一种氨基甲酸酯类农药的抗体的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，更具体地涉及一种直接识别氨基甲酸酯类农药的抗体的制备方法和应用。

背景技术

我国是农业大国，每年在农业产生中消耗大量农药，残留的农药易造成环境污染和食物急性中毒等严重问题。氨基甲酸酯类农药属于有机磷类农药，是目前广泛使用的杀虫剂之一。针对氨基甲酸酯类农药检测，目前仪器分析法是主要的分析方法，但仪器分析法需要昂贵的仪器、专人操作与维护、复杂前处理，并且无法实现现场快速检测。为弥补仪器分析法缺点，有必要开发出一种可以实现快速高通量筛查的分析方法，用于现场快速检测。

免疫分析法是基于抗原与抗体特异性、可逆性结合反应的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体结构、静电、氢键和范德华力等的综合作用，具有任何一种单独理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度，因此具有灵敏度与常规的仪器分析一致、适合现场筛选、简单、快速、成本低、样品所需量少等优点，被认为是21世纪最具竞争性和挑战性的快速检测技术。世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术。美国化学学会(ACS)将免疫分析技术、色谱分析技术共同列为农药、兽药和渔药残留分析的主要技术。

半抗原设计是针对小分子免疫分析法的核心基础，目前尚无一种针对氨基甲酸酯类农药的通用半抗原所设计。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用的氨基甲酸酯类农药半抗原设计路线以及相应的抗体制备方法和应用，以提高研发效率和降低研发成本。

为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种氨基甲酸酯类农药的抗体的制备方法，包括半抗原的制备方法和完全抗原的制备方法，所述半抗原的制备方法包括下列步骤：见反应式(I)和(II)：

反应式(I)和(II)中的R为氨基甲酸酯类农药特征基团；所述完全抗原的制备方法的制备的完全抗原(III)和(IV)，其结构式为

1)氨基甲酸酯类农药原料(R-OH)与对硝基酰氯溶解于二氯甲烷(DCM)和三乙胺(Et3N)，持续搅拌反应生成

2)

3)氨基甲酸酯类农药原料(R-OH)溶解于DMF中，加入碳酸钾和2-溴乙酸乙酯或4-溴丁酸乙酯，在70℃中搅拌回流反应5h后加入乙酸乙酯和三级水萃取，移除水层；

4)乙酸乙酯层旋转蒸发后得中间产物，向中间产物加入氢氧化锂溶液，搅拌1h，然后加入乙酸乙酯萃取未水解完毕的中间体，弃乙酸乙酯层，萃取完毕后，用盐酸将水层pH调节至4-5，产物析出，有机相干燥后在石油醚中重结晶出半抗原

优选地，所述半抗原的制备方法中氨基甲酸酯类农药原料(R-OH)与对硝基酰氯摩尔比为1： 1.2～1.5；二氯甲烷和三乙胺体积为20～25mL；萃取次数为3～5次；二氧六环体积为5～10mL；流动相中乙酸乙酯和甲醇体积比为10：1～20：1；

碳酸钾质量为0.8～1g；氨基甲酸酯类农药原料与2-溴乙酸乙酯或4-溴丁酸乙酯的摩尔比为 1.5～2；氢氧化锂浓度为0.16～0.2g/mL；结晶中石油醚体积为10～20mL。

具体的，所述完全抗原(III)和(IV)中的载体蛋白为牛乳铁蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白或卵清蛋白。

具体地，所述完全抗原(III)的制备包括以下步骤：

S11.活化半抗原：在搅拌下半抗原

S12.载体蛋白溶解于碳酸缓冲液，得到B液，载体蛋白浓度为5～10mg/mL；

S13.将S11的A液滴加到S12的B液中，用NaOH溶液或碳酸缓冲液调节pH至9.5～9.6，避光反应12～16h，透析纯化后获得完全抗原(III)；

半抗原

进一步地，所述完全抗原(IV)的制备包括以下步骤：

S21.半抗原

S22.载体蛋白溶解在碳酸缓冲液，载体蛋白浓度为5～10mg/mL，称为B2液；

S23.将上述A2液体滴加到B2液中，之后用NaOH溶液调节pH至9.5～9.6，避光反应12～ 16h，透析纯化后获得完全抗原(IV)。

所述A液中半抗原

优选地，所述NaOH溶液浓度为1～3M。

所述半抗原

优选地，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体。

所述氨基甲酸酯类农药的抗体在检测氨基甲酸酯类农药或制备检测氨基甲酸酯类农药试剂盒中的应用。

在基于间接竞争酶联免疫法的氨基甲酸酯类农药的检测中化合物(III)为免疫原，化合物(IV) 为包被原。

有益效果：

合成两种氨基甲酸酯类农药半抗原，通过将半抗原偶联到载体蛋白上，成功制备得到两种的人工抗原，利用其中一种人工抗原免疫动物，制备能分泌抗氨基甲酸酯类农药抗体的杂交瘤细胞；利用其中一种人工抗原作为包被原，进一步建立一种基于间接竞争酶联免疫法的氨基甲酸酯类农药的检测方法。本检测方法检测氨基甲酸酯类农药农药残留具有简便快速、特异性强、灵敏度较高的特点，检测的IC50值为7.13ng/mL，检测限为(IC10)1.7ng/mL，线性检测范围为2.9～17.9ng/mL。

附图说明

图1为氨基甲酸酯类农药半抗原的制备方法的流程图。

图2为克百威完全抗原鉴定图。

图3为异丙威完全抗原鉴定图。

图4为甲萘威完全抗原鉴定图

图5为氨基甲酸酯类农药抗体的ELISA竞争标准曲线图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1氨基甲酸酯类农药半抗原合成

一、实验方法

(1)本实施例以克百威、异丙威和甲萘威的半抗原合成为例子，式(I)所示氨基甲酸酯类农药半抗原合成路线，等到免疫半抗原(V)。

10mmol原料与1.2倍当量的对硝基酰氯溶解于25mL二氯甲烷(DCM)和25mL三乙胺(Et3N)，持续搅拌反应12h。反应物溶解于乙酸乙酯，然后用0.5M盐酸溶液萃取三次，弃去水层，乙酸乙酯层蒸发干燥。得到中间体

(2)本实施例以克百威、异丙威和甲萘威的半抗原合成为例子，式(II)所示氨基甲酸酯类农药半抗原合成路线，得到免疫半抗原(VI)。

10mmol原料溶解于10mL DMF中，加入2g碳酸钾和2倍当量的2-溴乙酸乙酯，70℃搅拌回流反应5h。反应产物转移到分液漏斗，加入乙酸乙酯和三级水萃取，移除水层，共萃取三次。乙酸乙酯层旋转蒸发后得中间油状产物。向中间产物加入10mL水，随后加入1.6g氢氧化锂，搅拌1h，溶液逐渐清澈。然后将溶液转移至分液漏斗，加入乙酸乙酯萃取未水解完毕的中间体，弃乙酸乙酯层，共萃取三次。萃取完毕后，用盐酸将水层pH调节至4-5，产物析出。用乙酸乙酯将产物萃取3次，有机相转移至圆底烧瓶并旋转蒸发干燥。然后向圆底烧瓶加入25mL石油醚，并将圆底烧瓶置于超声水浴中进行超声处理，使产物快速在石油醚中重结晶，得到纯产物。其中， JNW-H2即1-萘氧基乙酸，可直接在市场购买。

二、实验结果

半抗原质谱和核磁鉴定如表1所示。

表1半抗原质谱和核磁共振鉴定数据

实施例2氨基甲酸酯类农药完全抗原合成

一、实验方法

(1)式(III)和(VI)所示氨基甲酸酯类农药完全抗原

(i)将式(I)所示0.25mmol免疫半抗原溶于600μL，N，N-二甲基甲酰胺中，接着搅拌下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A1液。其中，(V)所示免疫半抗原、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5。将50mg牛乳铁蛋白(LF) 溶解在pH 9.6碳酸缓冲液中，其牛乳铁蛋白浓度为5～10mg/mL，称为B1液。在冰浴搅拌下将上述A1液体滴加到B1液中，A1液中的结构式如式(V)所示半抗原与所述B1液中的所述载体蛋白的摩尔比为400：1。滴加后，用3M NaOH将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后获得如式(III-1)所示氨基甲酸酯类农药完全抗原：

(ii)将式(I)所示0.09mmol包被半抗原溶于600μL，N，N-二甲基甲酰胺中，接着搅拌下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A2液。其中，(VI)所示氨基甲酸酯类农药半抗原、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5。将200mg牛血清蛋白(BSA)溶解在pH 9.6碳酸缓冲液中，其牛血清蛋白浓度为5～10mg/mL，称为B2液。在冰浴搅拌下将上述A2液体滴加到B2液中，A1液中的结构式如式(I)所示半抗原与所述B2液中的所述载体蛋白的摩尔比为30：1。滴加后，用3M NaOH将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后获得如式(III-2)所示氨基甲酸酯类农药完全抗原：

(2)式(IV)所示氨基甲酸酯类农药完全抗原

将式(I)所示0.09mmol包被半抗原溶于600μL N，N-二甲基甲酰胺中，接着搅拌下加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下避光搅拌4h，获得活化后的半抗原，称为A3液。其中，(VI)所示氨基甲酸酯类农药半抗原、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亚胺盐酸盐和所述N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1.5：1.5。将200mg牛血清蛋白(BSA) 溶解在pH 9.6碳酸缓冲液中，其牛血清蛋白浓度为5～10mg/mL，称为B3液。在冰浴搅拌下将上述A3液体滴加到B3液中，A3液中的结构式如式(I)所示半抗原与所述B3液中的所述载体蛋白的摩尔比为30：1。滴加后，用浓度3M的NaOH溶液将pH调节至9.5～9.6。避光反应过夜，并经过透析纯化后获得如式(VI)所示氨基甲酸酯类农药完全抗原：当载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA) 时，制备得到的完全抗原如式(IV-1)所示：

二、实验结果

通过分别扫描半抗原、偶联物及载体蛋白溶液在紫外区(200～400nm)的吸收光。如下图2～ 4所示，偶联物的紫外吸收特征峰相对于原载体蛋白，均具有一定程度红移或蓝移，证明人工抗原制备成功。

实施例3抗氨基甲酸酯类农药单克隆抗体制备

一、实验方法

取6～8周龄Bal b/c小鼠，将制备的浓度为1mg/mL式(III-1)所示氨基甲酸酯类农药完全抗原免疫抗原与弗氏完全佐剂等量混合，完全乳化后，注射小鼠腹部和背部，每只小鼠注射100μL。第一次免疫采用弗氏完全佐剂，后加强免疫采用弗氏不完全佐剂，每隔3周免疫一次，一共加强免疫4次。第二次加强免疫后一周从尾部静脉取血检效价和抑制。第四次加强免疫后，选取效价和抑制率都较高的小鼠进行细胞融合，融合前3天加倍剂量强化免疫一次。

将小鼠骨髓瘤SP2/0细胞与脾细胞以5：1的比例混合，在50％PEG下融合，洗涤、离心后以HAT培养基悬浮，接种于含饲养细胞的96孔培养板中，在37℃5％的CO

二、实验结果

结果如表2所示，以抑制率最高的完全抗原IV-1作为包被原。

表2小鼠抗血清表征

实施例4抗氨基甲酸酯类农药检测方法的建立及特异性检测

一、实验方法

取实施例3制备得到的单克隆抗体建立标准曲线，包被原的工作浓度为1000ng/mL，采用三组平行试验(n＝3)。

抗血清间接竞争ELISA检测步骤如下：

S1.包被:用pH 9.6碳酸缓冲液将包被原(式(IV-1)所示氨基甲酸酯类农药完全抗原)稀释至，加入酶标板孔中，100μL/孔，37℃水浴箱中过夜。对于克百威、异丙威和甲萘威包被原，其浓度分别为62.5ng/mL、250ng/mL、2000ng/mL。

S2.洗涤:倾去孔内液体，洗板机洗板2次，每孔加洗涤液250μL，甩干孔中液体。

S3.封闭:每孔加入120μL封闭液，37℃封闭3h，甩干孔内液体，倒置于37℃烘箱中1h 备用。

S4.加样及孵育:将氨基甲酸酯类农药及其结构类似物稀释成系列梯度标准液，分别稀释为 10000，1000，100，10，1，0.1，0.01ng/mL，每孔加50μL，然后加入抗体(实施例3中式(III-1) 所示氨基甲酸酯类农药完全抗原免疫制备得到)的稀释液50μL，37℃水浴箱中反应40min后，洗板机洗板5次，每孔加入洗涤液250μL，甩干孔中液体。对于克百威、异丙威和甲萘威抗体，其浓度分别为31.25ng/mL、500ng/mL、31.25ng/mL。

S5.加二抗:每孔加入100μL稀释5000倍的HRP-羊抗鼠，37℃水浴箱中反应30min后，洗板同S4。

S6.显色:TMB底物液和底物缓冲液等体积混合，每孔加入混合液100μL，置于37℃水浴箱中显色10min后，每孔加入50μL 10％H

S7.测定:用酶联免疫检测仪测定各孔A

S8.计算:用Origin8.5的四参数拟合模块计算抑制曲线的IC

交叉反应率R(％)如下所示：

R(％)＝IC

二、实验结果

标准曲线见图5。所得标准曲线IC

特异性检测如表3所示。

表3特异性测试

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

合成两种氨基甲酸酯类农药半抗原，通过将半抗原偶联到载体蛋白上，成功制备得到两种的人工抗原，利用其中一种人工抗原免疫动物，制备能分泌抗氨基甲酸酯类农药抗体的杂交瘤细胞；利用其中一种人工抗原作为包被原，进一步建立一种基于间接竞争酶联免疫法的氨基甲酸酯类农药的检测方法。本检测方法检测氨基甲酸酯类农药农药残留具有简便快速、特异性强、灵敏度较高的特点，检测的IC50值为7.13ng/mL，检测限为(IC10)1.7ng/mL，线性检测范围为2.9～17.9ng/mL。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。