利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率的方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率的方法以及该外囊泡的具体应用。

背景技术

干细胞因其具有多向分化的潜力，在再生修复医学中显示出巨大的应用前景。这其中，脂肪干细胞(Adipose derived-stem cells,ADSCs)来源丰富，易于获得，吸脂过程微创且容易被患者接受，使得其较适合在临床中转化应用。

之前的研究认为，干细胞在体内迁移到受损部位，并分化为受损的组织和细胞。然而，众多的研究在体内追踪干细胞发现：较少有干细胞存活并转化为受损细胞。近来的研究表明：干细胞的作用主要是通过其分泌的细胞外囊泡和生长因子来发挥作用的，而不是直接转化为受损的组织细胞。

细胞外囊泡(Excellular vesicles,EVs)是细胞分泌出来的混合颗粒，包括微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌体(Exosomes)，这两种颗粒分别通过出芽和形成多泡体后释放到胞外，携带着其包裹的内容物作用于受体细胞。细胞外囊泡是细胞分泌出的信号传导介质，其与细胞有本质的不同。外囊泡的应用，避免了许多细胞治疗所涉及的安全问题：如干细胞治疗会有免疫原性强、肿瘤形成的风险，可能会堵塞细小血窦。而细胞外囊泡的免疫原性很低，可进行同种异体应用。相较于生长因子的不稳定性，细胞外囊泡中的蛋白和核酸受到膜结构的保护，不易被降解，其可作为一种现成的制剂应用，具有广阔的应用转化前景。

目前，基于再生治疗目的，细胞外囊泡的生产需要培养大量的细胞，并从细胞上清液中提取与富集。然而，细胞分泌的胞外囊泡产量较低，难以达到临床治疗的需求。之前的研究报道通过低氧刺激及外加化学药物等方法可以一定程度上促进细胞分泌胞外囊泡，然而这些方法仍不能满足临床转化需要。同时，外源性地加入化学药物也可能对胞外囊泡的成分和纯度造成影响。

发明内容

本发明依托上述研究进行，提供了一种利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率的方法以及该外囊泡在皮肤创面愈合中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率的方法，包括如下步骤：

A、脂肪干细胞提取

用酶消化法对抽脂术后废弃的颗粒脂肪进行消化，提取脂肪干细胞，长满后常规传代至第3代；

B、超声刺激脂肪干细胞

第三代的脂肪干细胞长满以后，用PBS洗涤细胞两次，然后更换不含血清的低糖DMEM，将一定厚度的耦合剂均匀地涂抹在细胞培养皿下方，然后将超声发生设备的换能器与耦合剂紧密贴合以排除空气，由于作用于细胞的超声剂量过大会引起细胞发生明显凋亡，为了减少细胞凋亡，优选超声剂量设置为0.5～1.5W/cm

C、提取脂肪干细胞胞外囊泡

脂肪干细胞经超声刺激，并持续培养48小时后，收集细胞上清；用超滤法提取上清中的细胞外囊泡，溶于PBS中。

优选的，步骤A中，采用的消化酶为IV型胶原酶；

消化处理条件如下：将0.2％(m/v)的IV型胶原酶与颗粒脂肪组织按1:1的体积比进行混合，在37℃摇床上充分振荡，消化2小时。

优选的，步骤A中，脂肪干细胞常规传代至第3代时，采用流式细胞术以及成骨、成脂和成软骨三向诱导对第3代脂肪干细胞进行鉴定。

优选的，步骤B中，使用1MHz、10Hz脉冲重复频率、60％占空比、9mm

进行超声刺激时，将0.5-1cm厚的耦合剂均匀地涂抹在10cm的细胞培养皿下方，然后将超声发生设备的换能器与耦合剂紧密贴合以排除空气。

优选的，步骤C中，上清液用0.22μm滤器过滤后加入100KD膜的超滤离心管，3000g、4℃离心浓缩至内管体积500μL，移入无菌冻存管，转移至-80℃冰箱冻存。

对提取后的外囊泡进行检测：NTA检测显示，以上述超声刺激条件刺激脂肪干细胞，其分泌的囊泡数量提高60余倍；蛋白定量结果显示，经上述超声刺激脂肪干细胞，其分泌的囊泡所含蛋白量提高3倍余；Western Blot结果显示，囊泡高表达囊泡特异标志物。

本发明的第二方面，提供了根据上述方法提取得到的脂肪干细胞外囊泡，该胞外囊泡显示其平均直径为131nm，且高表达CD63、CD81及TSG101而不表达GM130。

本发明的第三方面，提供了根据上述方法制备得到的脂肪干细胞外囊泡在制备促皮肤创面愈合药物中的应用。

优选的，该促皮肤创面愈合的生物活性制剂为促进表皮细胞系和皮肤成纤维细胞活力和增殖的生物活性制剂、提高皮肤成纤维细胞迁移能力的生物活性制剂、或促进脐静脉内皮细胞系成血管能力的生物活性制剂。

本发明的第四方面，提供了一种促皮肤创面愈合的生物活性制剂，含有如上所述的脂肪干细胞外囊泡，该脂肪干细胞外囊泡的添加质量为200μg。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

效果方面，经过验证，经超声刺激脂肪干细胞后，其分泌的囊泡数量比未经超声刺激的脂肪干细胞提高60余倍；囊泡所含蛋白量提高3倍余，且高表达囊泡特异标志物。体外细胞实验显示，该胞外囊泡能够有效促进表皮细胞系和皮肤成纤维细胞活力和增殖、提高皮肤成纤维细胞迁移能力、或促进脐静脉内皮细胞系成血管能力，在促皮肤创面愈合方面效果显著。

具体实施方面，超声刺激操作简单，易进行大范围推广。

附图说明

图1显示超声刺激明显的促进了脂肪干细胞分泌胞外囊泡：A.超声刺激脂肪干细胞后提取的胞外囊泡在透射电镜下的外观；B.NTA检测胞外囊泡显示其平均直径为131nm；C.Western Blot结果显示：胞外囊泡高表达CD63、CD81及TSG101而不表达GM130；D.内吞实验显示：囊泡可以被皮肤成纤维细胞所摄取；E.NTA检测显示：以1.5W/cm

图2显示超声刺激脂肪干细胞分泌的囊泡(US-EVs)显著地促进了表皮细胞系(HACATs)和皮肤成纤维细胞(FBs)的活力和增殖：A.不同浓度US-EVs及EVs对FBs的细胞活力影响及效果对比；B.不同浓度US-EVs及EVs对HACATs的细胞活力影响及效果对比；C、D.不同浓度US-EVs和EVs对FBs的细胞增殖能力促进效果对比；E、F.不同浓度US-EVs和EVs对HACATs的细胞增殖能力促进效果对比。

图3显示超声刺激脂肪干细胞分泌的囊泡(US-EVs)显著地促进了皮肤成纤维细胞(FBs)的迁移能力：A、不同浓度US-EVs及EVs对FBs迁移促进结果；B、不同浓度EVs及EVs对HACATs迁移无明显促进效果；C、US-EVs及EVs对FBs迁移促进效果对比的统计；D、US-EVs及EVs对HACATs的迁移能力影响的统计。

图4显示超声刺激脂肪干细胞分泌的囊泡(US-EVs)显著地促进了脐静脉内皮细胞系(HUVECs)的成血管能力：A.不同浓度US-EVs及EVs对HUVECs的细胞活力影响及效果对比；B.不同浓度US-EVs及EVs对HUVECs迁移促进结果；C.不同浓度US-EVs及EVs对HUVECs体外成血管影响的显微图像；D.不同浓度US-EVs及EVs对HUVECs细胞迁移率的统计；E、不同浓度US-EVs及EVs对形成血管数目影响；F、不同浓度US-EVs及EVs对形成血管分支点影响。

图5显示超声刺激脂肪干细胞分泌的囊泡(US-EVs)显著地促进了糖尿病小鼠皮肤创面的愈合：A不同实验组第0～14天创面大小变化图片；B：不同实验组不同时期的创面面积的统计结果对比。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1：利用超声刺激提高脂肪干细胞分泌胞外囊泡效率

1、细胞提取与鉴定

脂肪干细胞的提取和鉴定：用酶消化法对抽脂术后废弃的颗粒脂肪进行消化，提取脂肪干细胞，长满后常规传代，分别通过流式细胞术和三向诱导(成骨、成脂和成软骨)对第三代脂肪干细胞(P3)进行鉴定。

进行消化处理时，采用的消化酶为IV型胶原酶；消化处理条件如下：将0.2％(m/v)的IV型胶原酶与颗粒脂肪组织按1:1的体积比进行混合，在37℃摇床上充分振荡，消化2小时。

2、超声刺激脂肪干细胞

使用1MHz、10Hz脉冲重复频率、60％占空比、9mm

对脂肪干细胞进行超声刺激时，刺激强度及时间不易过大或过强，以免引发细胞凋亡或破裂，如当超声刺激强度为1.5W/cm

3、脂肪干细胞胞外囊泡的提取

第三代脂肪干细胞长满以后，用PBS洗涤细胞两次，然后更换不含血清的低糖DMEM。(1)对于无超声刺激的细胞：持续培养48小时后，收集细胞上清液。(2)对于超声刺激的细胞：按步骤2进行超声刺激，然后持续培养48小时后，收集细胞上清。用超滤法分别提取上述不同处理的细胞上清中的细胞外囊泡，提取好的囊泡溶于PBS中，保存在-80℃冰箱中。

实施例2：脂肪干细胞胞外囊泡鉴定及分析

1、脂肪干细胞胞外囊泡的鉴定

通过透射电镜观察囊泡的形态和大小，纳米颗粒追踪分析(NTA)计算囊泡的平均直径，Western Blot检测囊泡相关特异性标志物，内吞实验验证胞外囊泡是否能被受体细胞所摄取。

内吞实验采用皮肤成纤维细胞进行，其提取方法如下：用Dispase浸泡消化包皮24小时后，去除表皮，用胶原酶消化法消化剩余的真皮，提取皮肤成纤维细胞，细胞长满后传代，用于体外研究胞外囊泡对皮肤成纤维细胞增值和迁移等功能的影响。

2、脂肪干细胞胞外囊泡定量分析

分别通过NTA和蛋白定量两种方法对提取的囊泡进行定量分析

(1)NTA定量：取少量的囊泡溶液，用PBS缓冲液稀释到约300μL体积，分析颗粒数和颗粒直径等的分布，记录上机的稀释倍数，以便于与蛋白定量进行换算。

(2)蛋白定量(BCA法)：采用碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒进行定量检测，配制不同浓度的蛋白标准品，并将囊泡进行一定倍数的稀释，将适当体积的蛋白标准品和囊泡加入到96孔板中，加入工作液进行反应，通过各孔的吸光值计算囊泡的蛋白浓度。

结果如图1所示，透射电镜下显示，超声刺激脂肪干细胞后提取的胞外囊泡呈不规则圆形(图1A)；NTA检测胞外囊泡显示其平均直径为131nm(图1B)；Western Blot结果显示：胞外囊泡高表达CD63、CD81及TSG101而不表达GM130(图1C)，1.5W/cm

实施例3：效果验证

1、细胞活力检测

分别将表皮细胞系(HACATs)及皮肤成纤维细胞(FBs)接种在96孔板中，分别加入不同浓度(20、50、100、150、200μg/mL)的未处理的脂肪干细胞胞外囊泡(EVs)和超声刺激的脂肪干细胞胞外囊泡(US-EVs)，培养72小时，用CCK-8试剂盒按说明书步骤测量450nm下细胞OD值，细胞活力通过如下公式计算：

细胞活力＝(治疗组细胞OD值/对照组OD值)×100％

通过细胞活力的结果确定后续体外实验使用囊泡的剂量。

2、细胞增殖检测

将表皮细胞系(HACATs)和皮肤成纤维细胞(FBs)分别接种在96孔板中，分别加入不同浓度(根据上述细胞活力检测确定)的未处理的脂肪干细胞胞外囊泡(EVs)和超声刺激的脂肪干细胞胞外囊泡(US-EVs)，孵育48小时后，按照EdU检测试剂盒的说明书对细胞进行荧光染料的标记和固定，通过荧光显微镜观察并计算细胞增殖率。细胞增殖率按照如下公式计算：

细胞增值率＝(EdU阳性细胞数/接种细胞总数)×100％

上述实验结果如图2所示，US-EVs相比于EVs，明显地促进了FBs的细胞活力(图2A)以及细胞增殖能力(图2C、D)，其呈剂量依赖性；US-EVs能促进HACATs细胞的活力，但与EVs相比无明显差异，且不同剂量US-EVs对细胞活力促进效果差别不明显，高浓度(200μg/mL)US-EVs对细胞活力促进效果反而低于低浓度US-EVs(图2B)，但能明显地促进了HACATs的细胞增殖能力(图2E、F)。

3、细胞迁移检测

细胞迁移通过划痕实验进行检测，分别将表皮细胞系(HACATs)、皮肤成纤维细胞(FBs)及脐静脉内皮细胞系(HUVECs)接种到6孔板中，待细胞长满6孔板以后，对细胞进行划痕，加入无血清/含1％血清的DMEM，划痕后拍照计为0h，实验组加入不同浓度的EVs和US-EVs,对照组加入等体积的PBS，24h以后拍照计为24h，分别测量0h和24h的划痕面积，并通过如下公式计算细胞迁移率：

细胞迁移率＝(0h划痕面积-24h划痕面积)/0h划痕面积×100％。

结果参见图3，US-EVs相比于EVs明显地促进了FBs的迁移能力，高浓度US-EVs促进迁移效果优于低浓度(图3A、C)；US-EVs相比于EVs,无明显地改变HACATs的迁移能力(图3B，D)。

4、脐静脉内皮细胞成管能力的检测

将Matrigel平铺在96孔板的底部，放入培养箱中20min待其凝固后，将脐静脉内皮细胞系(HUVECs)接种到Matrigel上，加入低糖DMEM，实验组加入不同浓度的EVs和US-EVs,对照组加入等体积的PBS，6h以后镜下观察成管情况并拍照，通过软件统计成管数量。

结果参见图4，US-EVs相比于EVs，明显地促进了HUVECs的细胞活力(图4A)；US-EVs相比于EVs,明显地促进了HUVECs的迁移能力(图B、D)US-EVs相比于EVs,明显地促进了HUVECs的血管生成(图4C)，血管数目及分支点明显优于EVs(图4E、F)。

5、糖尿病小鼠皮肤创面模型的构建和治疗步骤

购买7周龄大小的，敲除db基因的，雌性c57小鼠(糖尿病鼠)32只，常规饲养在SPF环境下1周以适应环境。从第8周开始，小鼠随机均分成4组：

(1)PBS组：小鼠背部制作创面，使用PBS治疗；

(2)HA+PBS组：小鼠背部制作创面，使用100μL透明质酸凝胶(HA)+100μL PBS治疗；

(3)HA+EV组：小鼠背部制作创面，100μL HA+200μL EVs(溶液体积为100μL，EVs终浓度为1μg/μL)治疗；

(4)HA+US-EV组：小鼠背部制作创面，100μL HA+200μg US-EVs(溶液体积为100μL，EVs终浓度为1μg/μL)治疗；

皮肤创面模型建立过程如下：用小动物麻醉剂将小鼠麻醉，用直径6mm的角膜环钻在小鼠背部划出一个圆形划痕，用眼科剪沿着划痕剪开皮肤，深达深筋膜层，剪去全层皮肤，皮肤创面按照上述分组进行治疗，将不同制剂部分敷贴在创面表面，部分注射在创缘周围的皮下。

6、皮肤创面治疗效果的评估：

大体观：分别对第0天、第3天、第7天、第10天及第14天的皮肤创面进行拍照，肉眼观察皮肤创面的愈合情况、渗出情况及是否有感染情况，并通过Image Pro Plus 6.0计算创面面积的大小，评估各组创面大小的变化情况。

结果参见图5，第3天，四个实验组的皮肤愈合情况类似，随着时间推移，US-EVs组皮肤愈合情况明显优于其他组，第14天时，该组皮肤几乎完全愈合，其他三组仍存在皮肤损伤情况(图5A、B)。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。