一种基于智能形变响应的DNA双层水凝胶薄膜传感器的检测方法

技术领域

本发明属于智能形变水凝胶薄膜传感器领域，尤其是一种基于智能形变响应的DNA双层水凝胶薄膜传感器的检测方法。

背景技术

水凝胶是一类具有高度含水量的三维网络状“软物质”，良好的生物相容性、高度的结构灵活性和丰富的多功能性，使其成为生物材料的重要分支。在水凝胶中引入功能单元或组分可以得到刺激响应性水凝胶，使其在外界刺激下改变内部高分子链之间的相互作用，实现水凝胶的脱水或吸水，达到一种智能化的效果。刺激响应性水凝胶又称智能水凝胶，可以对外界微小的物理或化学刺激迅速作出响应性变化，在生物医学领域特别是生化分析中具有重大应用潜力。受到自然界生物自适应性形变行为的启发，人们将水凝胶这种智能响应特性与仿生形变的思想结合起来，制备了丰富多样的具有智能形变特性的水凝胶。

DNA水凝胶就是DNA链在水溶液中相互交联后形成的网络结构，兼具水凝胶的骨架功能和DNA的生物学功能。由于DNA具有可进行信息编码的精准分子结构和丰富的功能结构，因而可以通过碱基序列编码引入多样化的DNA功能结构,构建兼具DNA的丰富结构与功能的智能响应型DNA水凝胶。在DNA水凝胶中，通过合理的序列设计以及多样化的修饰得到明确结构和功能的DNA，通过施加不同的物理或化学刺激,如温度、pH、金属离子、光、生物分子等，使DNA的功能结构产生变化，进而引起智能DNA水凝胶性质的变化。智能DNA水凝胶在生物传感、药物控释、仿生驱动、细胞培养等领域具有巨大的应用潜力,尤其是在生物传感方面的应用日益受到研究者的广泛关注。然而，目前报道的DNA水凝胶生物传感器存在着响应速度慢，所需水凝胶样品量大、成本高，且后续定量检测需复杂的大型设备等缺点。所以开发一种响应速度快，检测成本低，且操作简单的DNA水凝胶生物传感器十分重要。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种基于智能形变响应的DNA双层水凝胶薄膜传感器的检测方法，通过将非响应特性的被动层与具有刺激响应特性的主动层结合得到的水凝胶在外界刺激的作用下，即可产生高效、快速的宏观形变行为，在节约成本和反应时间的基础上通过弯曲角度的变化实现了对pH或Ag+或Cys的检测，该方法为智能DNA水凝胶传感器的发展提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种基于智能形变响应的DNA双层水凝胶薄膜传感器在检测环境变化或生物化学物质中的应用。

一种基于智能形变响应的DNA双层水凝胶薄膜传感器在检测环境pH变化、Ag

本发明的第二目的在于提供一种基于智能形变响应的DNA双层水凝胶薄膜传感器的检测方法，DNA双层水凝胶薄膜传感器包括非响应特性的被动层和具有刺激响应特性的主动层，被动层和主动层粘合在一起，通过对具有刺激响应特性的主动层的DNA进行编码，当双层水凝胶薄传感器放入不同pH值、不同Ag

具体检测方法如下：

(1)配制不同pH的Tris-HCl缓冲溶液,将双层水凝胶薄传感器放入缓冲溶液中，通过控制缓冲溶液的pH使双层水凝胶薄传感器产生形变，得到标准曲线，对pH值的定性、定量检测；

(2)配制含有不同浓度的Ag

进一步的，缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液或Tris-HNO

进一步的，pH响应的双层水凝胶薄膜传感器DNA序列为5’-Acrydite-AAAACCCCTAACCCC-3’；Ag+或Cys的双层水凝胶薄膜传感器的DNA序列为5’-Acrydite-AATCTTAACATT-3’。

本发明的第三个目的在于提供了基于智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器光聚合前驱体溶液：将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合溶液、光引发剂、葡聚糖修饰的染料溶解在缓冲溶液中得到水凝胶被动层的前驱体溶液；将丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液、pH调控的DNA序列或Ag

(2)智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器：将水凝胶被动层的前驱体溶液注入组装的光刻反应腔进行曝光，再将反应腔转移至缓冲溶液中，除去未反应的单体溶液，打开反应腔得到水凝胶的被动层；

(3)重新组装反应腔，将水凝胶主动层的前驱体溶液注入光刻反应腔进行曝光，得到双层水凝胶结构；

步骤(1)中，光引发剂为偶氮二异丁脒盐酸盐、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮中的一种或多种，，葡聚糖修饰的染料为葡聚糖修饰的罗丹明；

水凝胶被动层的前驱体溶液中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为19:1；丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合溶液的终浓度为4-5％w/v，光引发剂的终浓度为1-2％w/v，葡聚糖修饰的染料的终浓度为2.5-3.5mg/mL；

水凝胶主动层的前驱体溶液中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29:1，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺混合溶液的终浓度为4-5％w/v，光引发剂的终浓度为1-2％w/v，荧光素标记葡聚糖的终浓度为2.5-5mg/mL，DNA的浓度为1-2mM。

进一步的，步骤(2)中，组装光刻反应腔包括下层基底玻璃板、上层玻璃板和位于下层基底玻璃板和上层玻璃板之间的聚酰亚胺胶带；

组装光刻反应腔的上层玻璃板经过疏水化处理，并贴有菲林光掩膜；

组装光刻反应腔的下层基底玻璃板上设有聚合物牺牲层。

优选的，组装光刻反应腔的上层玻璃板和下层基底玻璃板在使用前均用食人鱼洗液处理，食人鱼洗液中浓硫酸和双氧水的体积比为7-8:3-4；

优选的，食人鱼洗液中浓硫酸和双氧水的体积比为7:3。

优选的，所述聚合物牺牲层为聚丙烯酸钙，聚合物牺牲层是通过旋涂5-10％的聚丙烯酸钠，之后通过与氯化钙发生离子交换得到；

优选的，聚丙烯酸钙的浓度为5-10％。

更优选的，聚丙烯酸钙的浓度为5％，

由于制备得到的被动层和主动层为矩形结构，为了批量生产，在制备被动层前，在上层玻璃板上贴有菲林光掩膜，被动层制备完成后，在被动层上再制备主动层，将上层玻璃取下，取1M NaCl溶液缓慢滴在下层基底玻璃板上溶解牺牲层，拆板后得到多个双层水凝胶薄膜样品，每个样品的尺寸为1*3mm，厚度约为130um，

DNA双层水凝胶薄膜传感器的变形方式包括如下步骤：

(1)将所述双层水凝胶薄传感器由弱碱性Tris-HCl缓冲溶液或空白Tris-HNO3缓冲液转移至弱酸性Tris-HCl缓冲溶液或含有Ag

弱碱性Tris-HCl缓冲溶液的pH为8.0,浓度为10mM，弱酸性Tris-HCl缓冲溶液的pH为5.0，浓度为10mM；空白Tris-HNO

(2)将形变后的双层水凝胶薄传感器转移回弱碱性Tris-HCl缓冲溶液或含有Ag

本发明的原理如下：借助于光刻技术，通过逐步光聚合得到具有智能形变特性的非对称DNA双层水凝胶薄膜传感器。将非响应性的聚丙烯酰胺水凝胶作为传感器的被动层，具有刺激响应特性的DNA功能结构的聚丙烯酰胺/DNA杂化水凝胶作为传感器的主动层。通过施加外界刺激控制DNA链中丰富功能结构的生成和解离，使主动层水凝胶的交联密度发生变化，继而引起双层水凝胶薄膜结构内部应力的重新分配，使体系呈现出可逆的宏观形状变化，继而通过测量弯曲角度实现对环境的pH和Ag+浓度的检测。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1、本发明的智能形变DNA水凝胶双层薄膜传感器的构建是借助于光刻技术，可批量获得均一的宏量样品。

2、本发明的智能形变DNA水凝胶双层薄膜传感器体积小，响应速度快，降低了成本。

3、本发明的智能形变DNA水凝胶双层薄膜传感器可通过测量双层结构弯曲角度的变化实现对pH、Ag

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1是基于两步光聚合法制备的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器的示意图。

图2(A)是pH调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜中被动层水凝胶的组成，交联单元为甲叉双丙烯酰胺。

图2(B)是pH调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜中主动层水凝胶的组成，交联单元为甲叉双丙烯酰胺和pH-调控的i-motif结构。

图3是所获得的pH调控的智能形变DNA水凝胶双层薄膜传感器的激光共聚焦图。

图4是所获得的pH调控的智能形变DNA水凝胶双层薄膜传感器冻干断面的SEM图。

图5所获得的pH调控的智能形变DNA水凝胶双层薄膜传感器的形变效果图。

图6是pH调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器对不同溶液pH的检测的激光共聚焦图片。

图7(A)是pH调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器对不同溶液pH的检测的弯曲角度图。

图7(B)是pH调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器对不同溶液pH的检测的标准曲线。

图8所获得的Ag

图9是Ag

图10(A)是Ag+或Cys-调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器对不同浓度Ag

图10(B)是Ag+或Cys-调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器对不同浓度Ag

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明，但不限定本发明的保护范围。

本发明中所用试剂均为市售的分析纯或色谱纯，DNA(1)和DNA(2)序列从生物生工公司购买得到。

实施例1：智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器的制备方法

在pH为7.0的10mM Tris-HCl缓冲溶液中加入最终浓度为4％w/v的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺(19:1)的混合溶液，最终浓度为1％w/v的V50，最终浓度为2.5mg/mL的TMR-D，将反应溶液用N

在pH为7.0的10mM Tris-HCl缓冲溶液中加入最终浓度为4％w/v的丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺(29:1)的混合溶液，最终浓度为1％wt/v的V50，最终浓度为1mM的DNA，最终浓度为2.5mg/mL的FITC-D，将反应溶液用N

图1为两步光聚合法制备pH-调控的双层水凝胶薄膜传感器的示意图。图2为双层水凝胶薄膜驱动器的组成，其中非响应性的被动层由poly(Am-co-Bis)水凝胶构成，交联单元为甲叉双丙烯酰胺；具有刺激响应特性的主动层由poly(Am-co-Bis-DNA)水凝胶构成，交联单元包括甲叉双丙烯酰胺和pH-调控的i-motif结构。激光共聚焦显微镜(CLSM)研究了双层水凝胶薄膜的微观结构。在第一步光聚合的过程中将荧光大分子染料TMR-D引入poly(Am-co-Bis)水凝胶层中,TMR-D能够发射出强烈的红光。在第二步光聚合的过程中将荧光大分子染料FITC-D引入poly(Am-co-Bis-DNA)水凝胶层中,FITC-D能够发射出强烈的绿光。利用激光共聚焦显微镜对双层水凝胶样品进行了动态三维扫描，并对扫描图像进行了三维重构。如图3所示，双层水凝胶结构在红色通道和绿色通道均显示较强的荧光特性，且红色荧光区紧贴绿色荧光区，表明poly(Am-co-Bis)水凝胶层和poly(Am-co-Bis-DNA)水凝胶层未分离是紧密结合在一起的。图4为所获得DNA双层水凝胶薄膜冻干后断面SEM图，可以看到在逐步光聚合的过程中主动层和被动层的所形成水凝胶的交联网络微观结构不同，主动层和被动层两层水凝胶之间存在一个过渡界面区域，表明两层水凝胶是紧密结合在一起的。

实施例2：pH调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器的形变方式。

用吸管吸取单个图案化双层水凝胶薄膜研究其形变行为。将满月状的水凝胶双层结构由含有碱性Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 8.0)的细胞培养皿转移至含有酸性Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH 5.0)的细胞培养皿中，观察样品的形变行为。通过将样品转移回碱性Tris-HCl缓冲溶液(10mM，pH8.0)中观察其可逆的形变行为。

图5为pH-调控的聚丙烯酰胺/DNA杂化水凝胶双层薄膜驱动器的可逆形变行为。如图5(I)所示，当杂化双层水凝胶薄膜处于pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液中(10mM，pH8.0)，其3D外观呈现满月状结构。当调节缓冲溶液的pH使其达到5.0时，双层水凝胶薄膜发生宏观形变，由最初的满月状结构转变为新月状结构，弯曲角由331°。转变为61°,如图5(II)所示。随后将环境pH恢复至pH＝8.0时，双层水凝胶薄膜再次发生形变，恢复至最初的满月状结构，弯曲角也随之恢复，如图5(III)所示。pH调控的形状变化过程比较迅速，当把环境pH由pH＝8.0调至pH＝5.0后，25min左右就能观察到明显的形状变化，整个形变过程在60min内基本完成；当把缓冲溶液的pH再次调至pH＝8.0时，水凝胶的形状在10min之内就可以完全恢复至满月状。

实施例3：智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器对pH的检测。

配制不同pH的Tris-HCl缓冲溶液，浓度均为10mM。将智能形变DNA双层水凝胶薄膜置于不同pH的Tris-HCl缓冲溶液中，置于室温条件下8小时。用激光共聚焦显微镜观察反应完成后双层薄膜传感器的3D外观结构的变化，测量反应完成后双层水凝胶薄膜在不同pH条件下的弯曲角度来实现定量检测。

图6为不同pH条件下双层水凝胶薄膜的3D外观结构。利用imageJ测量得到的不同pH条件下双层水凝胶薄膜的弯曲角度,从图7(A)中可看出随着pH的下降，双层水凝胶薄膜的弯曲角度逐渐下降。7(B)所示，在pH为5.6到7.0时，其与纵坐标弯曲角度呈现良好的线性关系，相关系数为0.9942。

实施例4：Ag+/Cys调控的智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器的形变方式。

用吸管吸取单个图案化Ag+/Cys-响应的双层水凝胶薄膜研究其驱动行为。首先观察单个样品在Tris-HNO3缓冲液(10mM Tris-HNO3,0.1mM Mg(NO3)2,pH 7.0)中的状态，并用记录其初始状态。之后将样品快速转移至含有Ag+的Tris-HNO3缓冲溶液(10mM Tris-HNO3,0.1mM Mg(NO3)2,1mM AgNO3,pH 7.0)中，观察并记录其形变行为。之后，将其迅速转移至含有半胱氨酸Cys的缓冲溶液(10mM Tris-HNO3,0.1mM Mg(NO3)2,1mM Cys,pH 7.0)的细胞培养皿中，观察并记录其形变行为。进行循环实验时，样品在含有Ag+的缓冲溶液和含有Cys的缓冲溶液中切换，观察并记录其形变行为。

图8为Ag+/Cys调控的DNA双层水凝胶薄膜的刺激响应性形变。新制备的杂化双层水凝胶薄膜在空白缓冲溶液(10mM Tris-HNO3,0.1mM Mg(NO3)2,pH7.0)中呈现半圆形的3D外观结构，图8(I)所示。向体系中加入Ag+离子后，双层水凝胶薄产生宏观形变现象，由最初的圆弧状结构转变为微弯状结构，弯曲角由278°转变为49°，图8(II)所示。之后向缓冲溶液中加Cys，双层水凝胶薄膜再次发生形变恢复至圆弧状结构，相应的弯曲角也恢复，如图8(III)所示。

实施例5：智能形变DNA双层水凝胶薄膜传感器对Ag+的检测。

用10mM/L Tris-HNO3缓冲溶液(pH＝7.0，0.1mM Mg(NO3)2)配制含有不同浓度Ag+的反应溶液。将智能形变DNA双层水凝胶薄膜置于含有不同浓度Ag+的Tris-HNO3缓冲溶液中，置于室温条件下8小时。用激光共聚焦显微镜观察反应完成后双层薄膜传感器的3D外观结构的变化，使用image J测量反应完成后双层水凝胶薄膜在不同Ag+条件下的弯曲角度来实现定量检测。

图9为不同Ag+浓度条件下双层水凝胶薄膜的3D外观结构。利用image J测量得到不同Ag+浓度条件下双层水凝胶薄膜的弯曲角度，从图10(A)中可看出随着Ag+浓度的的升高，双层水凝胶薄膜的弯曲角度逐渐下降。如图10(B)所示，在Ag+浓度为50到300uM时，其与纵坐标弯曲角度呈现良好的线性关系，相关系数为0.9977。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。