玉米ZmAGA1基因用于提高植物抗旱性的应用

技术领域

本发明涉及玉米ZmAGA1基因的新应用，具体涉及通过提高玉米ZmAGA1基因表达水平用于提高玉米抗旱性应用。

背景技术

干旱严重威胁作物生产。棉子糖是植物中特有的一类游离寡糖，在干旱、高温、低温和高盐等逆境胁迫下被大量诱导积累，参与植物的抗旱、耐热、耐冷及耐盐等响应

1.Downie,B.；Gurusinghe,S.；Dahal,P.；Thacker,R.R.；Snyder,J.C.；Nonogaki,H.；Yim,K.；Fukanaga,K.；Alvarado,V.；Bradford,K.J.,Expression of a GALACTINOLSYNTHASE gene in tomato seeds is up-regulated before maturation desiccationand again after imbibition whenever radicle protrusion is prevented.PlantPhysiol 2003,131(3),1347-59.

2.Koster,K.L.；Leopold,A.C.,Sugars and desiccation tolerance inseeds.Plant Physiol1988,88(3),829-32.

3.Egert,A.；Eicher,B.；Keller,F.；Peters,S.,Evidence for water deficit-induced mass increases of raffinose family oligosaccharides(RFOs)in theleaves of three Craterostigma resurrection plant species.Front Physiol 2015,6,206.

4.Porter,J.E.；Herrmann,K.M.；Ladisch,M.R.,Integral kinetics ofα-galactosidase purified from Glycine max for simultaneous hydrolysis ofstachyose and raffinose.1990,35(1),15-22.

5.Kuo,T.M.,Contente of raffinose oligosaccharides and sucrose invarious plant seeds.J.Agric.Food Chem.1988,36,32-36.

发明内容

本发明发现并鉴定了玉米ZmAGA1基因(GRMZM2G340656)突变体提高了ZmAGA1基因的表达量，增强植物的抗旱能力。基于此，本发明提供了玉米ZmAGA1基因用于提高植物抗旱性的应用，所述玉米ZmAGA1基因序列如SEQ ID NO:1所示，或者，所述玉米ZmAGA1基因编码SEQ ID NO:2所示蛋白序列。

进一步，所述玉米ZmAGA1基因在植物中高表达提高植物抗旱性。

进一步，通过在玉米ZmAGA1基因5′端启动子处插入Mutator 1转座子实现玉米ZmAGA1基因在植物中的高表达；所述Mutator 1转座子插入序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明同时提供了一种抗旱植物的育种方法。所提供的方法包括：在植物中高表达玉米ZmAGA1基因。进一步方案中，方法包括：通过在在玉米ZmAGA1基因5′端启动子处插入Mutator 1转座子实现玉米ZmAGA1基因在植物中的高表达；所述Mutator 1转座子插入序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了抗旱玉米品系的育种方法。具体方案中所提供的方法包括：将玉米中的ZmAGA1基因进行激活提高其表达水平获得抗旱玉米品系。还有些具体方案中通过在在玉米ZmAGA1基因5′端启动子处插入Mutator 1转座子实现玉米ZmAGA1基因在玉米中的激活；所述Mutator 1转座子插入序列如SEQ ID NO:3所示。

附图说明

图1为实施例中玉米zmaga1纯合突变体鉴定；(A)为ZmAGA1基因结构及Mutator插入位点(即ZmAGA1翻译起始位点上游-1078bp处)，黑色框表示基因编码序列，白色框表示5’UTR和3’UTR区；(B)为PCR鉴定NS及zmaga1纯合突变体，引物位置在图(A)标注；(C)为RT-PCR鉴定ZmAGA1的mRNA表达水平，显示ZmAGA1的mRNA在zmaga1纯合突变体中表达量较对照NS株系明显提高。叶片ZmGAPDH为内参；(D)为Western blot鉴定ZmAGA1的蛋白在zmaga1纯合突变体中表达量较对照NS株系明显提高；ZmGAPDH为内参；NS：zmaga1自交分离野生型；zmaga1：ZmAGA1纯合突变体。

图2为zmaga1纯合突变体干旱表型鉴定；(A)为zmaga1纯合突变体和NS干旱处理前的表型；(B)为zmaga1纯合突变体和NS干旱处理后的表型；(C)为zmaga1纯合突变体和NS干旱处理后并复水恢复5天的表型；标尺5cm；NS：zmaga1自交分离野生型；zmaga1：ZmAGA1纯合突变体。

图3为zmaga1纯合突变体较对照NS株系抗旱能力提高；(A)zmaga1纯合突变体干旱处理后幼苗存活率较对照NS株系显著升高。数据表示均值±标准误；(B)zmaga1纯合突变体干旱处理后幼苗电导率较对照NS株系显著降低，数据表示均值±标准误，*表示NS与zmaga1之间差异显著,(Student’s t-test，p<0.05)；***表示NS与zmaga1之间差异显著,(Student’s T-test，p<0.001)；NS：zmaga1自交分离野生型；zmaga1：ZmAGA1纯合突变体。

具体实施方式

除非另有说明，本文中的术语根据相关领域技术人员的常规认识理解。

以下是发明人提供的具体实施例，以对本发明的技术方案做进一步解释说明。如无特殊说明以下实施例所用试剂及材料均为市售产品。

实施例：

该实施例中发明人获得并鉴定了一个转座子插入zmaga1突变体，该突变体ZmAGA1基因的mRNA和蛋白表达水平提高，植株抗旱。

该实施例所用引物序列如下，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；

ZmAGA1-F：5′AGGCTAGTTTGTCGAGCGTC-3′

ZmAGA1-R：5′GAGTAGACGAGCATCAGGGC-3′

TIR6:5′AGAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC-3′

zmaga1杂合突变体材料来自ChinaMu突变体库(

zmaga1纯合突变系为zmaga1杂合突变体自交分离产生；

野生型(NS)为zmaga1杂合突变体自交分离产生的对照株系。

通过对zmaga1自交产生分离的纯合突变株系和自交分离野生型(NS)进行zmaga1突变体鉴定(图1)；

利用基因特异性引物ZmAGA1-F和TIR6引物对zmaga1纯合突变株系进行PCR扩增并进行测序，测序结果为SEQ ID NO:4所示；

利用基因特异性引物ZmAGA1-R和TIR6引物对zmaga1纯合突变株系进行PCR扩增并进行测序，测序结果为SEQ ID NO:5所示；

以及ZmAGA1R和TIR6引物分别对zmaga1纯合突变株系进行PCR扩增并进行测序，测序结果为确定转座子插入位点位于ZmAGA1翻译起始位点上游-1078bp处(即玉米ZmAGA1基因5′端启动子处)。

进一步，利用RT-PCR对上述实施例中的野生型NS和zmaga1纯合突变体的ZmAGA1mRNA水平进行鉴定，结果显示zmaga1纯合突变体中ZmAGA1基因mRNA表达水平明显高于野生型(NS)；

RT-PCR扩增程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃终延伸8min；

RT-PCR特异性引物序列：

AGA1 RT-F 5’-AACGGCCTTCAGAGCCTGTC-3’

AGA1 RT-R 5’-GGCTTGGTCTGGAACTTGGT-3’

GAPDH RT-F：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’

GAPDH RT-R：5’-AACCTTCTTGGCACCACCCT-3’

利用Western blot对上述野生型(NS)和zmaga1突变体的ZmAGA1蛋白水平进行鉴定，结果显示zmaga1纯合突变体中ZmAGA1基因蛋白表达水平明显高于野生型(NS)。

进一步，对上述实施例中的zmaga1纯合突变体和野生型NS的抗旱性鉴定：

将zmaga1纯合突变体及野生型NS种子分别在发芽纸上萌发3天，各取5粒发芽一致的种子种植于同一小盆中并进行控重，每小盆的最终质量控制在160g；幼苗培养条件为25℃，16光照/8h黑暗的光周期，培养至两叶期进行持续干旱处理(停止浇水15天)，待表型出现后拍照记录，并浇水进行恢复处理，恢复5天后测定幼苗存活率和叶片电导率。

幼苗存活率测定：统计每个小盆中恢复后存活的幼苗数和总苗数，利用公式(存活数/幼苗总数)×100％计算幼苗存活率；利用Student’s t-test检测NS与zmaga1之间的差异显著性(*表示0.01

叶片电导率检测：将每盆中的5株幼苗混合，作为一个生物学重复，置于干净的试管中，加入15mL去离子水中，抽真空30min，25℃、120rpm处理1h后测定电导率，记录为k1；随后将叶片沸水浴20min，冷却至室温，混合均匀测定电导率，记录为k2；利用公式(k1-k0)/(k2-k0)×100％，计算叶片电导率，k0是去离子水的电导率；电导测定仪型号：雷磁DDS-307。

上述实施例说明在ZmAGA1翻译起始位点上游-1087bp处插入序列如SEQ ID NO:4所示转座子，使得纯合突变系中的ZmAGA1表达量升高，幼苗抗旱能力增强。适用于本发明的高表达实现或激活手段不限于此，本领域技术人员在本发明公开的基础上，结合公知常识可知，通过任何遗传学及分子生物学手段使得普通或现有玉米品系提高其ZmAGA1基因的表达量以获得/增强玉米抗旱性的现象均适用于本发明。

本发明所涉及核苷酸序列：

SEQ ID NO:1：

ZmAGA1基因核苷酸序列

(>GRMZM2G340656_chromosome:AGPv3:7:19063729:19083475:1)

ATGACGGTGACGCCACGGATCACGGTGAGCGACGGGCGGCTGACGGTGCGCGGCCGTACGGTGCTCACCGGCGTGCCGGACAACGTGTCGGCGGCGCACGCGGCCGGGGCGGGGCTCGTCGACGGGGCCTTCGTCGGCGCCCACGCCGGCGAGGCCAAGAGCCACCACGTCTTCACCTTCGGCACGCTCCGGGACTGCCGGTTCCTGTGCCTGTTCCGGTTCAAGCTGTGGTGGATGACGCAGCGGATGGGCGTCTCCGGCCGCGACGTCCCTCTGGAGACCCAGTTCATGCTCGTCGAGGTCCCTGCCAGTGACGGCGACGGCGACGACGCCCCCGCGTACGTGGTGATGCTTCCGCTGCTGGAGGGGCAGTTTCGGGCAGCGCTGCAGGGGAACGACCGCGACGAGCTGCAGATCTGCATCGAGAGCGGGGACAAGGCGGTGCAGACGGACCAGGCCGCGCACATGGTGTACCTCCACGCCGGCGACAACCCCTTCGACACCGTCACCGCCGCCGTCAAGGCGGTGGAGAAGCACCTGCAGACGTTCCACCACCGCGACAAGAAGAAGCTGCCGTCGTTCCTCGACTGGTTCGGCTGGTGCACCTGGGACGCCTTCTACACCGACGTCACCGCCGACGGCGTCAAACACGGCCTTCAGAGCCTGTCCAAGGGCGGCGCGCCGCCGCGGTTCCTCATCATCGACGACGGCTGGCAGCAGATCGCCTCCGAGAACAAGCCCGACCCCAACGTCGCCGTCCAGGAGGGCGCGCAATTCGCCAGCCGGCTGACCGGGATCAAGGAGAACACCAAGTTCCAGACCAAGCCCGACGGCGACGGCGACGGCGAGCAGGCGCCGGGCGGGCTGAAGCGACTGGTGGCCGAGACCAAGGACGCGCACGGCGTGAAGCAGGTGTACGTGTGGCACGCCATGGCCGGGTACTGGGGCGGCGTGACGCCGACGGCGGGGACGGCGATGGAGCGCTACGAGCCGGCGCTGGCGTACCCCGTGCAGTCCCCGGGCGTGACGGGCAACCAGCCGGACATCGTCATGGACTCGCTGTCCGTCCTGGGGCTGGGCCTGGTGCACCCGCGCCGGGTGCGGGACTTCTACGGCGAGCTCCACGCGTACCTCGCCTCCTGCGGCGTCGACGGCGTCAAGGTGGACGTGCAGAACATCATCGAGACGCTGGGCGCCGGCCACGGCGGCCGCGTCGCCATCACCCGCGCCTACCACCGCGCGCTCGAGGCCTCCGTGGCGCGCAGCTTCCCGGACAACGGCTGCATCTCCTGCATGTGCCACAACTCCGACATGCTCTACAGCGCCAGGCAGACTGCCGTCGTGCGCGCCTCCGACGACTTCTACCCGCGCGACCCGGCATCGCACACCGTCCACGTCGCCTCCGTCGCGTACAACACCGTCTTCCTCGGCGAGTTCATGCAGCCCGATTGGGACATGTTCCATAGCTTGCATCCGGCGGCGGAGTACCACGGCGCGGCGAGGGCCATCGGTGGCTGCCCGATATACGTCAGCGACAAGCCGGGGAACCACAACTTCGAGCTGCTCAGGAAGCTCGTGCTCCCCGACGGCACCGTGCTACGCGCGCAGCTTCCCGGCCGGCCCACACGGGACTGCCTCTTCTCCGACCCGGCGCGCGACGGCGCGAGTTTGCTCAAGATTTGGAACCTGAACAAGTGCGGTGGCGTGGTGGGTGTGTTCAACTGCCAGGGAGCCGGGTGGTGCCGCGTGACCAAGCGGACGCGCGTGCACGACGCGTCGCCGGGCACGCTGACCGGCACCGTGCGTGCCGACGACGTCGACGCCATAGCGCGCGTCGCTGGTGACGGCGGCGGGTGGGACGGCGAGACCGTGGTGTATGCGCACCGCACGCGGGAGCTAGTGCGACTGCCCCGGGGCGTCGCGCTGCCTGTGACGCTAGGCCCGCTCCAGTATGAGGTGTTCCATGTGTGCCCGCTCCGCGCCGTCGTGCCGGGGTTCTCGTTCGCGCCCGTCGGGCTGCTCGATATGTTCAACGCTGGGGGCGCCGTTGAGGAGTGCGACGTGATCAGCAATGTCGGCGGCAAGGCCATGGCTCTCAGGGTTCGCGGGTGCGGTCGGTTCGGCGCTTACTGCTCGCGGGAGCCGGCGAGGTGTCTATTGGACTCGGCGGAAGTGGAGTTCAGCTACGATGCCGACACCGGCCTCGTGTCCGTCGACCTGCCCGTGCCGGAGCAGGAGCTATATCGGTGGACGCTGGAGATTATGGTCTAG

SEQ ID NO:2：

ZmAGA1基因编码的蛋白序列

>GRMZM2G340656_chromosome:AGPv3:7:19063729:19083475:1

MTVTPRITVSDGRLTVRGRTVLTGVPDNVSAAHAAGAGLVDGAFVGAHAGEAKSHHVFTFGTLRDCRFLCLFRFKLWWMTQRMGVSGRDVPLETQFMLVEVPASDGDGDDAPAYVVMLPLLEGQFRAALQGNDRDELQICIESGDKAVQTDQAAHMVYLHAGDNPFDTVTAAVKAVEKHLQTFHHRDKKKLPSFLDWFGWCTWDAFYTDVTADGVKHGLQSLSKGGAPPRFLIIDDGWQQIASENKPDPNVAVQEGAQFASRLTGIKENTKFQTKPDGDGDGEQAPGGLKRLVAETKDAHGVKQVYVWHAMAGYWGGVTPTAGTAMERYEPALAYPVQSPGVTGNQPDIVMDSLSVLGLGLVHPRRVRDFYGELHAYLASCGVDGVKVDVQNIIETLGAGHGGRVAITRAYHRALEASVARSFPDNGCISCMCHNSDMLYSARQTAVVRASDDFYPRDPASHTVHVASVAYNTVFLGEFMQPDWDMFHSLHPAAEYHGAARAIGGCPIYVSDKPGNHNFELLRKLVLPDGTVLRAQLPGRPTRDCLFSDPARDGASLLKIWNLNKCGGVVGVFNCQGAGWCRVTKRTRVHDASPGTLTGTVRADDVDAIARVAGDGGGWDGETVVYAHRTRELVRLPRGVALPVTLGPLQYEVFHVCPLRAVVPGFSFAPVGLLDMFNAGGAVEECDVISNVGGKAMALRVRGCGRFGAYCSREPARCLLDSAEVEFSYDADTGLVSVDLPVPEQELYRWTLEIMV

SEQ ID NO:3：

Mutator1转座子序列

GTAATTTTGGGGAGAGATAATTGCCATTATGGACGAAGAGGGAAGGGGATTCGACGAAATGGAGGCGTTGGCGTTGGCTTCTCTGTTTTGGAGACGCACGCGACAGCCAAACTCCAAAACGGATACGAGACAGCTCTTGGGGCTGCGTAAACAGGTATTAGTTTTCTGTCCCCGTTTACCGTTCCCGTGCGCAGACGCCGTCACGCGTACTCTTCTTGTCTCCGTCGCCGCGCTCTACGGCAGCACGGCGGTGCTGGCGTACGTGCTGTACTCCGCGCCGGCAGAGGCCGCGCGCGCGTCGCCCGCGGACGACGCCACGCCGCTCCACCTCGCCGCGGCCGCGCACATCCTCCTCGCCGCGAGCGCGTCCGCGGACGCGCGCGCCTTCTCGGGCCTCCACGCCGGGGACCTCCTCCTCCCGCGCGCCAACGAGGCCGCCGCCGCCGCGGACCGGGCTCCGCGTGCTCCTCAAGTTCCCCGCGGTGTCACTGTCGTCCTCGCCCAAGAAGTCCGCCTCGCCGCCGCCGGCCCCGGAGGCGAGGAAGGAGTACCCGCCCGACCTGACGCTGCCGGACCTCAAGAGCGGGCTGTTCAGCACCGACGAGCAACGGACGCACCTTCCACCTGTCCTAGCACTAATTACTCCTAAATTCATCATACACCAAAGTTTCAATTAGTAAAAGGTTTTGGTATTATTTTCTTTACAAGACTAAAAGCATCCACTCGTATTTGCCATGGAAATATTGCCAAAATGGTTACCGAAGGAACCAATGAAAAATGGCGGTATCCGTCCACCTGTAGCTTGTCCAAGGCTCTTCCAGCAGAGTAGTGCCGCCATGACGATTGACAGAGACACGAGACGAAACAAGCTGAAGGTCCCCGCGGCGTCACTGTCGTCCTCGCCGAAGAAGTCCGCCTCGCCGCCGCCGGCCCCGGAGGCGAGGAAGGAGTACCCGCCCGACCTGACGCTGCCCACCGTGTCGCCGCCGCCGCCCAACGGCCTCGGCGACATGCTCAGCCCAGCGGCCTGGCCCTCCTCCCCCGCGAGCAGGCTCAACAAGGCCGCGCTCGGCGGCGGCCGGGACCTAGACCTAGACCAGTACCAGCACATGTTGTTCGACAAGGTGTCGTCGTCGAGGGCCAGTAGGAGACAAGAAGAGTACGCGTGACTGAGATGCGACGGAGAAAAAGGGTACGCGTGACGGCGTCTGTACACGGGAACGGTAAATGAGGACAGGAAACTAATAACTGTTTACGCAGCCCCAAGTGCTGTCTTGTGTCCGTTTTAGAGTTTGGCTGTCGCGTACGTCTCTAAAACAGAGAAGCCAACGCCAACGCCTCTATTTCGTCGAATCCGCTTCTCTCTTCGTCCATAATGGCAATTATCTCTTTTGGGGAAA

SEQ ID NO:4：

F+Mu转座子上游序列

CTTGCTAATGCGTTCGGCAAGGACGGTCAGCAGTCGTCTACAGTTGACGACAGTTAACTAGGCCGAGTG

SEQ ID NO:5：

R+Mu转座子下游序列

TATTAGAGGGGAAGCCCCAGCCAACGCCTCCATTTCGTCGAATCCGCTTCTCTCTTCGTCCATAATGGCAATTAT