一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法

技术领域

本发明涉及色谱分离领域，具体地说，是一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法。

背景技术

蛋白糖基化和磷酸化是两种最常见的蛋白翻译后修饰过程，在蛋白质组学研究中占有重要地位。细胞信号转导、肿瘤发生、神经活动等多种生理和病理过程已被证实与蛋白质糖基化、磷酸化有关。因此，翻译后修饰蛋白的鉴定具有重要意义。近年来，质谱因其高通量、高分辨率和高效率而被广泛用于蛋白质组学中。然而，由于样品中糖基化肽和磷酸肽的丰度较低，且存在大量的干扰物质，质谱直接分析生物样品中的翻译后修饰肽段很难实现。因此，质谱分析前对生物样品进行有效的富集是精确鉴定糖基化肽和磷酸化肽的先决条件。现在已经开发出多种策略富集糖基化肽或者磷酸化肽。在糖基化肽的富集方面，亲水相互作用色谱是糖基化肽富集中应用最广泛的方法。基于亲水相互作用色谱法制备的磁性材料由于具有易分离、高的比表面积、制备简单等优点得到了较快发展。在磷酸肽的富集方面，金属氧化物亲和层析(MOAC)和固定化金属离子亲和色谱(IMAC)占据重要地位，由于磷酸化肽与金属离子和金属氧化物之间具有较强的亲和能力，已成为最常用的磷酸化肽富集方法。铜、锌、铁、镓、铝、钛、锆等金属离子或氧化物均已应用于磷酸化肽选择性富集。不同种类的金属氧化物和金属离子对磷酸肽的亲和力不同。例如，ZrO

金属有机框架(MOFs)修饰的磁性纳米材料由于具有比表面积大、活性位点多、易于功能化修饰等优点在磷酸化蛋白质组学和糖基化蛋白质组学中得到了广泛应用。金属有机框架中的金属-氧簇提供了大量的磷酸化肽的结合位点。另一方面，选用具有亲水基团的有机配体使金属有机框架具有优异的亲水性，可作为一种亲水性材料与糖基化肽结合。然而，目前的功能性磁性纳米颗粒仅可用于糖基化肽或者磷酸化肽的分离富集，急需发展既能富集糖基化肽又能富集磷酸化肽的多功能磁性纳米材料及相应使用方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法，材料的制备方法为：

(1)在氨基活化的Fe

(2)将修饰金属有机框架磁性纳米颗粒分散于5-10mg/mL植酸水溶液中，室温下剧烈搅拌5-8h，产物用水洗涤，在基质表面通过静电相互作用修饰植酸。

(3)将修饰植酸磁性纳米材料分散在过渡金属盐水溶液中，在室温条件下机械搅拌1-2h，反应结束后用去离子水洗涤材料，基于螯合作用通过植酸进一步修饰上过渡金属离子，形成具有磁性内核的MOF架构多金属修饰功能材料。

所述的氨基活化的Fe

步骤(1)的具体做法是：将50-200mg氨基活化的Fe

所述的过渡金属可为锆、钛、铜、锌中的一种或二种以上，且与步骤(1)中的过渡金属不同，即步骤(1)和(3)的过程中互不含有相同的过渡金属；步骤(3)中过渡金属盐水溶液的浓度为0.01-0.02mmol/L；步骤(1)和(3)的过程中过渡金属盐为过渡金属的可溶氯化物、硫酸盐、硝酸盐中的一种或二种以上。

使用具体步骤为：

(1)在包含糖基化肽和磷酸化肽的生物样品中在加入上样液(水-乙腈-三氟乙酸混和液)和多金属多功能磁性纳米材料，在室温下孵育15-30min；

(2)通过外部磁场将磁性纳米材料与溶液分离，弃去上清液，磁性纳米颗粒用水-乙腈-三氟乙酸混和液为清洗液清洗；

(3)先用水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混合液通过苯硼酸与糖肽特异性相互作用洗脱糖基化肽；

(4)然后用精氨酸氨水溶液通过胍基与磷酸基团特异性相互作用洗脱磷酸化肽。

所述样品可为血清、血浆、尿液、蛋白酶解液等中的一种或二种以上各类包含糖基化肽和磷酸化肽的生物样品；用量为1-10μL；所述上样液为水-乙腈-三氟乙酸混和液，其中乙腈体积含量为85-95％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，用量为100-900μL；多金属磁性纳米材料的用量为1-5mg。所述清洗液为水-乙腈-三氟乙酸混和液，其中乙腈体积含量为85-95％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，用量为200-500μL；所述糖基化肽洗脱液为水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混和液，其中乙腈体积含量为20-40％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，苯硼酸体积含量为0.5-1.5％，用量为50-500μL；所述磷酸化肽洗脱液为精氨酸氨水溶液，精胺酸浓度为0.005-0.5mol/L，氨水浓度为0.2-1mol/L，用量为50-500μL。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

(1)本发明所制备翻译后修饰多肽分离用多金属多功能磁性纳米材料的制备在磁性Fe

(2)所制备的多金属磁性纳米材料，既具备通过磁分离实现固液分离，操作方便的优势，又同时包含三种以上过渡金属离子或氧化物。未被覆盖的残余Fe

(3)所制备的翻译后修饰多肽分离用多金属多功能磁性纳米材料的MOF修饰层和固载的植酸均具有良好的亲水性，可通过亲水相互作用实现糖基化肽的高选择性和高灵敏度富集；

(4)所发展的使用方法通过分步选择性洗脱法实现糖基化肽和磷酸化肽的同时富集和分别洗脱。采用苯硼酸洗脱液选择性洗脱糖基化肽而不影响磷酸化肽的吸附；采用精氨酸(胍基)氨水溶液选择性洗脱磷酸化肽。

附图说明

附图1为一种多金属多功能磁性纳米材料的制备过程示意图；

附图2为制备的Fe

附图3为翻译后修饰多肽分离用多金属多功能磁性纳米材料的使用方法示意图；

附图4为IgG和α-casein酶解液混合液(5×10

附图5为0.5mg鼠脑蛋白胰蛋白酶酶解液经Fe

具体实施方式

以下提供一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法的具体实施方式。

实施例1

按照附图1所示方法，取750mgFe

将氨基活化的Fe

将修饰MOF磁性纳米颗粒分散于100mL植酸(7mg/mL)水溶液中,室温下剧烈搅拌6h，产物用水洗三次。

然后将材料分散在50mL Ti(SO

按照附图3所示方法，在2μL IgG和α-casein胰蛋白酶酶解液混合液(体积比1：1，5×10

实施例2

称取实施例1制备的200mg氨基活化Fe

将Fe

按照附图3所示方法，在10μL鼠脑蛋白胰蛋白酶酶解液中加入400μL上样液(92％乙腈，0.1％三氟乙酸，7.9％水)和5mg Fe

对比例1

称取实施例1制备的MOF修饰层厚度为2.6纳米的Fe

对比例2

称取200mg氨基修饰SiO

本发明的优点为：Fe

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。