干燥的生物组合物以及其方法

技术领域

本公开内容一般地涉及具有高菌落形成单位的干燥且稳定的生物组合物，及其制备方法和使用方法。

背景技术

掺入有益病毒、细菌、酵母和真菌以靶向某些昆虫或植物物种的微生物杀虫剂、除草剂、杀真菌剂和生长促进剂由于其对非靶向物种和环境的影响较小而在农业领域受到越来越多的关注。然而，保持这些产品的存活能力通常是储存和配制物加工期间的挑战。当前，微生物杀虫剂产品可以液体或干燥的配制物来制备。液体配制物通常包括这些微生物在水、油或乳液中的悬浮体，以保持活力和功效。然而，这些液体配制物需要在较低温度下储存和运输，这常常是麻烦的并且不具有成本效益。另一方面，干配制物通常包括将微生物配制成可湿性粉末、颗粒、丸粒、包衣(coating)或结晶形式，以便于储存和运输。然而，为了配制成干燥形式以便于处理，这些微生物由于配制过程中的干燥热而遭受细胞死亡和稳定性问题。

美国专利第8,409,822号(Trevino等人)公开并要求保护用于递送干燥模式的微生物的组合物，其包含具有多孔结构的沉淀二氧化硅颗粒和负载在整个沉淀二氧化硅颗粒的孔隙中的微生物，其中该组合物是可操作的，以允许所述微生物在沉淀二氧化硅颗粒的孔隙中的繁殖。还有，美国专利第9,296,989号(Trevino等人)公开并要求保护用于递送干燥模式的活细胞的组合物，其包含具有孔隙的惰性载体基底、负载在惰性载体基底的孔隙内的活细胞、以及设置在负载有活细胞的惰性载体基底的外表面上的表面层，其中所述表面层对有助于活细胞的细胞生长的分子是可渗透的，使得与另外没有所述表面层的组合物相比，所述组合物是可操作的，以允许所述活细胞在惰性载体基质中有增加的繁殖。虽然Trevino等人的组合物公开为“干燥模式”，但它们实际上并未干燥，因为包含活微生物的液体被公开为基本上负载到沉淀二氧化硅颗粒孔隙中。Trevino等人的二氧化硅用作吸收剂，并负载有25-75％的活微生物。在此负载水平下，负载的二氧化硅被定义为触感干燥的自由流动。这些组合物的使用相对受限，因为没有优化生物体的浓度和二氧化硅中的水含量，并且由于生物仍可以呼吸，因此很可能导致活性快速丧失。

各种保护剂，例如亚砜、醇、单糖、多糖、氨基酸、肽、糖蛋白和其他添加剂已用于保护微生物免受脱水损害。美国专利第5,360,607号(Eyal等人)公开并要求保护的改进的、稳定的、干燥的、造粒的生物杀虫剂组合物，其包含能够支持真菌生长和促进分生孢子的孢子形成的惰性载体，和通过真菌玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroeus)分离物的深层发酵而制备的昆虫体寄生的真菌生物质。然而，该方法使用藻酸盐来包胶天然丸粒，这易受变化的影响，尤其是易受微生物赖以生存和呼吸的水分含量(例如水分活度(A

本领域中仍存在以高浓度制备干燥稳定形式的微生物的尚未满足的需求。

发明内容

本发明人惊奇地发现，可以在特定温度下配制微生物例如霉菌孢子和细菌并将其干燥到各种基底的表面上，以提供具有改善的存活能力和大于现有技术的浓度或菌落形成单位(“CFU”)的干燥的生物组合物。为了达到这些干燥的生物组合物(浓缩的干燥生物组合物)的期望的CFU水平，本发明定义了几个相互关联的参数，以便在不牺牲存活能力的情况下为待沉积的微生物创造最佳的环境。首先，从一组多孔颗粒，例如，BET表面积在10和400m

因此，在第一方面，本发明提供了干燥的生物组合物(组合物I)，该干燥的生物组合物包含以下组分，在特定的实施方案中基本上由以下组分组成，并且在另一特定实施方案中由以下组分组成：(i)基底和(ii)负载到所述基底的表面上的微生物，其中该组合物具有约0.01重量％至约15重量％的总水分含量。令人惊奇地发现，可以使微生物在由所得表面水分活度水平驱动的休眠状态下在某些基底上以高浓度和良好的存活能力存活。优选地，在第一方面中，本发明提供如下的组合物I：

1.1组合物I，其中该组合物具有约0.01重量％至约8重量％的总水分含量；

1.2组合物I或1.1，其中该组合物具有约3重量％至约8重量％，优选约5重量％至约8重量％，仍优选选自3重量％、5重量％和7重量％的总水分含量；

1.3组合物I，或者1.1或1.2，其中该组合物具有在约0.01和约0.6之间，优选在约0.2和约0.6之间，仍优选在约0.3和约0.5之间的水分活度值(A

1.4组合物I，或者1.1-1.3中任一种，其中该组合物具有大于约10

1.5组合物I，或者1.1-1.4中任一种，其中基底选自二氧化硅(例如沉淀二氧化硅，在特定的实施方案中，为亲水性二氧化硅，例如

1.6组合物I，或者1.1-1.5中的任一种，其中基底是二氧化硅；

1.7组合物I，或者1.1-1.6中的任一种，其中基底是沉淀二氧化硅；

1.8组合物I，或者1.1-1.7中的任一种，其中基底是亲水性二氧化硅，例如

1.9组合物I，或者1.1-1.5中的任一种，其中基底是水不溶性天然纤维材料例如纤维素；

1.10组合物I，或者1.1-1.5中的任一种，其中基底是硅藻土；

1.11组合物I，或者1.1-1.5中的任一种，其中基底是硅胶；

1.12组合物I，或者1.1-1.5中的任一种，其中基底是硅酸盐(例如，铝硅酸盐例如

1.13组合物I，或者1.1-1.13中的任一种，其中基底的粒径(d50)为约5-200微米，优选地约8-160微米，仍优选地约9-150微米，仍优选地约50-150微米，仍优选地约50-130微米，仍优选地选自约50微米、约85微米和约120微米；

1.14组合物I，或者1.1-1.14中的任一种，其中基底的BET表面积为约2-400m

1.15组合物I，或者1.1-1.14中的任一种，其中基底的BET表面积为2m

1.16组合物I，或者1.1-1.14中的任一种，其中基底的BET表面积为180m

1.17组合物I，或者1.1-1.16中的任一种，其中基底的孔隙体积为约0.01-1.20cc/g，优选地约0.05-1.20cc/g，仍优选地约0.10-1.0cc/g，仍优选地约0.20-0.95cc/g；

1.18组合物I，或者1.1-1.17中的任一种，其中所述组合物包含BET表面积为约50-200m

1.19组合物I，或者1.1-1.18中的任一种，其中所述组合物包含BET表面积为约50-200m

1.20组合物I，或者1.1-1.19中的任一种，其中最终微生物浓度在总组合物的约4和约40重量％之间，优选地约4和约20重量％之间。

1.21组合物I，或者1.1-1.20中的任一种，其中所述微生物选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QST713、巴氏杆菌(Pasteuria usgae)；球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、盾壳霉(Coniothyrium minitans)、银叶菌(Chondrostereum purpureum)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、汤氏多毛菌(Hirsutella thompsonii)、玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)、棒束孢霉(Isaria sp.)、长孢蜡蚧菌(Lecanicilliumlongisporum)、蝇蚧疥霉(Lecanicilliummuscarium)、蜡蚧菌(Lecanicillium sp.)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.acridum)、莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)、虫生簇孢霉(Sporothrix insectorum)；苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella GV)；棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、大链壶菌(Lagenidiumgiganteum)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、菌根菌(Mycorrhiza)、粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)或者其任意组合，优选选自苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌、慢生根瘤菌、菌根菌、粉红粘帚霉以及其任意组合。

1.22组合物I，或者1.1-1.21中的任一种，其中微生物是粉红粘帚霉，在另一实施方案中是荧光假单胞菌；

1.23组合物I，或者1.1-1.22中的任一种，其进一步包含一种或多种赋形剂，在特定的实施方案中，包含一种或多种农业化学上可接受的赋形剂；

1.24组合物1.22，其为片剂形式、可流动浓缩物形式，例如用于种子处理，或者为油分散体形式；

1.25组合物I，或者1.1-1.24中的任一种，其中所述组合物不需要外源性保护剂例如藻酸盐包胶；

1.26组合物I，或者1.1-1.25中的任一种，其中所述组合物进一步包含选自聚乙烯醇、黄原胶、阿拉伯胶、其他多糖如麦芽糊精、瓜尔胶(例如羟丙基瓜尔胶)和聚乙二醇的聚合物；

1.27组合物I，或者1.1-1.26中的任一种，其中所述组合物进一步包含作为外层的第二基底；

1.28组合物1.27，其中第二基底选自沉淀二氧化硅，例如

1.29组合物I，或者1.1-1.28中的任一种，其中在室温下储存120天后，每克组合物的菌落形成单位(CFU/g)数值仍保持高于约10

1.30组合物I，或者1.1-1.29中的任一种，其中在40℃下储存40天后，每克组合物的菌落形成单位(CFU/g)数值仍保持高于约10

1.31组合物I，或者1.1-1.30中的任一种，其中在65％或更低的相对湿度下储存40天后，每克组合物的菌落形成单位(CFU/g)数值仍保持高于约10

1.32组合物I，或者1.1-1.31中的任一种，其中所述组合物的夯实密度大于纯基底材料的夯实密度的150％；

1.33组合物I，或者1.1-1.32中的任一种，其中所述微生物大于基底的孔径，或者所述微生物被负载到基底的表面上；

1.34组合物I，或者1.1-1.24或1.27-1.33中的任一种，其中所述组合物进一步包含(i)选自聚乙烯醇、黄原胶、阿拉伯胶或其他多糖例如麦芽糊精、瓜尔胶(例如羟丙基瓜尔胶)、聚乙二醇和聚甘油的聚合物；或(ii)非还原性二糖例如海藻糖或蔗糖，或(iii)脱脂牛奶或二甲基亚砜；

1.35组合物I，或者1.1-1.24或1.27-1.33中的任一种，其中所述组合物进一步包含非还原性二糖例如海藻糖或蔗糖；

1.36组合物I，或者1.1-1.24或1.27-1.33中的任一种，其中所述组合物进一步包含聚合物例如聚甘油，特别是超支化的聚甘油聚合物；

1.37组合物I，或者1.1-1.36中的任一种，其中所述第二基底是细分的疏水性或亲水性颗粒，其中这种颗粒是表面处理过的，例如用硅烷或硅油表面处理过的，以改善样品的润湿性或样品吸收水的趋势；

1.38组合物I，或者1.1-1.37中的任一种，其中所述第二基底是二氧化硅或粘土，其中这种二氧化硅或粘土是表面处理过的，例如用硅烷或硅油表面处理过的，以改善样品的润湿性或样品吸收水的趋势；

1.39组合物I，或者1.1-1.38中的任一种，其中所述第二基底具有高BET表面积，例如50至750m

1.40组合物I，或者1.1-1.39中的任一种，其中所述第二基底是疏水性二氧化硅；

1.41组合物I，或者1.1-1.40中的任一种，其中所述第二基底是沉淀二氧化硅；

1.42组合物I，或者1.1-1.41中的任一种，其中所述第二基底是具有高BET表面积的沉淀二氧化硅，例如50至750m

1.43组合物I，或者1.1-1.42中的任一种，其中所述第二基底是

1.44组合物I，或者1.1-1.40中的任一种，其中所述第二基底是气相二氧化硅；

1.45组合物I，或者1.1-1.44中的任一种，其中所述第二基底是气相二氧化硅；

1.46组合物I，或者1.1-1.44中的任一种，其中所述第二基底是疏水性气相二氧化硅；

1.47组合物I，或者1.1-1.44中的任一种，其中所述第二基底是BET表面积为180至220m

1.48组合物I，或者1.1-1.6，1.13、1.17或1.20-1.47中的任一种，其中主要基底是BET表面积为400-600m

1.49组合物1.48，其中所述二氧化硅具有大于1cc/g，优选1.4cc/g的按照Barrett-Joyner-Halenda模型的孔隙体积，或者大于2cc/g，优选2.2的按照汞孔隙体积(Mercury Pore Volume)的孔隙体积；

1.50组合物1.49，其中二氧化硅是

在第二方面，本发明提供了制备干燥的生物组合物的方法，该干燥的生物组合物包含基底和负载在所述基底上的微生物，在特定的实施方案中，该干燥的生物组合物基本上由基底和负载在所述基底上的微生物组成，并且在另一特定实施方案中由基底和负载在所述基底上的微生物组成，其中该组合物具有约0.01重量％至约15重量％的水分含量，该方法包括以下步骤，在特定的实施方案中，该方法基本上由以下步骤组成，并且在另一特定实施方案中由以下步骤组成：(1)将含有微生物的混合物、溶液或悬浮体与基底混合；(2)干燥基底-微生物混合物以达到约0.01重量％至约15重量％的总水分含量(方法I)。优选地，本发明提供如下的方法I：

2.1方法I，其中通过机械研磨或抛光种子的表面(步骤(a))而得到包含微生物、优选包含真菌孢子和种子的某些部分的细级分，从而从种子的表面收获微生物。优选地，细级分中微生物的收率大于10

2.2方法2.1，其中步骤(a)包括用磨石研磨，以将种子从细级分中分离出来；

2.3方法2.1，其中步骤(a)包括在压力条件下，用在长眼筛(slotted screen)的封闭管内的旋转轴进行研磨，随后用筛分机和过滤器将种子与细级分分离；

2.4方法I或2.1-2.3中的任一种，其中细级分的筛分步骤(b)包括用20-800μm，优选为100μm至300μm的筛目尺寸进行筛分；

2.5方法I，其中所述微生物是通过用水洗去它们并分离种子和液体微生物溶液或悬浮体而从种子的表面收获的。优选地，将种子在水中搅拌1-20分钟。仍优选地，在加压吸滤器中进行固液分离，仍优选地，在加压吸滤器中使用1-3mm的筛目尺寸。仍优选地，加压吸滤器中的脱水时间为20-200秒。仍优选地，吸滤器中的过滤压力为1-3巴。仍优选地，通过在离心场中从液体中分离微生物来浓缩微生物溶液或悬浮体。仍优选地，浓缩步骤包括在盘叠分离器中进行分离。仍优选地，重复浓缩步骤，用水稀释浓缩物，然后在离心场中进行第二次浓缩以从微生物中分离出可溶部分；

2.6方法I，或2.1-2.5中的任一种，其中步骤(2)将基底-微生物混合物干燥至约0.01重量％至约15重量％，优选约0.01重量％至约8重量％，仍优选约3重量％至约8重量％，仍优选约5重量％至约8重量％，仍优选选自3重量％、5重量％和7重量％的总水分含量；

2.7方法I，或2.1-2.6中的任一种，其中干燥步骤(2)包括流化床干燥基底-微生物混合物；

2.8方法I，或2.1-2.6中的任一种，其中干燥步骤(2)包括喷雾干燥基底-微生物混合物；

2.9方法I，或2.1-2.6中的任一种，其中干燥步骤(2)包括接触干燥基底-微生物混合物；

2.10方法I，或2.1-2.6中的任一种，其中干燥步骤(2)包括冷冻干燥基底-微生物混合物；

2.11方法I，或2.1-2.10中的任一种，其中干燥空气的温度小于或等于约130℃，优选小于或等于约90℃，仍优选小于或等于约80℃，仍优选小于或等于约50℃，仍优选在约30-50℃下，仍优选在约40-50℃下，仍优选在约40-45℃下，仍优选在约43℃下；

2.12方法I，或2.1-2.11中的任一种，其中粉末床保持在小于或等于约35℃，优选小于或等于约30℃，仍优选在约25℃和35℃之间；

2.13方法I，或2.1-2.7中的任一种，其中喷雾率为约2mL/g基底；

2.14方法I，或2.1-2.13中的任一种，其中所得组合物具有在约0.01和约0.6之间，优选在约0.2和约0.6之间，仍优选在约0.3和约0.5之间的水分活度值(A

2.15方法I，或2.1-2.14中的任一种，其中所得组合物具有的每克组合物的微生物的菌落形成单位(CFU/g)例如大于10

2.16方法I，或2.1-2.15中的任一种，其中基底选自二氧化硅(例如沉淀二氧化硅，在特定的实施方案中，为亲水性二氧化硅，例如

2.17方法I，或2.1-2.16中的任一种，其中基底是二氧化硅；

2.18方法I，或2.1-2.17中的任一种，其中基底是沉淀二氧化硅；

2.19方法I，或2.1-2.18中的任一种，其中基底是亲水性二氧化硅，例如

2.20方法I，或2.1-2.16中的任一种，其中基底是水不溶性天然纤维材料例如纤维素；

2.21方法I，或2.1-2.16中的任一种，其中基底是硅藻土；

2.22方法I，或2.1-2.16中的任一种，其中基底是硅胶；

2.23方法I，或2.1-2.16中的任一种，其中基底是硅酸盐(例如，铝硅酸盐例如

2.24方法I，或2.1-2.23中的任一种，其中基底的粒径(d50)为约5-200微米，优选地约8-160微米，仍优选地约9-150微米，仍优选地约50-150微米，仍优选地约50-130微米，仍优选地选自约50微米、约85微米和约120微米；

2.25方法I，或2.1-2.24中的任一种，其中基底的BET表面积为约2-400m

2.26方法I，或2.1-2.25中的任一种，其中基底的BET表面积为2m

2.27方法I，或2.1-2.25中的任一种，其中基底的BET表面积为180m

2.28方法I，或2.1-2.27中的任一种，其中基底的孔隙体积为约0.01-1.20cc/g，优选地约0.05-1.20cc/g，仍优选地约0.10-1.0cc/g，仍优选地约0.20-0.95cc/g；

2.29方法I，或2.1-2.28中的任一种，其中所述组合物包含BET表面积为约50-200m

2.30方法I，或2.1-2.29中的任一种，其中所述组合物包含BET表面积为约50-200m

2.31方法I，或2.1-2.30中的任一种，其中步骤(1)包括在总组合物的约4重量％和约40重量％之间，优选地约4重量％和约20重量％之间的负载；

2.32方法I，或2.1-2.31中的任一种，其中步骤(1)进一步包括添加选自以下的聚合物：聚乙烯醇、黄原胶、阿拉伯胶和其他多糖例如麦芽糊精、瓜尔胶(例如羟丙基瓜尔胶)和聚乙二醇；

2.33方法I，或2.1-2.32中的任一种，其中步骤(1)进一步包括作为外层的第二基底；

2.34方法2.33，其中第二基底选自沉淀二氧化硅，例如

2.35方法I，或2.1-2.34中的任一种，其中所述微生物选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)QST713、巴氏杆菌(Pasteuria usgae)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、盾壳霉(Coniothyrium minitans)、银叶菌(Chondrostereum purpureum)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、汤氏多毛菌(Hirsutella thompsonii)、玫烟色棒束孢(Isaria fumosorosea)、棒束孢霉(Isaria sp.)、长孢蜡蚧菌(Lecanicilliumlongisporum)、蝇蚧疥霉(Lecanicillium muscarium)、蜡蚧菌(Lecanicillium sp.)、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.acridum)、莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)、虫生簇孢霉(Sporothrix insectorum)、苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella GV)；棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、大链壶菌(Lagenidiumgiganteum)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、菌根菌(Mycorrhiza)、粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)或者其任意组合；

2.36方法I，或2.1-2.34中的任一种，其中所述微生物选自苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌、慢生根瘤菌、菌根菌、粉红粘帚霉；

2.37方法I，或2.1-2.34中的任一种，其中所述微生物是粉红粘帚霉；

2.38方法I，或2.1-2.34中的任一种，其中所得组合物不需要外源性保护剂例如藻酸盐包胶；

2.39方法I，或2.1-2.38中的任一种，其中在室温下储存120天后，每克组合物的菌落形成单位(CFU/g)数值仍保持高于10

2.40方法I，或2.1-2.39中的任一种，其中在40℃下储存40天后，每克组合物的菌落形成单位(CFU/g)数值仍保持高于10

2.41方法I，或2.1-2.40中的任一种，其中在65％或更低相对湿度下储存40天后，每克组合物的菌落形成单位(CFU/g)数值保持高于10

2.42方法I，或2.1-2.41中的任一种，其中所述组合物的夯实密度大于纯基底材料的夯实密度的150％；

2.43方法I，或者2.1-2.31或2.33-2.37或2.39-2.42中的任一种，其中所述组合物进一步包含(i)选自聚乙烯醇、黄原胶、阿拉伯胶或其他多糖例如麦芽糊精、瓜尔胶(例如羟丙基瓜尔胶)、聚乙二醇和聚甘油的聚合物；或(ii)非还原性二糖例如海藻糖或蔗糖，或(iii)脱脂牛奶或二甲基亚砜；

2.44方法I，或者2.1-2.31或2.33-2.37或2.39-2.42中的任一种，其中所述组合物进一步包含非还原性二糖例如海藻糖或蔗糖；

2.45方法I，或者2.1-2.31或2.33-2.37或2.39-2.42中的任一种，其中所述组合物进一步包含聚合物例如聚甘油，特别是超支化的聚甘油聚合物；

2.46方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.45中的任一种，其中所述第二基底是细分的疏水性或亲水性颗粒，其中这种颗粒是表面处理过的，例如用硅烷或硅油表面处理过的，以改善样品的润湿性或样品吸收水的趋势；

2.47方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.45中的任一种，其中所述第二基底是二氧化硅或粘土，其中这种二氧化硅或粘土是表面处理过的，例如用硅烷或硅油表面处理过的，以改善样品的润湿性或样品吸收水的趋势；

2.48方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.45中的任一种，其中所述第二基底具有高BET表面积，例如50-750m

2.49方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.48中的任一种，其中所述第二基底是疏水性二氧化硅；

2.50方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.49中的任一种，其中所述第二基底是沉淀二氧化硅；

2.51方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.50中的任一种，其中所述第二基底是具有高BET表面积的沉淀二氧化硅，例如50-750m

2.52方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.50中的任一种，其中所述第二基底是

2.53方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.45中的任一种，其中所述第二基底是BET表面积为180-220m

2.54方法I，或者2.1-2.33或2.35-2.45中的任一种，其中所述第二基底是

2.55方法I，或者2.1-2.18、2.24、2.28、2.31-2.54中的任一种，其中主要基底的BET表面积为400-600m

2.56方法2.55，其中所述基底具有大于1cc/g，优选1.4cc/g的按照Barrett-Joyner-Halenda模型的孔隙体积，或者大于2cc/g，优选2.2的按照汞孔隙体积的孔隙体积；

2.57方法I，或者2.33-2.56中的任一种，其中在所述干燥步骤(2)之前将第二基底添加到微生物悬浮体中；

2.58方法I，或者2.33-2.56中的任一种，其中在所述干燥步骤(2)期间将第二基底添加到微生物悬浮体中；

2.59方法I，或者2.33-2.56中的任一种，其中在所述干燥步骤(2)之后将第二基底添加到微生物悬浮体中；

2.60方法I，或者2.32-2.59中的任一种，其中在所述干燥步骤(2)之前将聚合物或多糖或非还原性二糖添加到微生物悬浮体中；

2.61方法I，或者2.32-2.59中的任一种，其中在所述干燥步骤(2)期间将聚合物或多糖或非还原性二糖添加到微生物悬浮体中；

2.62方法I，或者2.32-2.59中的任一种，其中在所述干燥步骤(2)之后将聚合物或多糖或非还原性二糖添加到微生物悬浮体中；

2.63方法I或前述中的任一种，其中通过机械研磨或抛光基底的表面(步骤(a))，从而得到包含微生物、优选真菌孢子和种子的某些部分的的细级分，从而从种子的表面收获微生物。优选地，细级分中微生物的收率大于10

2.64方法2.63，其中步骤(a)包括用磨石研磨种子以与细级分分离。

2.65方法2.63，其中步骤(a)包括在压力条件下，用在长眼筛的封闭管内的旋转轴进行研磨，并随后用筛分机和过滤器将种子与细级分分离；

2.66方法2.63，其中细级分的筛分步骤(b)包括用20-800μm，优选为100μm至300μm的筛目尺寸进行筛分；

2.67方法I，或者配方2.1-2.63中的任一种，其中所述微生物是通过用水洗去它们并分离种子和液体微生物溶液或悬浮体而从种子的表面收获的。优选地，将种子在水中搅拌1-20分钟。仍优选地，在加压吸滤器中进行固液分离。优选地，在加压吸滤器中使用1-3mm的筛目尺寸。仍优选地，加压吸滤器中的脱水时间为20-200秒。仍优选地，吸滤器中的过滤压力为1-3巴。仍优选地，通过在离心场中从液体中分离微生物来浓缩微生物溶液或悬浮体。仍优选地，浓缩步骤包括在盘叠分离器中进行分离。仍优选地，重复浓缩步骤，用水稀释浓缩物，然后在离心场中进行第二次浓缩，以从微生物中分离出可溶部分；

2.68方法I或前述中的任一种，其中干燥步骤(2)包括流化床干燥基底-微生物混合物；

2.69方法I或前述中的任一种，其中干燥步骤(2)包括喷雾干燥基底-微生物混合物；

2.70方法I或前述中的任一种，其中干燥步骤(2)包括接触干燥基底-微生物混合物；

2.71方法I或前述中的任一种，其中干燥步骤(2)包括冷冻干燥基底-微生物混合物；

2.72方法I或前述中的任一种，其中干燥空气的温度小于或等于约130℃，在特定的实施方案中，小于或等于约90℃，优选小于或等于约80℃，仍优选小于或等于约50℃，仍优选在约30-50℃，仍优选在约40-50℃，仍优选在约40-45℃下，仍优选在约43℃下；

2.73方法I或前述中的任一种，其中粉末床保持在小于或等于约35℃下，优选在约25℃至约35℃下；

2.74方法I或前述中的任一种，其中所得组合物具有在约0.01和约0.6之间，优选在约0.2和约0.6之间，仍优选在约0.3和约0.5之间的水分活度值(A

2.75方法I或前述中的任一种，其中所得组合物具有的每克组合物的微生物的菌落形成单位(CFU/g)例如大于约10

2.76方法I或前述中的任一种，其中干燥空气的温度小于或等于约130℃，在特定的实施方案中小于或等于约90℃，优选小于或等于约80℃，仍优选小于或等于约50℃，仍优选在约30-50℃，仍优选在约40-50℃，仍优选在约40-45℃下，仍优选在约43℃；

2.77方法I或前述中的任一种，其中粉末床保持在小于或等于约35℃下，优选在约25℃至约35℃下；

2.78方法I或前述中的任一种，其中所得组合物具有在约0.01和约0.6之间，优选在约0.2和约0.6之间，仍优选在约0.3和约0.5之间的水分活度值(A

2.79方法I或前述中的任一种，其中所得组合物具有的每克组合物的微生物的菌落形成单位(CFU/g)例如大于约10

在第三方面，本发明提供了通过本发明的方法I或2.1-2.79中的任一种制备的干燥的生物组合物(组合物II')。在第三方面的另一实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法I或2.1-2.42中的任一种制备的干燥的生物组合物(组合物II-A)。在第三方面的仍又一实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法I或2.43-2.79中的任一种制备的干燥的生物组合物(组合物II-B)。

本发明的组合物还可用于施用于种子以保护它们免受害虫侵害或提供具有生物刺激功能如释放磷或供应氮的微生物。因此，在第四方面，本发明提供组合物I或1.1-1.50中任一种，或组合物II'或2.1-2.79中任一种，其进一步包含待处理的种子(组合物III’)，在特定的实施方案中，其基本上由待处理的种子(组合物III’)组成，并且在另一特定实施方案中，其由待处理的种子(组合物III’)组成。在第四方面的进一步实施方案中，本发明提供组合物I或1.1-1.33中任一种或组合物II-A，其进一步包含待处理的种子(组合物III-A)，在特定的实施方案中，其基本上由待处理的种子(组合物III-A)组成，并且在另一特定实施方案中，其由待处理的种子(组合物III-A)组成。在第四方面的又另一实施方案中，本发明提供组合物I或1.34-1.50中任一种或组合物II-B，其进一步包含待处理的种子(组合物III-B)，在特定的实施方案中，其基本上由待处理的种子(组合物III-B)组成，并且在另一特定实施方案中，其由待处理的种子(组合物III-B)组成。这些组合物可以任选地包含着色剂。

在第五方面，本发明提供了一种用于控制在待处理的区域上的昆虫、真菌或线虫的方法，该方法包括任选地重构(reconstituting)本发明的浓缩的干燥生物组合物(即，组合物I或者1.1-1.50中的任一种，或者组合物II'或2.1-2.79中的任一种，或者组合物III’中的任一种)，以及将有效量的(任选地重构的)本发明的浓缩的干燥的生物组合物施用到所述区域以实现处理。在第五方面的进一步实施方案中，本发明提供了一种用于控制待处理的区域上的昆虫、真菌或线虫的方法，该方法包括任选地重构本发明的浓缩的干燥生物组合物(即，组合物I或者1.1-1.33中的任一种，或者组合物II-A或者组合物III-A中的任一种)，以及将有效量的(任选地重构的)本发明的浓缩的干燥的生物组合物施用到所述区域以实现处理。在第五方面的又另一实施方案中，本发明提供了一种用于控制待处理的区域上的昆虫、真菌或线虫的方法，该方法包括任选地重构本发明的浓缩的干燥生物组合物(即，组合物I或者1.34-1.50中的任一种，组合物II-B或2.43-2.79中的任一种，或者组合物III-B)，以及将有效量的(任选地重构的)本发明的浓缩的干燥的生物组合物施用到所述区域以实现处理。在一个实施方案中，待处理的区域是植物的一部分，包括但不限于植物例如玉米、小麦、高粱、大豆、柑桔和非柑桔类水果、坚果树等的植物性插条、根、鳞茎、块茎、茎干、果实、花和/或叶。在另一实施方案中，待处理的区域是土壤或种子或它们的混合物。

附图说明

图1示出了在40℃下存储的实施例12-23的log CFU随时间的图。样品用添加剂标记。

图2示出了在40℃下存储的实施例12-23的以周为单位的十进制减少时间。误差棒是回归标准偏差。

图3示出了在升高的湿度下存储的实施例12-23的log(CFU)随时间的下降。

图4示出了在升高的湿度下存储的每个样品的十进制减少时间。误差棒代表回归标准偏差。

具体实施方式

本发明提供了一种以干燥且稳定形式并以与现有技术中的相比高的CFU递送微生物(例如，微生物杀虫剂，例如霉菌孢子和其他细菌)的体系。申请人发现可以例如使用本文公开的方法将微生物干燥到某些基底上，使目标总水浓度在约0.01重量％和15重量％之间，以产生适合于生物材料处于休眠状态的表面。可用于本发明的示例性基底包括但不限于二氧化硅，在特定的实施方案中，所述基底是沉淀二氧化硅，在又另一特定实施方案中，所述基底是亲水性二氧化硅，在特定的实施方案中其是

本发明的组合物的基底的典型粒径可具有约5-200微米，优选地约8-160微米，仍优选地约9-150微米，仍优选地约50-150微米，仍优选地约50-130微米，仍优选地选自约50微米、约85微米和约120微米的d50。二氧化硅的粒径可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测量，例如，使用激光散射的干粒径分析或扫描电子显微镜(SEM)分析。

本发明的组合物的基底的典型BET表面积为约2-400m

本发明的组合物的基底的典型孔隙体积为约0.01-1.20cc/g，优选地约0.05-1.20cc/g，仍优选地约0.10-1.0cc/g，仍优选地约0.20-0.95cc/g。具有约0.05-1.20cc/g，优选地约0.10-1.0cc/g，仍优选地0.20-0.95cc/g的孔隙体积的基底例如二氧化硅可用于本发明。具有较低孔隙体积例如0.01-1.2cc/g的基底例如纤维素可用于本发明。此类孔隙体积的数值是基于Barrett-Joyner-Halenda模型测量的。在另一实施方案中，本发明的基底是具有大于1cc/g，优选1.4cc/g的按照Barrett-Joyner-Halenda模型的孔隙体积，或者大于2cc/g，优选2.2cc/g的按照汞孔隙体积的孔隙体积的二氧化硅。

本文公开的基底为将要沉积并在干燥器中有效干燥以达到本文公开的目标总水含量的微生物提供了合适的表面，避免了长时间暴露于热下，该热降低了储存后的生物体存活率和能存活的生物体。特别地，例如使用本文公开的方法将微生物干燥到所述基底的表面上，使目标总水含量在约0.01重量％和约15重量％之间，在特定的实施方案中，在约0.01重量％和约8重量％之间，优选地约5重量％和约8重量％，仍优选地约5重量％和约8重量％，仍优选地选自约3重量％、约5重量％和约7重量％。水分含量水平测量特定产品中存在的水的量，并且可以通过本领域已知的方法进行测量，例如，通过在约100℃下一段时间至恒重(即干燥失重)，测量每克产品损失的水的量(重量％)。

选择本发明的基底以及本文提供的目标水分含量水平会产生在约0.01和约0.6之间，优选在约0.2和约0.6之间，仍优选在约0.2至约0.5之间，仍优选在约0.3和约0.5之间的最佳限定水分活度(A

本发明允许微生物以高菌落形成单位浓度浓缩到基底上，在特定的实施方案中，所述微生物以结壳的形式浓缩在基底(特别是二氧化硅)上。因此，本发明的组合物具有大于约10

可用于本发明的微生物包括天然或重组微生物，它们可作为其他不期望的微生物的捕食者或干预其他不期望微生物的生命周期，或对要治疗的区域提供有益效果，或可产生有效作为杀虫剂的生物活性物质。用于本发明的示例性微生物包括可以用于农业领域的那些，包括但不限于苏云金芽孢杆菌、荧光假单胞菌、慢生根瘤菌、菌根菌、粉红粘帚霉等，或其组合。用于本发明的其他微生物还包括但不限于：枯草芽孢杆菌QST713和巴氏杆菌；真菌例如球孢白僵菌、盾壳霉、银叶菌、淡紫拟青霉、粉虱座壳孢、布氏白僵菌、汤氏多毛菌、玫烟色棒束孢、棒束孢霉、长孢蜡蚧菌、蝇蚧疥霉、蜡蚧菌、绿僵菌、金龟子绿僵菌、莱氏野村菌和虫生簇孢霉；病毒例如苹果蠹蛾颗粒体病毒；以及卵菌例如棕榈疫霉、大链壶菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌或者其任意组合。可以在Biological Control 43(2007)237-256中发现可用于本发明的真菌和子物种的其他实例，其内容通过引用整体并入本申请中。目前的目录清单不意图是详尽的，并可以包括在农业领域以及其他领域例如食品、医疗或制药、洗涤剂和能源领域有用的其他微生物。

本发明的基底-微生物混合物不需要任何外源性保护剂，例如藻酸盐包胶，但可以任选地用聚合物或其他材料例如气相二氧化硅(例如

本发明的基底-微生物混合物也可以用第二基底例如无机材料处理，以在储存期间提供额外的防潮保护。在一个实施方案中，第二基底选自沉淀二氧化硅以小于3％作为外层，例如

本发明的组合物可以直接施用于处理区域，例如植物、种子或害虫，或者它们可以配制成生物配制物，例如用于施用于这种处理区域。传统上，含有微生物或其他生物活性材料的水性配制物难以在典型的悬浮浓缩配制物的保存期限内稳定下来。本发明中讨论的组合物旨在降低总的配制障碍。本发明教导了用于产生具有较高活性水平(CFU)和稳定性(CFU随时间的变化低)的生物组合物的方法。更稳定的组合物降低生成适用于农业领域应用的可用产品所需的配制障碍。本发明的组合物的优点允许它们被配制为液体和干燥农用化学配制物类型。这些配制物的实例包括但不限于WP(可湿性粉末)、WG(水分散性颗粒)、SC(悬浮浓缩物)、OD(油分散体)、FS(种子处理剂)。因此，在另一方面，本发明提供了一种生物配制物，其包含本发明的组合物，例如组合物I或1.1-1.33或者1.34-1.50中的任一种，和一种或多种赋形剂。由于本发明的微生物可用于农业用途，因此可以预期农业化学上可接受的赋形剂或佐剂，如润湿剂。另外，可以使用与其他农业化学活性成分的组合。

SC形式的水基配制物可包含一种或多种分散剂、聚合物、粘着剂、表面活性剂、着色剂和/或防冻化合物。具体配制助剂的选择完全在本领域技术人员的知识范围内。

干配制物包括粉剂(DP)、拌种粉(DS)、粒剂(GR)、微粒剂(MG)、水分散性粒剂(WG)、可润湿性粉末(WP)，并可包含一种或多种粘合剂、分散剂和润湿剂。具体配制助剂的选择完全在本领域技术人员的知识范围内。

本发明的组合物以配制物类型ST(水溶性片剂)和TB(片剂)的片剂形式特别有用。因此，在特定的实施方案中，本发明提供了生物片剂，其包含本发明的组合物，例如组合物I或1.1-1.33中的任一种或者1.34-1.50中的任一种，和一种或多种赋形剂。可用于本发明的片剂配制物的赋形剂可包含一种或多种润滑剂、粘合剂、崩解剂和填充剂。有用的润滑剂包括但不限于滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、硼酸、聚乙二醇和硬脂酰醇富马酸钠。有用的粘合剂包括但不限于微晶纤维素、乙酸纤维素、角叉菜胶、糊精、葡萄糖、乙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。有用的填充剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉、淀粉钠、乙醇酸酯、直链淀粉、羟基乙酸淀粉钠(Primogel)、交联聚维酮和交联羧甲基纤维素钠。有用的崩解剂包括但不限于硅酸钙。示例性片剂可以由2-30％的包含10

本发明的油分散配制物包含分散在非水液体或水不溶性液体如矿物油、石蜡油或植物油中的本发明的组合物，例如组合物I或1.1-1.33中的任一种或者1.34-1.50中的任一种，并且包含一种或多种分散剂、乳化剂聚合物、粘着剂、表面活性剂。具体配制助剂的选择完全在本领域技术人员的知识范围内。

可用于本发明的配制物的农用油包括石蜡油，例如辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷及其混合物，或与更高沸点的同系物混合的油，例如十七烷、十八烷、十九烷、二十烷、二十一烷、二十二烷、二十三烷、二十四烷、二十五烷及其支链异构体；植物油，例如橄榄油、吉贝油、蓖麻油、木瓜油、山茶油、棕榈油、芝麻油、玉米油、米糠油、花生油、棉籽油、大豆油、菜籽油、亚麻籽油、桐油、向日葵油、红花油，或其酯交换产物例如菜籽油甲酯或菜籽油乙酯；动物油、例如鲸脂油、鱼肝油或貂油；其他油例如丁醇、正辛醇、异辛醇、十二烷醇、环戊醇、环己醇、环辛醇、乙二醇、丙二醇或苄醇、己酸、癸酸、辛酸、壬酸(peiargonic acid)、琥珀酸、戊二酸、苯甲酸、甲苯酸、水杨酸和邻苯二甲酸、乙酸苄酯、己酸乙酯、壬酸乙酯、苯甲酸甲酯或乙酯、水杨酸甲酯、丙酯或丁酯、邻苯二甲酸二酯与饱和脂族的二酯、邻苯二甲酸二甲酯、二丁酯、二异辛酯，或它们的任意组合。

本发明还预期用于种子处理或拌种的本发明的组合物。因此，在一个实施方案中，本发明的组合物提供了一种可流动的浓缩物形式，例如对于种子处理剂(FS形式)，其可以通过将组合物I或1.1-1.33中的任一种或者1.34-1.50中的任一种与一种或多种分散剂、成膜聚合物、粘着剂、表面活性剂和着色剂共混，并将共混物添加到种子而制备。也可以包括有助于使配制物粘在种子上，强化包衣并减少粉尘的成分。具体配制助剂的选择完全在本领域技术人员的知识范围内。

在另一方面，本发明还提供了制备干燥的生物组合物的方法，该方法包括以下步骤，在特定的实施方案中基本上由以下步骤组成，并且在另一特定实施方案中由以下步骤组成：(1)将微生物混合物、溶液或悬浮体与基底混合；(2)干燥基底-微生物混合物以达到约0.01至约15重量％，优选约3重量％至约8重量％，仍优选约5重量％至约8重量％，仍优选选自3重量％、5重量％和7重量％的总水分含量。在又另一实施方案中，本发明方法的步骤(2)将组合物干燥至所得水分活度(A

本发明的组合物中将要使用的微生物可以通过各种方式获得。在一个实施方案中，可以通过用水例如1∶1的水∶种子的比例洗涤种子而从种子的表面收获微生物。在另一实施方案中，通过机械研磨或抛光种子的表面(步骤(a))而得到包含微生物、在特定的实施方案中包含真菌孢子和种子的某些部分的细级分，而从种子的表面收获微生物。在特定的实施方案中，细级分中微生物的收率大于10

在另一实施方案中，所述微生物可以通过用水洗去它们并分离种子和液体微生物溶液或悬浮体而从种子的表面收获。在特定的实施方案中，将种子在水中搅拌1-20分钟。在另一特定的实施方案中，在加压吸滤器中进行固液分离，在另一特定的实施方案中，在加压吸滤器中使用1-3mm的筛目尺寸。在另一特定实施方案中，加压吸滤器中的脱水时间为20-200秒。在特定的实施方案中，吸滤器中的过滤压力为1-3巴。在另一特定的实施方案中，通过在离心场中从液体中分离微生物来浓缩微生物溶液或悬浮体。在特定的实施方案中，浓缩步骤包括在盘叠分离器中进行分离。在特定的实施方案中，重复浓缩步骤，用水稀释浓缩物，然后在离心场中进行第二次浓缩，以从微生物中分离出可溶部分。

可用于本发明方法的步骤(1)的基底可以选自二氧化硅(例如沉淀二氧化硅，在特定的实施方案中，为亲水性二氧化硅，例如

本文所述的本发明的方法可进一步包括在步骤(1)之后添加以下物质，但在一个实施方案中，在步骤(2)之前添加以下物质，在另一实施方案中，在步骤(2)期间以下物质，并且在又另一实施方案中，在步骤(2)之后添加以下物质：(i)选自聚乙烯醇、黄原胶、阿拉伯胶或其他多糖例如麦芽糊精、瓜尔胶(例如羟丙基瓜尔胶)、聚乙二醇和聚甘油的聚合物；或(ii)非还原性二糖例如海藻糖或蔗糖，或(iii)脱脂牛奶或二甲基亚砜，在特定的实施方案中为聚乙烯醇或聚甘油(例如，超支化聚甘油)；和/或(ii)作为外层的第二基底。在特定的实施方案中，第二基底选自沉淀二氧化硅，例如

本发明方法的干燥步骤(2)可以通过流化床干燥、喷雾干燥、接触干燥或冷冻干燥来实现。流化床干燥可以通过使进气温度小于或等于约90℃，优选小于或等于约80℃，优选小于或等于约50℃，仍优选在约30-50℃下，仍优选在约40-50℃下，仍优选在约40-45℃下，仍优选在约43℃下。在特定的实施方案中，本发明方法的干燥步骤(2)可以通过以非常低的风扇速度将喷雾干燥器预热，空气温度使进气温度小于或等于约50℃，优选在约30-50℃，仍优选在约40-50℃，仍优选在约40-45℃下，并且将微生物混合物喷入腔室中至所述基底上来实现。优选地，实验室规模的泵送速度为1mL/min，仍优选2mL/min的基底。任选地，干燥步骤(2)还包括在减压下(例如在0.1巴下)的干燥。

可以通过使进气温度小于或等于约130℃，优选小于或等于110℃，仍优选小于或等于100℃，仍优选小于或等于约90℃，仍优选小于或等于约80℃，仍优选小于或等于约50℃，仍优选在约30-50℃下来实施喷雾干燥。喷雾干燥可以与气体流动一起。

优选地，本发明方法的干燥步骤(2)包括保持粉末床温度小于或等于约35℃，优选小于或等于约30℃，仍优选在约25℃和35℃之间。

据信干燥时间与二氧化硅的表面积成正比，并且水分活度的控制与二氧化硅的表面积成反比。因此，在一个实施方案中，具有中等BET表面积(例如150-350m

本发明方法的步骤(1)的微生物混合物或溶液或悬浮体可以在搅拌的间歇发酵罐中通过向间歇反应器中添加糖和其他营养物进行发酵，该间歇反应器被充气或保持在厌氧状态下，以允许生物体根据生物体的性质繁殖并达到最佳收获状态。在另一方面，生物体可以在固体介质如纤维素材料、种子和悬浮在搅拌反应器中的其他固体材料上生长。在又另一方面，微生物可以在干燥但加湿处理的环境中的固体培养基上生长，在最佳时从种子中洗涤。

就本申请而言，

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。如有冲突，以本文件包括定义为准。下面描述优选的方法和材料，尽管与本文中所描述的那些相似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。本文公开的材料、方法和实例仅是说明性的，而无意于进行限制。

本文所使用的术语“包含”，“包括”，“具有(having)”，“有(has)”，“可以”，“含有”及其变体旨在是不排除其他行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或单词。除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个”，“一种”和“该”包括复数形式。本公开内容还预期其他实施方案“包含”本文中提出的实施方案或元素、“由其组成”和“基本上由其组成”，无论是否明确提出。

连词“或”包括与该连词相关联的一个或多个列出的元素的任何和所有组合。例如，短语“设备包括A或B”可以是指其中包括A但不存在B的设备，包括B但不存在A的设备或其中A和B都存在的设备。短语“A、B、...和N中的至少一个”或“A、B、...N或其组合中的至少一个”在最广义上定义为表示选自A、B、...和N的一个或多个元素，即元素A、B、...或N中的一个或多个的任意组合，包括单独的任何一种元素，或与一种或多种其他元素的组合，其还可以包括与未列出的额外元素的组合。

与数量结合使用的修饰语“约”包括所陈述的数值，并且具有上下文指示的含义(例如，它至少包括与特定数量的测量相关的误差程度)。修饰语“约”也应视为公开了由两个端点的绝对值定义的范围。例如，表述“约2至约4”也公开了范围“2至4”。术语“约”可以指所指示数字的正负10％。例如，“约10％”可以表示9％至11％的范围，并且“约1”可以表示0.9-1.1。从上下文中“约”的其他含义可以是明显的，例如四舍五入，因此，例如“约1”也可以意指0.5至1.4。

通过参考以下实施例可以更好地理解前述内容，这些实施例是出于说明的目的而提出的，并不旨在限制本发明的范围。

扫描电子显微镜(SEM)图像.使用Hitachi TM 3000电子显微镜获得本发明的基底-微生物的图像，以显示产物颗粒的形态和组成。图像显示，孢子细胞附着在二氧化硅颗粒上。

使用上面描述的或类似描述的分析方法，将各种基底的物理性能测量并汇总在下表1中。

表1

使用以上描述或类似描述的方法，对流化床干燥后测试样品的总水分含量和水分活度(A

表2

表3

表4

从上表可以看出，具有高BET表面积和较大孔隙体积的基底例如

实施例12-23.进行以下实施例以确定添加剂对改善微生物的热稳定性和湿度稳定性的影响。

洗涤程序.通过将种子与等质量的水混合直至水变成浅棕色来洗涤种子。从种子中滤出(strained)孢子悬浮体，直到收集到水的初始体积的一半为止，如果需要则添加更多的水以收集包括从储备溶液中添加的体积的最终体积。将添加剂直接混入悬浮体(

流化床干燥.以约4g/min的速度将收集的孢子悬浮体从上面喷洒到与所喷雾的悬浮体重量相等的

CFU计数.CFU或菌落形成单位是一克产品上的活孢子的数目。将孢子粉与Triton溶液混合，并通过系列稀释法以及铺在含0.1％链霉素的马铃薯葡萄糖琼脂上，在室温下孵育5天。通过用30-300个孢子乘以稀释倍数对平板计数来确定CFU。

热稳定性.将具有足够低水分活度的孢子粉储存在40℃的烘箱中，在不同的时间点计数CFU，以测量粉末上活细胞密度的下降。

湿度稳定性.将孢子粉在70％的相对湿度和25℃下存储于微管蛋白(tubulin)半多孔袋中的湿度池(Associated Environmental Systems)中，所述袋子可透过水蒸气而不可透过孢子。在各个时间点测量CFU以测量进展。

水分活度.水分活度定义为封闭样品中的水的蒸气压。在密闭的腔室中，当镜子的温度下降时，通过冷却的镜子上的露点测得该温度。水分活度在AquaLab模型3上测量。

十进制减少时间.十进制减少时间定义为使微生物的存活种群减少90％的时间。它是使用生存曲线的逆斜率来计算的，该生存曲线是log CFU随时间变化的曲线图。

结果.对稳定性实验中使用的样品进行初始筛选，以具有高CFU和低水分活度。不符合这些要求的样品将被丢弃并重新制备。所使用的每个样品的水分活度可见于下表6。将具有这两个要求的样品分开，并一半与

下表5汇总了样品的制备：

表6.样品和相应的初始水分活度。

将测试热稳定性的样品保存在烘箱中，在10周的时段内进行监控。如图1所示，在几个时间点测量CFU。计算十进制减少时间(D值)并可见于图2中。可以看出，在最初的六周内，这些值没有显著差异。然而，在10周标记内，观察到与

尽管大多数样品显示出可比的趋势，但对照(control)在热稳定性测试中表现最差。没有任何添加剂的样品也从最低的CFU开始。仅含有

如图4中所示，包含HPG的样品表现得最好。仅含有

与没有添加剂的样品相比，

实施例24-25按如下所述制备：

实施例24

实施例25

在基本培养基中发酵荧光假单胞菌的生物质，并使用圆盘离心机收获以获得浓缩的细胞悬浮体。制备生理盐水溶液，并与海藻糖、阿拉伯树胶以及