胶囊悬浮液(CS)和种子/植物处理制剂结合。

在另一个实施例中，抗微生物肽组合物向植物的递送可以通过不同的途径。组合物可以适宜地作为气雾剂施用，例如通过喷洒到叶子或其他植物材料上。颗粒也可以通过例如直接注入到植物中，诸如注入到茎中被施用。在某些实施例中，将组合物施用于根部。这可以通过用组合物喷洒或浇水植物根部来实现。在其他实施例中，将颗粒引入到木质部或韧皮部中，例如通过注入或被包含在供给木质部或韧皮部的供水中。对植物的茎或叶的施用可以通过向植物的所需区域进行喷洒或其他直接施用来进行。然而，可以使用本领域已知的任何方法。含有活性成分剂量的抗微生物肽的溶液或媒介物可以用喷洒器施用于茎或叶，直到流出，以确保完全覆盖，并在生长季节重复三或四次。浓度、体积和重复处理可能因植物而异。

本发明的附加的实施例包括多核苷酸，其包含可以编码一种或多种本文所述的抗微生物肽的核酸序列。在一个具体的示例中，本发明可以包括多核苷酸，其包含被鉴定为SEQ ID NO.3-12、16-18、20、22-23和28-32或其变体的核酸序列。此类序列可以进一步与启动子可操作地连接以产生表达载体，并进一步被引入到植物(优选地柑橘类植物)中。在本实施例中，此类转化的植物或植物细胞可以产生抗微生物肽。这种转化的植物(其在优选的实施例中可以包括柑橘类植物)可以表现出对Clas(一种HLB病的病原体)的增强的耐药性。在附加的实施例中，转化的柑橘类植物可以表现出降低的Clas的细菌载量，和/或减轻的HLB病的症状或减慢的进展。稳定和瞬时植物转化的方法、系统和技术，诸如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化在本领域中是已知的，并且包括在本发明技术的范围内。

本发明技术的另一个实施例可以包括预测抗微生物肽的相对杀菌活性的新方法。在一个实施例中，本发明可以包括新型水:脂质分子动力学(MD)模拟系统，其提供了基于宿主单螺旋等预测螺旋-转角-螺旋支架的相对杀菌活性的方法。如本文所述的水:脂质系统中的MD模拟可以进一步预测肽在其附着和插入到细菌膜中的能力方面的相对效率。值得注意的是，附着和插入的效率越高，杀菌活性越高，并且对耐药性的敏感性越低。无论细菌如何演变出对单个螺旋的耐药性，通过MD模拟的螺旋-转角-螺旋工程改造提供了高度活性但对耐药性不敏感的杀细菌剂

在本实施例中，所述方法可以包括以下步骤：鉴定两亲性螺旋肽，诸如例如对柑橘类植物是内源性的P11。接下来，所述方法可以包括产生修饰的肽的步骤，所述修饰的肽基本上由两种两亲性螺旋肽组成，所述两亲性螺旋肽通过接头结构域偶联，形成螺旋-转角-螺旋支架构形，诸如如上所述的P26。接下来，所述方法可以包括确定脂质:水双层参数以生成模拟的细菌膜，然后进行分子动力学(MD)模拟以确定两亲性螺旋肽和修饰的肽附着到模拟的细菌膜，或插入到模拟的细菌膜中，或在附着或插入之后保持它们的构型的相对效率；以及比较两亲性螺旋肽和修饰的肽的相对杀菌活性。在附加的实施例中，两亲性螺旋肽(诸如在柑橘类植物中是内源的P11)可以被评估为二聚体构型。

所述方法的附加的实施例可以进一步包括施加GROMOS力场以监测两亲性螺旋肽和修饰的肽从水到脂质的附着的步骤。此外，可以确定脂质:水双层参数以产生模拟的细菌膜，其可以包括但不限于：确定脂质核中水分子的数量；确定翻转到脂质核中的极性脂质头基团的数量；确定疏水核中的残基的分数；以及确定螺旋内容。

虽然下面详细地讨论了本发明的各种实施例的制作和使用，但是应当理解，本发明提供了许多可应用的发明概念，这些发明概念可以在各种特定的环境中体现。本文讨论的具体实施例仅仅是说明制造和使用本发明的具体方式，并且不限制本发明的范围。

如本文所使用的术语“抗微生物肽”是指具有杀微生物和/或抑微生物活性的任何肽。

如本文所使用的，当化合物已经与至少一种与其天然缔合的组分分离时，将其称为“分离的”。例如，如果代谢物与污染物(包括多肽、多核苷酸和其他代谢物)分离，则代谢物可以被视为分离的。分离的分子可以合成制备或者可以从其自然环境中纯化。本领域中已知的标准定量方法可以用于获得和分离本发明的分子。

如本文所使用的术语“表达”或编码序列(例如，基因或转基因)的“表达”是指核酸转录单元(包括，例如，基因组DNA或cDNA)的编码信息被转化为细胞的操作性、非操作性或结构性部分的过程，通常包括蛋白质的合成。基因表达可能受到外部信号的影响；例如，将细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的试剂。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白质的途径中的任何地方受到调节。基因表达的调节例如通过作用于转录、翻译、RNA运输和加工的控制，中间分子诸如mRNA的降解，或通过特定蛋白质分子形成后的活化、失活、区室化或降解，或通过其组合发生。可以通过本领域中已知的任何方法在RNA水平或蛋白质水平上测量基因表达，包括但不限于Northern印迹；RT-PCR；Western印迹；或体外、原位或体内蛋白质活性测定。

术语“核酸”或“核酸分子”包括DNA的单链和双链形式；RNA的单链形式；以及RNA的双链形式(dsRNA)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为单个单链或双链体的核酸的有义链和反义链。

术语“基因”或“序列”是指与能够以某种方式调节基因产物(例如，多肽或功能性RNA)的表达的适当调节序列可操作地连接的编码区。基因包括在编码区(开放阅读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的DNA的未翻译调节区(例如，启动子、增强子、阻遏子等)，以及在适用的情况下，在各个编码区(即外显子)之间的中间序列(即内含子)。

核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸键连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸中的任一种或两种。如本领域技术人员将容易理解的，核酸分子可以被化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。此类修饰包括，例如，标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，不带电荷的键：例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等；带电荷的键：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；侧链部分：例如肽；嵌入剂：例如，吖啶、补骨脂素(psoralen)等；螯合剂；烷化剂；以及修饰的键：例如，α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链构象、双链构象、部分双链构象、三链构象、发夹构象、环状构象和垫锁构象。

如本文在两个核酸或多肽序列的上下文中使用的术语“序列同一性”或“同一性”是指两个序列中的残基，当在指定的比较窗内为了最大的对应性进行比对时，它们是相同的。如本文所使用的，术语“序列同一性的百分比”可以指通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列(例如，核酸序列)而确定的值，其中与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗内的序列部分可以包括添加或缺失(即间隙)。通过以下计算百分比：测定两个序列中相同核苷酸或氨基酸残基出现的位置数量，得到匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，得到序列同一性的百分比。与参考序列相比，在每个位置上相同的序列被称为与参考序列100％相同，反之亦然。

多核苷酸序列可以与靶基因的选定区域具有大体上的同一性、大体上的同源性或大体上的互补性。如本文所使用的，“大体上的同一性”和“大体上的同源性”表示彼此具有序列同一性或同源性的序列。一般而言，大体上相同或大体上的同源的序列将具有约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，其中序列同一性百分比基于整个序列，并且通过使用默认参数(GCG,GAP version 10,Accelrys,San Diego,CA)的GAP比对来确定。GAP使用Needleman和Wunsch((1970)《分子生物学杂志(J MoI Biol)》48:443-453)的算法来寻找两个完整序列的比对，其使匹配的数量最大化并且使序列间隙的数量最小化。具有100％同一性的序列是相同的。“大体上的互补性”是指序列彼此互补，并且能够彼此成碱基对。在描述互补序列时，如果第一个序列中的所有核苷酸均与第二个序列成碱基对，则这些序列是完全互补的。

用于比较的比对序列的方法在本领域中是公知的。各种程序和比对算法描述于，例如Smith和Waterman(1981)《先进应用数学(Adv.Appl.Math.)》2:482；Needleman和Wunsch(1970)《分子生物学杂志》48:443；Pearson和Lipman(1988)《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)》85:2444；Higgins和Sharp(1988)《基因(Gene)》73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等人(1988)《核酸研究(Nucleic AcidsRes.)》16:10881-90；Huang等人(1992)《计算机在生物科学中的应用(Comp.Appl.Biosci.)》8:155-65；Pearson等人(1994)《分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)》24:307-31；Tatiana等人(1999)《FEMS微生物学快报(FEMSMicrobiol.Lett.)》174:247-50中。序列比对方法和同源性计算的详细考虑因素可以在例如Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》,215:403-10。国家生物技术信息中心(NCBI)基本本地比对搜索工具(The National Center for Biotechnology Information(NCBI)Basic Local Alignment Search Tool)(BLAST

如本文所使用的，关于连续核酸序列的术语“同源”是指在适当条件下与参考核酸序列杂交的连续核苷酸序列。例如，同源序列可以具有约70％-100％，或更一般地80％-100％的序列同一性，诸如约81％；约82％；约83％；约84％；约85％；约86％；约87％；约88％；约89％；约90％；约91％；约92％；约93％；约94％；约95％；约96％；约97％；约98％；约98.5％；约99％；约99.5％；以及约100％。大体上的同源性的性质与特异性杂交密切相关。例如，当在需要特异性结合的条件下，例如在严格的杂交条件下，存在足够的互补程度以避免核酸与非靶序列的非特异性结合时，核酸分子是特异性可杂交的。

本发明的靶分子或蛋白质的同源物、变体和等位基因可以通过常规技术鉴定。如本文所使用的，多肽的同源物或变体是来自植物来源的多肽，其与所鉴定的多肽具有高度的结构相似性。

当与调节序列和编码序列结合使用时，术语“可操作地连接的”是指调节序列影响连接的编码序列的表达。“调节序列”或“控制元件”是指影响转录的时间和水平/量、RNA加工或稳定性或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子；翻译前导序列；内含子；增强子；茎环结构；阻遏子结合序列；终止序列；多聚腺苷酸化识别序列等等。特定的调节序列可以位于与其可操作地连接的编码序列的上游和/或下游。而且，与编码序列可操作地连接的特定调节序列可以位于双链核酸分子的相关互补链上。

如本文所使用的，术语“启动子”是指DNA的区域，其可以在转录开始的上游，并且可以参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动转录。启动子可以与用于在细胞中表达的编码序列可操作地连接，或者启动子可以与编码信号序列的核酸苷序列可操作地连接，所述信号序列可以与用于在细胞中表达的编码序列可操作地连接。“植物启动子”可以是能够在植物细胞中启动转录的启动子。在发育控制下的启动子的示例包括优先在某些组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中启动转录的启动子。此类启动子被称为“组织优选的”。仅在某些组织中启动转录的启动子被称为“组织特异性的”。“细胞类型特异性的”启动子主要驱动某些细胞类型在一个或多个器官中的表达，例如根或叶中的血管细胞。“诱导型”启动子可以是可以受环境控制的启动子。可以通过诱导型启动子启动转录的环境条件的示例包括厌氧条件和光的存在。组织特异性的启动子、组织优选的启动子、细胞类型特异性的启动子和诱导型启动子构成了“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下或在大多数细胞或组织类型中可能是活性的启动子。

如本文所使用的，术语“转化”或“遗传修饰的”是指将一种或多种核酸分子转移到细胞中。当核酸分子变得被细菌稳定地复制时，微生物被转导入细菌的核酸分子“转化”或“遗传修饰”。如本文所使用的，术语“转化”或“遗传修饰的”涵盖可以将核酸分子引入到这种细菌中的所有技术。

术语“载体”是指可以将DNA、RNA、蛋白质或多肽引入到宿主中的一些手段。待引入到宿主中的多核苷酸、蛋白质和多肽本质上可以是治疗性的或预防性的；可以编码或为抗原；可以是调节性质的等等。存在多种类型的载体，包括病毒、质粒、噬菌体、粘粒和细菌。

“表达载体”是能够在选定的宿主细胞或生物体中复制的核酸。表达载体可以作为自主结构复制，或者可替代地可以全部或部分整合到宿主细胞染色体或细胞器的核酸中，或者其被用作用于将外源DNA递送到细胞的穿梭器(shuttle)，并且从而与宿主细胞基因组一起复制。因此，表达载体是能够在选定的宿主细胞、细胞器或生物体中复制的多核苷酸，例如质粒、病毒、人工染色体、核酸片段，并且表达载体上的某些基因(包括感兴趣的基因)为此被转录并翻译成细胞、细胞器或生物体中的多肽或蛋白质；或本领域中已知的任何合适的构建体，其包含“表达盒”。相反，如本文的示例中所述，“盒”是含有本发明的表达载体的一部分的多核苷酸。盒的使用有助于表达载体的组装。表达载体是复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒、嵌合病毒或粘粒，并且含有可操作地连接到表达控制序列所需的多核苷酸序列。当表达控制序列控制和调节多核苷酸序列的转录和/或翻译时，多核苷酸序列可操作地连接到表达控制序列(例如，启动子和任选地，增强子)。

除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)、互补的(或互补)序列和反向互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子替换可以通过产生这样的序列来实现，其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见，例如，Batzer等人《核酸研究》19:5081(1991)；Ohtsuka等人《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人《分子和细胞探针(Mol.Cell.Probes)》8:91-98(1994))。由于核酸密码子的简并性，可以使用各种不同的多核苷酸来编码相同的多肽。如下面所提供的，该表含有哪些核酸密码子编码哪些氨基酸的信息。

氨基酸核酸密码子

除了编码氨基酸的核苷酸密码子的简并性质之外，多核苷酸中导致在给定位点产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码的多肽的功能性质的改变在本领域中是众所周知的。“保守氨基酸取代”是那些被预测为至少干扰参考多肽的性质的取代。换句话说，保守氨基酸取代基本上保存了参考蛋白的结构和功能。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一种更低疏水性的残基(诸如甘氨酸)或更高疏水性的残基(诸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致用一个带负电荷的残基取代另一个残基(诸如用天冬氨酸取代谷氨酸)或用一个带正电荷的残基取代另一个残基(诸如用赖氨酸取代精氨酸或组氨酸)的变化也可以被预期产生功能上等同的蛋白质或多肽。如下面所提供的，该表提供了示例性的保守氨基酸取代的列表。保守氨基酸取代通常保持(a)取代的区域中的多肽主链的结构，例如，如β折叠或α螺旋构象，(b)取代的位点处的分子的电荷或疏水性，和/或(c)侧链的体积。

氨基酸及保守取代物

商业上不可获得的寡核苷酸和多核苷酸可以化学合成，例如根据Beaucage和Caruthers《四面体快报(Tetrahedron Letts.)》22:1859-1862(1981)首先描述的固相亚磷酰胺三酯方法，或使用自动合成器，如在Van Devanter等人《核酸研究》.12:6159-6168(1984)中所描述的。用于合成寡核苷酸和多核苷酸的其他方法在本领域中是已知的。寡核苷酸的纯化是通过天然丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC进行的，如在Pearson&Reanier,《色谱杂志(J.Chrom.)》255:137-149(1983)中所描述的。附加的方法是本领域普通技术人员已知的。

如本文所使用的，术语“内源性”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何材料。

本文所用的术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。

当与例如细胞或核酸、蛋白质或载体一起使用时，术语“重组”表示该细胞、生物体、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源性核酸或蛋白质，或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或该细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可以表达在细胞的天然(非重组或野生型)形式中找不到的基因，或者表达异常表达(过度表达、表达不足或根本不表达)的天然基因。

术语“转基因的”、“转化的”、“转化”和“转染”在含义上类似于“重组的”。“转化”、“转基因的”和“转染”是指将多核苷酸转移到宿主生物体的基因组中或细胞中。多核苷酸的这种转移可以导致多核苷酸的遗传稳定的遗传或导致多核苷酸保留在染色体外(未整合到细胞的染色体中)。遗传稳定的遗传可能潜在地需要转基因生物体或细胞在一段时间内经受一种或多种条件，所述条件需要一些或所有转移的多核苷酸的转录，以使转基因生物体或细胞存活和/或生长。被转化到细胞中但未整合到宿主的染色体中的多核苷酸在细胞内仍作为表达载体存在。可能需要在某些生长或环境条件下使细胞生长，以便使表达载体保留在细胞或细胞的子代中。进一步地，为了使表达发生，生物体或细胞可能需要保持在某些条件下。含有重组多核苷酸的宿主生物体或细胞可以被称为“转基因的”或“转化的”生物体或细胞，或者简称为“转化体”，以及重组生物体或细胞。

遗传改变的生物体是其遗传物质发生任何改变的任何生物体，无论是在细胞核中还是在细胞质(细胞器)中。因此，遗传改变的生物体可以是重组或转化的生物体。遗传改变的生物体也可以是经受一种或多种诱变剂的生物体，或者是经受一种或多种诱变剂的生物体的后代，并且与野生型生物体(即，不经受诱变剂的生物体)相比，其DNA具有由一种或多种诱变剂引起的改变。而且，经繁殖以将突变整合到其遗传物质中的生物体是遗传改变的生物体。为了本发明的目的，所述生物体是植物。

术语“植物”包括整株植物、植物器官、整株植物或植物器官的后代、胚胎、体细胞胚、胚状结构、原球茎、类原球茎(PLB)和植物细胞的悬浮液。植物器官包括例如芽的营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如，维管组织、地面组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、毛状体等)。可以用于本发明的方法中的植物的种类通常与适用于本文所述的分子生物学和植物育种技术的高等和低等植物的种类一样广泛，特别是被子植物(单子叶的(单子叶植物)和双子叶的(双子叶植物)植物，包括真双子叶植物。它包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。在一个优选的实施例中，本文所述的遗传改变的植物可以是双子叶作物，诸如柑橘。

术语“大约”和“约”是指相对于参考数量、水平、值或量变化高达30％，或者在另一实施例中变化高达20％，并且在第三实施例中变化高达10％的数量、水平、值或量。

如本文所使用的，关于抗微生物肽的使用或效果的术语“增加”是指与野生型相比增加。

如本文所使用的，关于抗微生物肽的使用或效果的术语“减少”是指与野生型相比减少。

此外，术语“低”(例如，当描述低毒性时)是指抗微生物肽的毒性水平将与单个两亲性螺旋肽的施加大约相同，或者毒性水平为哺乳动物细胞或宿主将不表现出显著毒性作用的水平。在一些实施例中，新型抗微生物肽(例如，HTH肽或AAP)可以表现出低毒性或无毒性，这可能意味着与内源性两亲性肽(例如，ALHP或野生型两亲性肽)相比，它们表现出相似水平的毒性或植物毒性。

此外，术语“低”(例如，当描述低植物毒性时)是指抗微生物肽的毒性水平将与单个两亲性螺旋肽的施用大约相同，或者毒性的水平为植物生长和其他性质和功能可能不受抗微生物肽显著影响的水平。

如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“肽”包括单个肽和多个肽。

如上所述，上述组合物和物质可以用于调节植物、其种子、根、果实、叶(foliage)、茎、块茎中的韧皮部杆菌属(Candidatus Liberibacter spp.)侵染，并且特别地抑制和/或预防韧皮部杆菌属感染，尤其是降低植物中韧皮部杆菌属的传播速率和/或程度。虽然优选的实施例可以包括柑橘类植物，但是附加的植物包括但不限于水果(例如，草莓、蓝莓、黑莓、桃子和其他核果类水果)、蔬菜(例如，番茄、南瓜、胡椒、茄子、马铃薯、胡萝卜)或谷类作物(例如，大豆、小麦、水稻、玉米、高粱)、树、花、观赏植物、灌木(例如，棉花、玫瑰)、球茎植物(例如，洋葱、大蒜)或藤本植物(例如，葡萄藤)、草皮、块茎(例如，马铃薯、胡萝卜、甜菜)。可替代地，本发明的组合物可以用于调节植物中韧皮部杆菌属感染的量，并且特别地预防或抑制韧皮部杆菌属感染和/或降低所述植物中疾病感染的传播速率和/或程度。

本领域技术人员知道将基于微生物的组合物施用于植物用于表面施用或用于吸收的各种方法，并且这些方法中的任何一种都预期用于本公开。作为非限制性实例，施用于植物的方法包括通过包含在灌溉水中，通过注入到植物中或植物周围的土壤中，通过将根系暴露于含有化合物的水溶液中，通过在水培或气栽系统中使用，通过在含有诱导剂的培养基中培养植物细胞的个体或组，通过种子处理，通过将用于嫁接的柑橘类植物的插条暴露于含有化合物的水溶液，通过施用于根、茎或叶，或通过施用于植物内部或待处理植物的任何部分而施用到植物的任何部分。预期本领域技术人员已知的任何手段都。一种施用方式包括将组合物施用在植物的根处、根上或根附近，或树干注入。基于微生物的组合物的施用可以在苗圃环境、温室、水培设施中进行，或在田间进行，或在其中期望处理植物以防止疾病的可能性或治疗疾病及其影响(例如，在已经或可能暴露于HLB或Clas感染的植物中)的任何环境中进行。本公开的方法和化合物可以用于治疗任何韧皮部杆菌属物种或类型的感染，并且可以用于改善未感染的植物中的植物防御。因此，在本公开的上下文中，任何有需要的植物包括需要健康和活力，生长和生产力或抵抗疾病能力得到改善的任何和所有植物。柑橘或其他易患诸如HLB疾病或韧皮部杆菌属物种感染的植物，无论当前是否已感染或有感染的潜在风险。

如本文所定义的，关于任何两亲性螺旋肽或抗微生物肽，术语“来源于”或“来自”是指直接从特定来源分离或获得，或可替代地具有从特定来源分离或获得的物质或生物体的鉴定特征。在“来源”是生物体的情况下，“来源于”或“来自”是指它可以从生物体本身或从用于培养或生长所述生物体的培养基中分离或获得。

如本文所使用的，术语“柑橘”是指芸香(Rutaceae)科柑橘属的任何植物，并且包括柚(Citrus maxima)(柚子(Pomelo))、香橼(Citrus medica)(枸橼(Citron))、小柑橘(Citrus micrantha)(大翼橙(Papeda))、柑橘(Citrus reticulata)(柑桔(Mandarinorange))、枳(Citrus trifolata)(枸橘(trifoliate orange))、金柑(Citrus japonica)(金橘(kumquat))、手指柠檬(Citrus australasica)(指橙(Australian Finger Lime))、澳洲圆青柠(Citrus australis)(澳橙(Australian Round lime))、澳洲沙漠青柠(Citrusglauca)(澳洲沙地橘(Australian Desert Lime))、Citrus garrawayae(Mount WhiteLime)、Citrus gracilis(卡卡杜酸橙(Kakadu Lime)或Humpty Doo Lime)、Citrusinodora(Russel River Lime)、Citrus warburgiana(Citrus warburgiana)(New GuineaWild Lime)、Citrus wintersii(Brown River Finger Lime)、Citrus halimii(limaukadangsa，limau kedut kera)；印度野橘(Indian wild orange)、马蜂橙(Citrusmacroptera)和Citrus latipes。在这一定义中还包括杂交物，例如Citrus.times.aurantiifolia(青酸橙(Key lime))、Citrus,times,aurantium(苦橙(Bitter orange))、Citrus.times.Latifolia(波斯酸橙(Persian lime))、Citrus.times.limon(柠檬(Lemon))、Citrus.times.limonia(兰卜莱檬(Rangpur))、Citrus.times.Paradisi(葡萄柚(Grapefruit))、Citrus.times.sinensis(甜橙(Sweetorange))、Citrus.times.tangerina(红橘(Tangerine))、Poncirustrifoliata.times.C.sinensis(卡里佐枳橙(Carrizo citrange))和任何其它已知的柑橘属的物种或杂交物。以其常用名已知的柑橘包括帝国柠檬(Imperial lemon)、橘柚(tangelo)、柚橙(orangelo)、橘柑(tangor)、金诺橘(kinnow)、清见橘(kiyomi)、明尼橘柚(Minneola tangelo)、白金柚(oroblanco)、甜橙、丑橘(ugli)、佛手柑(Buddha's hand)、香橼、柠檬、橙子、香柑(bergamot orange)、苦橙、血橙、加利蒙地亚橘(calamondin)、Clementine、葡萄柚、梅尔柠檬(Meyer lemon)、兰卜莱檬、红橘和yuzu，并且这些也包括在柑橘或柑橘属的定义中。

术语治疗和/或预防是指提供“有效量”或“治疗有效量”，其是指达到其目的化合物或组合物的任何量，所述目的例如，治疗植物疾病，提高植物防御疾病的能力，减少疾病症状，治疗HLB，增加对HLB的耐药性，最小化由于植物疾病引起的作物产量下降，提高作物生产力，以及提高作物质量。

当与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以表示“一个”，但是它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。在权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指备选方案或备选方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅指备选方案和“和/或”的定义。在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括装置的误差的固有变化、用于确定该值的方法或研究受试者之间存在的变化。

如在本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含(comprising)”(和任何形式的包括，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的包含，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并且不排除附加的、未陈述的元件或方法步骤。

如本文所使用的术语“其任意组合”是指该术语之前所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其任意组合”旨在包括以下中的至少一项：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定上下文中顺序很重要，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续本示例，明确包括含有一个或多个项目或术语重复的组合，诸如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，通常对任意组合中的项目或术语的数量没有限制，除非从上下文来看是明显的。

根据本公开，本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法都可以在没有过度实验的情况下制备和实施。虽然已经根据优选的实施例描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域技术人员将明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对组合物和/或方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序进行变化。对于本领域技术人员明显的是，所有这些类似的替代和修改被认为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。

现在一般性描述的本发明将通过参考以下实例更容易地理解，所包括的实例仅用于说明本发明的实施例的某些方面。这些实例并不旨在限制本发明，因为本领域技术人员将从上述教导和以下实例中认识到，在不脱离所要求保护的发明的范围的情况下，其他技术和方法可以满足权利要求并且可以使用。

在以下实例中进一步说明本发明，这些实例不应被视为限制本发明的范围。

具体实施方式

实例1：对宿主两亲性螺旋的细菌耐药性的演变和表征。

如上所述，宿主两亲性螺旋肽的最大缺点是细菌耐药性的演变，即细菌阻断肽对细菌膜的附着、插入和破裂的能力。确定耐药菌株如何阻断给定的宿主两亲性螺旋肽的活性的最直接的方法是：首先产生针对肽的耐药菌株，然后对耐药菌株的基因组进行测序，最后鉴定肽对细菌膜的附着、插入和破坏产生不利影响的突变基因。然而，这些实验不能用韧皮杆菌属完成，因为它是不可培养的。因此，本发明人选择了两种人大肠杆菌菌株来产生对内源两亲性螺旋肽的耐药性，并且鉴定通过阻止肽对细菌膜的附着、插入和破坏而赋予耐药性的突变基因。下面的表1和表2列出了目标大肠杆菌菌株中对具有序列KKLIKKILKIL的内源柑橘两亲性螺旋肽P11具有耐药性的突变基因，其中碱性和疏水性氨基酸片(patch)在结构中交替。如本发明人所示，所有的突变导致基因功能失效。而且，需要多个基因(而不是一个或几个)的突变来赋予耐药性。还如所示出的，除了两靶个基因外，其余突变发生在两个不同耐药菌株的不同基因中。因此，涉及不同基因突变的不同途径可能导致对相同抗微生物肽P11的细菌耐药性。尽管如此，两种不同大肠杆菌菌株中基因突变的两种不同途径似乎阻碍了P11对细菌膜的附着、插入或破裂，从而赋予耐药性。

如下表1和表2所示，rsxC和mlaD基因的插入突变在两种耐药大肠杆菌菌株中均很常见。这两个基因中的插入导致它们的功能失效。MlaD蛋白参与磷脂从外膜向内膜的转移。因此，MlaD功能的丧失可能导致较厚的外膜，从而阻碍内源性两亲性螺旋的插入。耐药大肠杆菌BL21菌株中的waaP/rfap和yejP中的禁用插入突变降低了P11与细菌外膜的附着。waaP/rfap突变导致LPS的中部/外部区域上的磷酸基团的去除，而yejP突变导致从脂质A中去除磷脂酰乙醇胺，这两种情况都减少了外膜上的负电荷，并因此减少了P11的附着。耐药大肠杆菌BL:21菌株中asmA的禁用插入突变导致外膜上缺陷组织OmpF孔蛋白，从而导致P11附着减少。leuO和亮氨酸前导肽基因中的基因间插入突变导致leuO操作子的破坏和leuO基因表达的抑制。这导致脂质A的糖基化和P11附着的减少。在耐药大肠杆菌ATCC25922菌株中，血凝素fhaC基因中的禁用缺失突变和磷脂酶pldA基因中的插入突变会减少P11的附着，而在entS/ybdA转运体基因中的禁用插入突变会减少P11的插入。耐药大肠杆菌ATCC25922菌株中的wcaK和wzxC基因中的基因间插入导致胞外多糖结肠酸的抑制，导致P11附着的减少。

总之，本实例已经证明，大肠杆菌中的耐药性归因于内源性两亲性螺旋P11。因此，本实例已经证明：(i)通过附着和插入的减少，可能需要多个基因和基因间突变用于针对抗微生物肽(AMP)的耐药性；(ii)不同组的突变可以导致附着和插入的减少，并且因此导致抗微生物肽(例如，P11)活性的降低；(iii)多个基因中的突变导致抗微生物肽(例如，P11)附着和/或插入的减少；以及(iv)在CLas中也仅存在赋予抗微生物肽(例如，P11)耐药性的基因的子集。因此，可能需要这一亚组上的突变和可能的附加的基因用于针对相同抗微生物肽的CLas耐药性。

实例2：下一代宿主衍生的两亲性螺旋抗微生物肽(例如，HTH肽、AAP)的设计。

在一个优选的实施例中，本发明人证明了基于宿主类似物的新型两亲性螺旋的设计可以形成抗-CLas治疗，其比宿主类似物更有活性且毒性更低，并且预期对细菌耐药性不敏感。如上所述，宿主单个两亲性螺旋引起结构不稳定性，导致活性降低以及对细菌/宿主蛋白酶的敏感性降低。本发明人试图经由通过接头结构域偶联两个两亲性螺旋(在这一情况下为P11)以产生螺旋-转角-螺旋AMP来产生新的AMP(例如，HTH肽，AAP)。具体地，如图1所示，本发明人通过GPGR-转角或接头连接了两个宿主螺旋。在这一构型中，GPGR-转角或接头可以阻止一个螺旋的N-末端和另一个螺旋的C-末端的末端磨损。这一构型形成螺旋-转角-螺旋支架，其表现出比宿主单一两亲性螺旋更高的稳定性，并且因此对蛋白酶消化更不敏感。此外，如图1所示，疏水性残基位于支架的内部，而碱性残基位于表面。疏水性残基和碱性残基的这种排列可以促进有效的CLas膜附着和螺旋-转角-螺旋支架的插入，此类螺旋-转角-螺旋构型通常被表示为P26。通过用两个半胱氨酸取代两个疏水性残基(每个螺旋一个)形成S-S桥，可以进一步提高P26螺-旋转角-螺旋肽的稳定性，通常被鉴定为cysP26(参见图1)。最后，在环状支架中可以进一步阻止螺旋的端部磨损，其中两个螺旋和两个GPGR-转角可以耦合在一起，通常被鉴定为cycP30(参见图1)。

本发明人接下来进行了宿主单螺旋P11和工程改造的螺旋-转角-螺旋支架P26的结构-活性分析。为此，我们对合成脂质双层(或者换句话说模拟的细菌膜)中的P11和P26进行了分子动力学(MD)模拟。图2描述了水:脂质双层的组成和尺寸。首先，使用GROMOS力场进行MD模拟，以监测P11二聚体和P26从水到脂质的附着。在100纳秒的平衡后，从1微秒轨迹计算P11二聚体和P26的平均附着图谱。图3A显示了P11二聚体和P26的膜附着差异。值得注意的是，P26比P11二聚体更深地进入脂质双层，同时仍保持螺旋构象，而P11二聚体经历了螺旋到卷曲的转变。

脂质核内部的P11二聚体和P26的MD模拟也可以是本发明技术的信息来源。具体地，在150纳秒的平衡后，从1微秒的MD轨迹计算四个参数。它们是：脂质核中水分子的数量；翻转到脂质核中的极性脂质头基团的数量；疏水核中残基的分数；以及螺旋内容。本发明人预测，肽的这些参数的值越高，插入效率越高，从而杀菌活性越高。根据这些标准，预计P26比P11二聚体显示出更高的杀菌活性。本发明人通过测量P11和P26对三种大肠杆菌野生型和P11耐药菌株的最小抑制浓度(MIC)来测试来自MD模拟研究的预测。下表3列出了MIC值，其表明P26不仅比P11更具活性，而且对细菌耐药性不敏感。

已经对基于柑橘P11的几种螺旋-转角-螺旋P26支架进行了进一步的结构-活性分析(参见表4)。这些包括图1所示的P26、cysP26和cycP30。此外，本发明人基于柑橘单个12个氨基酸肽12P启动了对螺旋-转角-螺旋28P支架的结构-活性研究(参见表4)。最后，基于长度为10至30个氨基酸的单个两亲性柑橘螺旋的螺旋-转角-螺旋支架的结构分析大体上在下表4中示出，其具体显示了基于柑橘单螺旋10P和27P的螺旋-转角-螺旋支架。

实例3：不同肽对本氏烟草叶肉原生质体的活力的影响。

如图9所示，取幼叶，在含有甘露醇、氯化钙和MES的缓冲液中，用纤维素酶和离析酶在黑暗中孵育5h。原生质体穿过干酪布(cheese cloth)而被释放。用不同浓度的肽孵育原生质体，并在1h后拍照。具有球形形状的细胞被定义为活的。细胞死亡的迹象包括失去球形形状、释放叶绿体和原生质体聚集。此处的箭头表示因肽的毒性作用已经被损坏的细胞。P11是工程改造得到P26和cysP26的单螺旋。

实例4：新型螺旋-转角-螺旋支架的功效测试测定。

进行了两次杀菌测定，其包括在CLas感染的柑橘叶和木虱上处理宿主单螺旋(P11或P11-R)和设计的螺旋-转角-螺旋支架，以及随后清除CLas。叶和木虱测定如下所述：

柑桔叶盘测定

用温和的皂清洗CLas感染的叶子。使用4mm的活检穿孔器从叶的中脉上取下小圆盘。将圆盘成组地排列在96孔板上，其中每片叶子在每种对照或处理溶液中具有圆盘。使用200μL含100μM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)的灭菌自来水作为孵育缓冲液，并且用于阴性对照。在0.5mM的缓冲液中加入抗微生物肽，并与叶盘一起孵育48小时，取出叶盘，并使用液氮研磨和苯酚(pH 8.0)单独处理，以用于总核酸提取。

使用DNeasy plant mini kit(Qiagen，美国马里兰州盖瑟斯堡)分离DNA，并用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific，美国特拉华州威明顿市)测定数量和质量。使用ABI7500热循环仪(Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特市)，经Gotaq RT-OneStep和Las Long引物进行实时qPCR测量，每次反应装载100ng核酸。阈值循环(C

木虱测定：

这一测定涉及以下步骤：CLas分离离心和甘油提取，添加(P11或P11-R)和设计的螺旋-转角-螺旋支架，通过PMAxx去除木虱DNA，以及提取和监测CLas DNA还原。CLas清除率通过叶盘测定中所述的方法进行估计。

如图4A-4B所示，工程改造的螺旋-转角-螺旋支架证明了从被感染的柑橘叶和木虱中清除CLas的能力。

实例5：各种工程改造的抗微生物肽的溶血测定分析。

如图5A-5B所示，使用Evans等人(Evans BC,Nelson CE,Yu SS,Beavers KR,KimAJ,Li H,Nelson HM,Giorgio TD,Duvall CL.《可视化实验杂志(J Vis Exp.)》2013年3月9日；(73):e50166.doi:10.3791/50166)描述的方案进行溶血测定。将人红细胞在PBS中的10％(v/v)悬浮液储存在4℃下。当需要时，将悬浮液在PBS中以1:10稀释，并一式三份，将100μl添加到100μl的在96孔板中的2倍系列稀释肽中。使用1％的吐温20实现完全溶血。使用仅含PBS的RBC作为对照。将板在37℃下孵育1h，并以3,000rpm(900x g)离心10min。然后，将160μl的上清液转移到新的96孔板中，以使用微孔板读取器测量405nm处的吸光度，并计算溶血百分比。

实例6：来自葡萄植物的HTH肽的鉴定

约30年前，发现宿主两亲性线性螺旋肽对病毒、细菌和真菌病原体具有抗微生物活性[38-40]。在人类中，这些抗微生物肽既作为分离的实体(例如，LL-37)存在，又作为蛋白质中的隐藏元件存在[41-42]。然而，在植物中，这些抗微生物肽仅作为隐藏元件存在于蛋白质中[43]。无论它们来源于人类还是植物蛋白质组，宿主抗微生物肽的发现都带来了很大的希望，即希望它们可以用作抗生素特别是多药耐药细菌的可行替代品。这些宿主抗微生物肽从外部作用并在细菌膜中产生孔，而抗生素需要进入细菌细胞并靶向细菌内部的DNA/RNA/蛋白质/细胞壁合成机制。因此，提供对抗生素的细菌耐药性的机制不太可能对宿主抗微生物肽起作用[38-40]。不幸的是，宿主抗微生物肽可能取代抗生素的希望落空了。很快发现，细菌能够对宿主抗微生物肽演变出耐药性[44]。此外，这些肽可能潜在地对人和植物具有毒性[45-46]。

本实例提供了一种通过转角将两个宿主两亲性螺旋肽连接来设计HTH肽的策略[47]，使得所设计的HTH肽具有一种或多种选自以下的性质：(a)比组成型单个两亲性螺旋更高的杀菌活性(例如，HTH肽比野生型两亲性螺旋肽具有增加的杀菌活性)；(b)对人和植物无毒性(或降低的毒性)；(c)对细菌耐药性没有(或降低的)敏感性；以及(d)增强宿主免疫的能力。

基于长度为11-18个氨基酸的宿主两亲性单螺旋，我们设计了几种HTH肽。表6显示了这些设计的HTH肽对大肠杆菌的ATCC菌株(ATCC 25922)的最小抑制浓度(MIC)。显示了11P单螺旋的MIC值以供比较。

表9显示了针对各种人和植物革兰氏阴性菌测得的HTH肽的MIC。表9还显示了易感和耐药植物和人类革兰氏阴性菌的26P和28P序列变体的MIC值。

表7显示了11P-1和相应的HTH 26P-1对3种不同大肠杆菌菌株的MIC值，这些菌株具有公布的基因组序列：

[1]K12＝

ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？mode＝Info&id＝511145&lvl＝3&lin＝f&keep＝1&srchmode＝1&unlock；

[2]BL21(DE3)＝ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝469008

[3]ATCC 25922＝ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝1322345

对宿主单螺旋两亲性螺旋11P具有耐药性的三种不同的大肠杆菌菌株也是在体外衍生的。如表8所示，来源于11P-1的HTH 26P-1对所有对11P-1具有耐药性的大肠杆菌菌株都具有活性。

本文所述的HTH肽(诸如26P)与内源性ALHP(例如，单螺旋(诸如11P))不同，因为HTH肽对细菌耐药性不敏感。如本文所述，诸如关于柑橘中HLB的治疗的实例，策略涉及两个关键步骤。首先，我们鉴定了两种对11P具有耐药性的大肠杆菌菌株(BL21和ATCC 25922)的突变。观察到，多个基因和基因间突变实际上通过将MIC提高10-20倍而赋予对11P的耐药性。而且，如表10所示，不同的耐药性大肠杆菌菌株具有不同的突变集合，只有少数共同的突变(以黄色突出显示)。然而，所有的基因和基因间突变都减少了11P引起的膜附着、插入和破裂，这是杀菌活性所必需的。

图10示出了两种大肠杆菌菌株中的突变对11P引起的膜附着、插入和破裂的影响。具体地，图10示出了对11P具有耐药性的两种大肠杆菌BL21和ATCC 25922菌株中的基因和基因间突变。

有意见认为，宿主单个两亲性螺旋的寡聚化有利于膜的附着、插入和断裂[48]。因此，构建了HTH肽，其中两个组成螺旋更能二聚化，因此，它们将具有更高的附着至膜、插入到膜中和使膜破裂的能力。因此，不仅HTH肽比单螺旋更具活性，而且还能够克服耐药性突变。如表6和7所示，28P-2(一种有希望的杀菌剂)对人细菌(大肠杆菌、绿脓杆菌(P.aeruginosa)和肠道沙门菌(S.enterica))和植物细菌(丁香假单胞菌(P.syringae)、木质部难养菌、叶斑病(X.perforans))的MIC在1.3-3μM的范围内，除了针对一种大肠杆菌菌株的6μM外)。28P-2对人细胞(红细胞、免疫细胞HL-60和肺/皮肤上皮细胞)的毒性仅高于20μM，这远远高于针对人和植物细菌的MIC。相反，11P的MIC在15-40μM范围内，并且对人和植物的细胞毒性≥40μM。

此外，人和植物两亲性螺旋抗微生物肽都具有免疫调节活性[49-52]。如随后的实例中所示，HTH肽的处理导致受感染植物中先天免疫基因的上调。最后，有报告称，宿主来源的抗微生物肽的存在可能会保护有益的宿主微生物组[53-55]。在一些实施例中，本文公开的抗微生物肽(例如，HTH肽)对植物微生物组具有有益的作用。

实例7：HTH肽对木质部难养菌PD菌株的作用

表11显示了所选的HTH肽对木质部难养菌PD菌株的MIC值。在所测试的HTH肽中，28P序列变体(例如，28P-2/4/8(以粗体显示))显示出最低的MIC值。

实例8：葡萄细胞中HTH肽的毒性分析

图11显示了葡萄(Himrod)原生质体在未处理(对照)和在11P、28P-2和28P-4处理下的毒性分析。破碎球体的结块(用箭头标记)表示毒性，而分离的完整球体表示无毒性。

实例9：HTH肽对烟草植物中免疫调节的作用

基于文献数据[50,55]并且不希望受理论束缚，HTH肽可能影响涉及PTI、ETI、SA、JA和ET信号传导的植物先天免疫途径。图12显示了选择用于分析的这些途径中的重要基因。最初，考虑到革兰氏阴性细菌感染诸如木质部难养菌诱导的先天免疫途径的可用性[55]，选择烟草植物用于研究HTH肽的免疫调节。

烟草植株接种丁香假单胞菌(Pst)(10

图13显示了用Pst、28P-2和Pst+28P-2处理的烟草中基因表达的热图。

图14A显示了每个基因的平均倍数变化，其对应于各种条件下的净植物先天免疫防御。应当注意，在所有三种情况下，在第三小时存在尖峰。但当接种Pst并用单独的28P-2处理时，最初的尖峰随后跌落。然而，当用28-P2处理感染的植物时，先天免疫防御稳定地增加直至12小时，并在24小时逐渐下降至基础水平。应当注意，如图14B所示，细菌在24小时几乎被完全清除，此时不需要免疫防御。

实例10：使用HTH肽治疗葡萄植物中的木质部难养菌感染

在索诺马县鉴定葡萄藤的感染田。从每棵被感染的葡萄藤的不同部位采集叶片。十片叶子被放在密封的塑料袋里。将六个此类袋送至NMC Biolab进行分析，并将四个袋送至All Crops Solution Inc.(一个诊断实验室)进行独立分析。如图15所示，将来自每个袋的五片叶的叶柄浸入到30μL缓冲液(对照)和来自六个袋的28P-2处理的叶的30μL的20μM中。NMC Biolab和All Crops Solution Inc.的独立分析产生相同的结果。如图15所示，28P-2的处理完全清除了来自被感染叶片的木质部难养菌。

实例11：使用HTH肽预防和治疗木质部难养菌(Xf)感染

在实验室实验的基础上，28P-2和28P-4被鉴定为最有前途的抗Xf螺旋-转角-螺旋(HTH)肽。我们进行了小规模的田间试验，以确定在索诺马县被感染的葡萄藤的树干上喷洒的28P-2和28P-4(每株葡萄藤100ml，20μM肽浓度，混合在pentra bark中)的效果。应当注意，pentra bark(一种常用的表面活性剂)允许肽渗透通过木质组织。图16描述了研究设计。选择14个被感染的葡萄藤的地块进行28P-2和28P-4处理。将6个被感染的葡萄藤的地块用于未处理的对照。在第1天(D1)、第3天(D3)和第5天(D5)喷洒28P-2和28P-4 3次，并在第2、4和6天(D2、D4和D6)采集样品，用于通过qPCR测量Xf载量。第11天(D11)和第17天(D17)的样品在第5天最后一次喷洒之后采集。

图17A显示了用混合在pentra bark中的28P-2和28P-4处理的采集的样品相对于未处理的样品的相对清除率。图17B显示了在28P-2和28P-4处理后，木质部难养菌从葡萄叶中的相对清除率。通过qPCR测量Xf清除率％，得到与细菌载量相对应的Ct值。应当注意，28P-2和28P-4能够完全清除burke和绿叶中的Xf。

最后，在最后一次喷洒后3个月，我们监测了被感染的未处理的葡萄藤和被感染的处理的葡萄藤中PD症状的表达。图18显示，与未处理的葡萄藤相比，处理的被感染的葡萄藤显示出显著减轻的叶烧焦症状。

示例性实施例

下文描述了示例性工程改造的抗微生物肽和其用途。

1.一种抗微生物肽，其包含通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽。

2.根据实施例1所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源两亲性螺旋肽。

3.根据实施例2所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和/或所述第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合。

4.根据实施例2所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和/或所述第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合。

5.根据实施例4所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

6.根据实施例5所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有被鉴定为SEQID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

7.根据实施例2所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽是相同的两亲性螺旋肽。

8.根据实施例7所述的抗微生物肽，其中所述抗微生物肽选自由以下组成的群组：P26、26P1、26P2、26P3、26P4、26P5、cysP30、41P、28P、28P1、28P1-2、24P和58-P。

9.根据实施例7所述的抗微生物肽，其中所述抗微生物肽选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.3-12、16-18、20、22-23和28-32或其变体。

10.根据实施例9所述的抗微生物肽，其由包含核酸序列的多核苷酸编码。

11.根据实施例10所述的多核苷酸，其与启动子连接以产生表达载体。

12.一种遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的根据实施例10所述的多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。

13.根据实施例9所述的抗微生物肽，其用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

14.根据实施例13所述的抗微生物肽，其用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

15.根据14所述的组合物，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物的局部施用物。

16.根据15所述的组合物，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

17.根据实施例3所述的抗微生物肽，其中来自每个所述两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

18.根据实施例1所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单一内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

19.根据实施例1所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。

20.根据实施例1所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

21.一种抗微生物肽，其包含通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.3。

22.根据实施例21所述的抗微生物肽，其中所述P11两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源P11两亲性螺旋肽。

23.根据实施例21所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

24.根据实施例23所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有被鉴定为SEQID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

25.根据实施例21所述的抗微生物肽，其中来自每个所述P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

26.根据实施例25所述的抗微生物肽，其被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9。

27.根据实施例21所述的抗微生物肽，其进一步构成偶联所述两个P11两亲性螺旋肽的第二接头结构域，形成环状支架构形。

28.根据实施例27所述的抗微生物肽，其被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11。

29.根据实施例21所述的抗微生物肽，其由包含核酸序列的多核苷酸编码。

30.根据实施例29所述的多核苷酸，其与启动子连接以产生表达载体。

31.一种遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的根据实施例29所述的多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。

32.根据实施例21所述的抗微生物肽，其用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

33.根据实施例32所述的抗微生物肽，其用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

34.根据实施例33所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物的局部施用物。

35.根据实施例34所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

36.根据实施例21所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单一内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

37.根据实施例21所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺-旋转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。

38.根据实施例21所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

39.一种抗微生物肽，其包含通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个两亲性螺旋肽，其中来自每个所述两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

40.根据实施例39所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源两亲性螺旋肽。

41.根据实施例40所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合。

42.根据实施例40所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合。

43.根据实施例42所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域分别包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

44.根据实施例43所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有被鉴定为SEQID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

45.根据实施例40所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽是相同的两亲性螺旋肽。

46.根据实施例45所述的抗微生物肽，其中所述抗微生物肽被鉴定为氨基酸SEQID NO.9。

47.根据实施例46所述的抗微生物肽，其由包含核酸序列的多核苷酸编码。

48.根据实施例47所述的多核苷酸，其与启动子连接以产生表达载体。

49.一种遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的根据实施例47所述的多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。

50.根据实施例39所述的抗微生物肽，其用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

51.根据实施例50所述的抗微生物肽，其用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

52.根据51所述的组合物，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物的局部施用物。

53.根据52所述的组合物，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

54.根据实施例39所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述两个两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加，并且其中来自每个所述两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

55.根据实施例39所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述两个两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加，并且其中来自每个所述两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

56.根据实施例39所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述两个两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低，并且其中来自每个所述两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

57.根据实施例39所述的抗微生物肽，其进一步构成偶联所述两个P11两亲性螺旋肽的第二接头结构域，形成被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11的环状支架构形。

58.一种抗微生物肽，其包含通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，并且其中来自每个所述P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述两亲性螺旋肽之间形成二硫键，所述P11两亲性螺旋肽被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.9。

59.根据实施例58所述的抗微生物肽，其中所述P11两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源P11两亲性螺旋肽。

60.根据实施例58所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

61.根据实施例60所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有被鉴定为SEQID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

62.根据实施例58所述的抗微生物肽，其由包含核酸序列的多核苷酸编码。

63.根据实施例62的多核苷酸，其与启动子连接以产生表达载体。

64.一种遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的根据实施例62所述的多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。

65.根据实施例58所述的抗微生物肽，其用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

66.根据实施例65所述的抗微生物肽，其用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

67.根据66所述的组合物，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物的局部施用物。

68.根据67所述的组合物，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

69.根据实施例58所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加，其中来自每个所述P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被在所述P11两亲性螺旋肽之间二硫键的半胱氨酸残基取代。

70.根据实施例58所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加，其中来自每个所述P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

71.根据实施例58所述的抗微生物肽，其中通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的所述第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低，其中来自每个所述P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

72.一种抗微生物肽，其包含通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽。

73.根据实施例72所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源两亲性螺旋肽。

74.根据实施例73所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：P11、11P1、12P、12P1、12P-2、10P、26P、27P和28P或其任意组合。

75.根据实施例74所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽各自选自由以下组成的群组：SEQ ID NO.1-2、13-15、19、21和24-27或其任意组合。

76.根据实施例75所述的抗微生物肽，其中所述第一接头结构域和所述第二接头结构域分别包含具有至少四个氨基酸的第一肽接头和第二肽接头。

77.根据实施例76所述的抗微生物肽，其中所述第一接头结构域和所述第二接头结构域包含具有被鉴定为SEQ ID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

78.根据实施例73所述的抗微生物肽，其中所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽是相同的两亲性螺旋肽。

79.根据实施例78所述的抗微生物肽，其中所述抗微生物肽被鉴定为氨基酸SEQID NO.11。

80.根据实施例79所述的抗微生物肽，其由包含核酸序列的多核苷酸编码。

81.根据实施例80所述的多核苷酸，其与启动子连接以产生表达载体。

82.一种遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的根据实施例80所述的多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。

83.根据实施例72所述的抗微生物肽，其用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

84.根据实施例83所述的抗微生物肽，其用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

85.根据84所述的组合物，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物的局部施用物。

86.根据85所述的组合物，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

87.根据实施例72所述的抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的所述两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

88.根据实施例72所述的抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的所述两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。

89.根据实施例72所述的抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的所述两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

90.根据实施例74所述的抗微生物肽，其中来自每个所述两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

91.一种抗微生物肽，其包含通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的两个P11两亲性螺旋肽，被鉴定为氨基酸SEQ ID NO.11。

92.根据实施例91所述的抗微生物肽，其中所述P11两亲性螺旋肽均为来自柑橘类植物的内源P11两亲性螺旋肽。

93.根据实施例91所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

94.根据实施例93所述的抗微生物肽，其中所述接头结构域包含具有被鉴定为SEQID NO.23的氨基酸序列的GPGR-转角。

95.根据实施例91所述的抗微生物肽，其由包含核酸序列的多核苷酸编码。

96.根据实施例95所述的多核苷酸，其与启动子连接以产生表达载体。

97.一种遗传改变的植物或植物细胞，其包含与启动子可操作地连接的根据实施例95所述的多核苷酸，其中所述植物或植物细胞产生所述抗微生物肽。

98.根据实施例91所述的抗微生物肽，其用作被细菌病原体感染和/或有被细菌病原体感染风险的植物的治疗剂。

99.根据实施例98所述的抗微生物肽，其用作被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染和/或有被亚洲韧皮部杆菌属(CLas)感染风险的植物的治疗剂。

100.根据99所述的组合物，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的植物的局部施用物。

101.根据100所述的组合物，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

102.根据实施例91所述的抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的所述两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比杀菌作用增加。

103.根据实施例91所述的抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的所述两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比附着和/或插入细菌膜的效率增加。

104.根据实施例91所述的抗微生物肽，其中通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的所述两个P11两亲性螺旋肽与单个内源两亲性螺旋肽相比对细菌耐药性的敏感性较低。

105.根据实施例91所述的抗微生物肽，其中来自每个所述P11两亲性螺旋肽的至少一个疏水性氨基酸残基被半胱氨酸残基取代，在所述P11两亲性螺旋肽之间形成二硫键。

106.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.3。

107.根据实施例106所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

108.根据实施例107所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

109.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例108所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

110.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.4。

111.根据实施例110所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

112.根据实施例111所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

113.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例112所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

114.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.5。

115.根据实施例114所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

116.根据实施例115所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

117.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例116所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

118.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.6。

119.根据实施例118所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

120.根据实施例119所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

121.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，包括以下步骤：将根据实施例120所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

122.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.7。

123.根据实施例122所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

124.根据实施例123所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

125.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，包括以下步骤：将实施例124的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

126.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.8。

127.根据实施例126所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

128.根据实施例127所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

129.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，包括以下步骤：将根据实施例128所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

130.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，由所述第一两亲性螺旋肽和所述第二两亲性螺旋肽之间的至少一个二硫键稳定，所述抗微生物肽包含SEQ ID NO.9。

131.根据实施例130所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

132.根据实施例131所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

133.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例132所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

134.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.10。

135.根据实施例134所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

136.根据实施例135所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

137.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，包括以下步骤：将实施例136的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

138.一种抗微生物肽，其具有通过第一接头结构域和第二接头结构域偶联形成环状支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ IDNO.11。

139.根据实施例138所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

140.根据实施例139所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

141.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例140所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

142.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.12。

143.根据实施例142所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

144.根据实施例143所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

145.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，包括以下步骤：将实施例144的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

146.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.16。

147.根据实施例146所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

148.根据实施例147所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

149.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例148所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

150.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.17。

151.根据实施例150所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

152.根据实施例151所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

153.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例152所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

154.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.18。

155.根据实施例154所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

156.根据实施例155所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

157.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例156所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

158.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.20。

159.根据实施例158所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

160.根据实施例159所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

161.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，其包括以下步骤：将根据实施例160所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

162.一种抗微生物肽，其具有通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形的第一两亲性螺旋肽和第二两亲性螺旋肽，所述抗微生物肽包含氨基酸SEQ ID NO.22。

163.根据实施例162所述的抗微生物肽，其用作用于治疗和/或预防黄龙病(HLB)的治疗剂。

164.根据实施例163所述的抗微生物肽，其用作被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的局部治疗剂。

165.用于治疗被CLas感染和/或有被CLas感染风险的柑橘类植物的方法，包括以下步骤：将根据实施例164所述的组合物施用于被CLas感染和/或有被CLas感染风险的所述柑橘类植物。

166.一种预测抗微生物肽的相对杀菌活性的方法，其包括以下步骤：(a)鉴定两亲性螺旋肽；(b)产生基本上由两个所述两亲性螺旋肽组成的修饰的肽，所述两亲性螺旋肽通过接头结构域偶联形成螺旋-转角-螺旋支架构形；(c)确定脂质:水双层参数以产生模拟的细菌膜；(d)进行分子动力学(MD)模拟以确定所述两亲性螺旋肽和所述修饰的肽附着到所述模拟的细菌膜，或插入到所述模拟的细菌膜中，或在所述附着或插入之后保持它们的构型的相对效率；以及(e)比较所述两亲性螺旋肽和所述修饰的肽的相对杀菌活性。

167.根据实施例166所述的方法，其中所述鉴定第一两亲性螺旋肽的步骤包括鉴定对植物是内源性的两亲性螺旋肽的步骤。

168.根据实施例167所述的方法，其中所述鉴定对植物是内源性的两亲性螺旋肽的步骤包括鉴定对柑橘类植物是内源性的两亲性螺旋肽的步骤。

169.根据实施例166所述的方法，其中所述两亲性螺旋肽是二聚体。

170.根据实施例166所述的方法，其中所述接头结构域包含具有至少四个氨基酸的肽接头。

171.根据实施例170所述的方法，其中所述具有至少四个氨基酸的肽接头包含GPGR-转角。

172.根据实施例166所述的方法，其进一步包括施加GROMOS力场以监测所述两亲性螺旋肽和所述修饰的肽从所述水到所述脂质的附着的步骤。

173.根据实施例172所述的方法，其中所述确定脂质:水双层参数以产生模拟的细菌膜的步骤进一步包括确定选自由以下组成的群组中的多个参数之一的步骤：确定脂质核中水分子的数量；确定翻转到所述脂质核中的极性脂质头基团的数量；确定疏水核中的残基分数；以及确定螺旋内容。

174.根据实施例1至172中任一项，其中所述抗微生物肽对植物无植物毒性。

175.根据实施例1至174中任一项，其中所述抗微生物肽对哺乳动物无毒性。

176.根据实施例1至175中任一项，其中所述抗微生物肽对人无毒性。

177.一种螺旋-转角-螺旋(HTH)肽，其包含(a)第一螺旋结构域；(b)接头结构域；以及(c)第二螺旋结构域，其中所述第一螺旋结构域和/或第二螺旋结构域包含植物蛋白的抗微生物螺旋结构域，并且其中所述第一螺旋结构域和第二螺旋结构域通过所述接头结构域连接。

178.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述第一螺旋和第二螺旋各自由10-50、10-40、10-30、10-20或10-15个氨基酸组成。

179.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述第一螺旋和第二螺旋各自包含至少10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸。

180.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述第一螺旋和第二螺旋各自包含50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12个或更少个氨基酸。

181.根据实施例177至180中任一项所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和/或所述第二螺旋结构域是两亲性螺旋结构域。

182.根据实施例181所述的HTH肽，其中所述两亲性螺旋结构域包含交替的非极性氨基酸残基和带正电荷的氨基酸残基。

183.根据实施例181所述的HTH肽，其中所述两亲性螺旋结构域包含(X

184.根据实施例181所述的HTH肽，其中所述两亲性螺旋结构域包含(X

185.根据实施例183或184所述的HTH肽，其中所述非极性氨基酸残基选自由以下组成的群组：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和异亮氨酸(I)。

186.根据实施例185所述的HTH肽，其中所述非极性氨基酸残基选自由以下组成的群组：A、L和I。

187.根据实施例186所述的HTH肽，其中所述非极性氨基酸选自由以下组成的群组：L和I。

188.根据实施例182至187中任一项所述的HTH肽，其中所述带正电荷的氨基酸残基选自赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)。

189.根据实施例188所述的HTH肽，其中所述带正电荷的氨基酸残基选自K和R。

190.根据实施例177至189中任一项所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和/或第二螺旋结构域各自包含由0-3个氨基酸残基组成的氨基酸序列，所述氨基酸残基选自由以下组成的群组：极性不带电荷的残基、带负电荷的残基和非极性芳族残基。

191.根据实施例190所述的HTH肽，其中极性不带电荷的残基选自由以下组成的群组：丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)。

192.根据实施例190所述的HTH肽，其中所述带负电荷的残基选自由以下组成的群组：天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。

193.根据实施例190所述的HTH肽，其中所述非极性芳族残基选自由以下组成的群组：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。

194.根据实施例177至193中任一项所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和所述第二螺旋结构域相同。

195.根据实施例177至193中任一项所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和第二螺旋结构域不同。

196.根据实施例195所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和第二螺旋结构域相差1-4个氨基酸残基。

197.根据实施例177至193中任一项所述的HTH肽，其中所述第二螺旋结构域由与第一螺旋结构域的所述氨基酸序列相反的氨基酸序列组成。

198.根据实施例177至197中任一项所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和所述第二螺旋结构域的长度相同。

199.根据实施例177至197中任一项所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和所述第二螺旋结构域的长度不同。

200.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域包含下式：X

201.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述第二螺旋结构域包含下式：X

202.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和/或所述第二螺旋结构域包含下式：X

203.根据实施例177至202中任一项所述的HTH肽，其中所述接头包含2-15、2-12、3-9、3-6、4-12或4-8个氨基酸残基。

204.根据实施例177至203中任一项所述的HTH肽，其中所述接头包含至少2、3、4或5个氨基酸残基。

205.根据实施例177至204中任一项所述的HTH肽，其中所述接头包含15、14、13、12、11、10、9、8、7或6个或更少个氨基酸残基。

206.根据实施例177至205中任一项所述的HTH肽，其中所述接头包含40-80％不带电荷的氨基酸残基。

207.根据实施例177至206中任一项所述的HTH肽，其中所述接头包含10-60％带正电荷的氨基酸残基。

208.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述第一螺旋结构域和/或所述第二螺旋结构域各自独立地包含带正电荷的氨基酸残基和非极性氨基酸残基的混合物。

209.根据实施例208所述的HTH肽，其中带正电荷的氨基酸残基与非极性氨基酸残基的比率为0.7:1、0.75:1、0.8:1、0.9:1或1:1。

210.根据实施例177至209中任一项所述的HTH肽，其进一步包含第二接头。

211.根据实施例177至210中任一项所述的HTH肽，其中所述HTH肽包含一个或多个附加的螺旋结构域。

212.根据实施例177所述的HTH肽，其中所述HTH肽包含选自SEQ ID No:3-12、16-18、20-22和28-37的氨基酸序列。

213.根据实施例177至212中任一项所述的HTH肽，其中所述接头包含SEQ ID NO:23或38的氨基酸序列。

214.根据实施例177至213中任一项所述的HTH肽用于预防或治疗植物中病原性感染的用途。

215.根据实施例214所述的用途，其中所述病原性感染是微生物感染。

216.根据实施例215所述的用途，其中所述微生物感染是细菌感染。

217.根据实施例216所述的用途，其中所述细菌感染由革兰氏阴性菌引起。

218.根据实施例217所述的用途，其中所述革兰氏阴性菌是木质部难养菌。

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以下参考文献以其整体并入本说明书中：

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表

表1图例：asmA：在LPS生物发生和外膜蛋白组织中编码内膜蛋白，其可能有助于抗微生物肽(AMP)的进入。waaP/rfaP：编码一种激酶，所述激酶磷酸化大肠杆菌LPS内核中的庚糖I。asmA：编码内膜蛋白，并参与外膜孔蛋白OmpF的组织。rsxC：编码一种还原酶，所述还原酶可还原和失活；转录因子SoxR仅在氧化状态下具有活性，并且它开启了超氧化物诱导的基因(诸如sodA和micF)的转录激活因子，以及一系列增加大肠杆菌对AMP敏感性的基因。yejM：编码将带负电荷的磷脂酰乙醇胺从内膜转移到外膜的内膜硫酸酯酶/磷酸酶。malD：编码与(MlaE-MlaF-MlaB)二聚体复合的内膜六聚体MlaD；MlaC将磷脂从外层成员转运至MlaEFBD复合物；磷脂随后成为内膜的一部分。nrdAB：编码核糖核苷酸还原酶A和B；对nrdB操作子的抑制由nrdA的更高激活来补偿。LeuO：编码LeuO，其通过与其启动子结合直接抑制carRS，导致almEFG表达减少，从而减少脂质A甘氨酰化(glycinylation)并增加对AMP的敏感性。

表2图例：rsxC&mlaD：参见以上表1的图例。entS/ybdA：编码一种参与肠杆菌素转运的内膜蛋白。flaC样基因：编码丝状外膜血凝素。pldA：编码一种外膜磷脂酶。gltP：编码具有10个跨膜螺旋的内膜谷氨酸/天冬氨酸转运体。yjcO：编码一种分泌型富含螺旋的螺线管蛋白。wcaK：编码荚膜异多糖酸(colanic acid)合成途径中的丙酮酸转移酶。wzxC：编码内膜结肠酸(colonic acid)转运蛋白。clbR：编码colibactin(一种遗传毒性药剂)合成的调节因子。clbB：编码colibactin合成基因。

表6：HTH肽对大肠杆菌的最小抑制浓度(MIC)

表7.11P-1和相应的HTH 26P-1对3种基因组序列已公布的不同大肠杆菌菌株(K12、BL21和ATCC)的MIC值(μM)

表8.序列

表9–易感和抗性植物和人类革兰氏阴性菌的26P和28P序列变体的MIC值

表10-赋予宿主两亲性单螺旋耐药性的大肠杆菌BL21和ATCC 25922中的基因和基因间突变

表11–所选HTH肽对木质部难养菌PD菌株的MIC值

SEQUENCE LISTING

<110> 因内特免疫有限公司

美国农业部

<120> 用于治疗植物中病原性感染的组合物和方法

<130> P21113414WP

<140> PCT/US2019/054131

<141> 2019-10-01

<150> US 16/148,848

<151> 2018-10-01

<160> 38

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柑橘

<400> 1

Leu Ile Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柑橘

<400> 2

Leu Ile Arg Leu Ile Arg Arg Ile Leu Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的11P

<400> 3

Leu Ile Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Lys Gly Pro Gly Arg Lys

1 5 10 15

Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu

20 25

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的11P

<400> 4

Leu Ile Arg Leu Ile Arg Arg Ile Leu Arg Arg Gly Pro Gly Arg Arg

1 5 10 15

Arg Leu Ile Arg Arg Ile Leu Arg Ile Leu

20 25

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的11P

<400> 5

Leu Ile Arg Leu Leu Arg Arg Ile Leu Arg Arg Gly Pro Gly Arg Arg

1 5 10 15

Arg Leu Ile Arg Arg Leu Leu Arg Ile Leu

20 25

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的11P

<400> 6

Leu Ile Arg Leu Leu Arg Glu Ile Leu Arg Arg Gly Pro Gly Arg Glu

1 5 10 15

Arg Leu Ile Arg Arg Leu Leu Arg Ile Leu

20 25

<210> 7

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的11P

<400> 7

Leu Ile Arg Leu Ile Leu Arg Ile Leu Arg Arg Gly Pro Gly Arg Arg

1 5 10 15

Arg Leu Ile Arg Leu Ile Leu Arg Ile Leu

20 25

<210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的11P

<400> 8

Leu Ile Arg Leu Ile Ser Arg Ile Leu Arg Arg Gly Pro Gly Arg Arg

1 5 10 15

Arg Leu Ile Arg Ser Ile Leu Arg Ile Leu

20 25

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的半胱氨酸修饰的11P

<400> 9

Leu Ile Lys Leu Cys Lys Lys Ile Leu Lys Lys Gly Pro Gly Arg Lys

1 5 10 15

Lys Leu Ile Lys Lys Cys Leu Lys Ile Leu

20 25

<210> 10

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘和葡萄Himrod的修饰的11P

<400> 10

Leu Ile Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Lys Gly Pro Gly Arg Lys

1 5 10 15

Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu Gly Pro Gly Arg

20 25 30

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 环状P30-来自柑橘和葡萄Himrod的修饰的11P

<400> 11

Gly Arg Leu Ile Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Arg Lys Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu Gly Pro

20 25 30

<210> 12

<211> 41

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘和葡萄Himrod的修饰的11P

<400> 12

Lys Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu Gly Pro Gly Arg Lys

1 5 10 15

Lys Leu Ile Lys Glu Ile Leu Lys Ile Leu Gly Pro Gly Arg Lys Lys

20 25 30

Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu

35 40

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柑橘

<400> 13

Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柑橘

<400> 14

Lys Arg Leu Val Gln Arg Leu Lys Asp Phe Leu Arg

1 5 10

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柑橘

<400> 15

Lys Arg Leu Ile Gln Arg Lys Arg Leu Ile Gln Arg

1 5 10

<210> 16

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘和葡萄Himrod的修饰的12P

<400> 16

Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg

20 25

<210> 17

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的12P

<400> 17

Lys Arg Leu Val Gln Arg Leu Lys Asp Phe Leu Arg Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Lys Arg Leu Val Gln Arg Leu Lys Asp Phe Leu Arg

20 25

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的12P

<400> 18

Lys Arg Leu Ile Gln Arg Lys Arg Leu Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Lys Arg Leu Ile Gln Arg Lys Arg Leu Ile Gln Arg

20 25

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柑橘

<400> 19

Leu Tyr Lys Lys Leu Ser Lys Lys Leu Leu

1 5 10

<210> 20

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的10P

<400> 20

Leu Tyr Lys Lys Leu Ser Lys Lys Leu Leu Gly Pro Gly Arg Leu Tyr

1 5 10 15

Lys Lys Leu Ser Lys Lys Leu Leu

20

<210> 21

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 柑橘

<400> 21

Ala Leu Tyr Leu Lys Asp Phe Lys Ser Ser Lys Ser Leu Asp Val Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Asp Leu Lys His Leu Lys Arg Leu

20 25

<210> 22

<211> 58

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来自柑橘的修饰的27P

<400> 22

Ala Leu Tyr Leu Lys Asp Phe Lys Ser Ser Lys Ser Leu Asp Val Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Asp Leu Lys His Leu Lys Arg Leu Gly Pro Gly Arg Ala

20 25 30

Leu Tyr Leu Lys Asp Phe Lys Ser Ser Lys Ser Leu Asp Val Ser Ala

35 40 45

Leu Ala Asp Leu Lys His Leu Lys Arg Leu

50 55

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GPGR-转角

<400> 23

Gly Pro Gly Arg

1

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 葡萄himrod

<400> 24

Lys Lys Leu Ala Lys Glu Ile Leu Lys Ala Leu

1 5 10

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 葡萄himrod

<400> 25

Lys Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu

1 5 10

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 葡萄himrod

<400> 26

Arg Arg Leu Ile Arg Arg Ile Leu Arg Ile Leu

1 5 10

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 葡萄himrod

<400> 27

Arg Arg Leu Ile Arg Arg Ile Leu Arg Ile Leu

1 5 10

<210> 28

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 28

Leu Leu Ile Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Lys Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Lys Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu Leu

20 25

<210> 29

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 29

Lys Leu Ile Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Lys Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Lys Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu Lys

20 25

<210> 30

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 30

Lys Leu Ile Arg Leu Ile Arg Glu Ile Leu Arg Arg Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Arg Arg Leu Ile Arg Glu Ile Leu Arg Ile Leu Lys

20 25

<210> 31

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 31

Lys Glu Ile Val Arg Arg Ile Lys Glu Phe Leu Arg Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Lys Glu Ile Val Arg Arg Ile Lys Glu Phe Leu Arg

20 25

<210> 32

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 32

Lys Glu Ile Val Arg Arg Ile Glu Lys Phe Leu Arg Gly Pro Gly Arg

1 5 10 15

Lys Arg Ile Val Glu Arg Ile Glu Lys Phe Leu Arg

20 25

<210> 33

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 33

His Pro Leu Ile Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Lys Gly Pro Gly

1 5 10 15

Arg Lys Lys Leu Ile Lys Lys Ile Leu Lys Ile Leu Gly His

20 25 30

<210> 34

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 34

Glu Leu Leu Arg Arg Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg His Asp Leu Leu

1 5 10 15

Arg Gly Pro Gly Arg Glu Leu Leu Arg Leu Leu Ala Ser Leu Arg Arg

20 25 30

His Asp Leu Leu Arg

35

<210> 35

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 35

Glu Ala Leu Arg Ser Arg Leu Glu Lys Arg Ile Tyr Ile Leu Tyr Arg

1 5 10 15

Asp Thr Pro Val Val Lys Ser Ser Ser Arg Gln Arg Glu Glu Leu Leu

20 25 30

Arg Ile Ser Leu Arg Glu Leu Glu

35 40

<210> 36

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 36

Arg Leu Leu Glu Lys Arg Leu Arg Arg Glu Leu Glu Arg Glu Leu Arg

1 5 10 15

Lys Gln Gly Pro Gly Arg Arg Leu Leu Glu Lys Arg Leu Arg Arg Glu

20 25 30

Leu Glu Arg Glu Leu Arg Lys Gln

35 40

<210> 37

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 由葡萄himrod肽修饰的

<400> 37

Arg Lys Gln Leu Arg Glu Leu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Arg Ile Arg

1 5 10 15

Lys Leu Gly Pro Gly Arg Arg Glu Gln Leu Glu Arg Leu Ile Glu Arg

20 25 30

Leu Glu Arg Leu Ile Glu Lys Arg

35 40

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 接头

<400> 38

Arg Asp Thr Pro Val Val Lys Ser

1 5