蛋白FocVPS41在调控香蕉枯萎菌致病力中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及蛋白FocVPS41在调控香蕉枯萎菌致病力中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病，又称巴拿马病，黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的土传性真菌流行病害，易发生难防治，尤其是枯萎菌4号小种(Foc TR4)对香蕉产业造成了毁灭性的打击。充分挖掘香蕉枯萎菌致病相关基因并研究其相关基因功能，有助于全面了解香蕉枯萎菌的致病分子机理，为香蕉枯萎病的综合防控提供理论基础。

VPS41是HOPS复合体(Homotypic fusion and vacuole sorting,同型融合与液泡分选)的重要组份之一。FocVPS41在镰刀菌中具有高度保守性，关于FocVPS41在香蕉枯萎菌中的具体功能尚不清楚。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的是公开一种香蕉枯萎菌基因FocVPS41及蛋白FocVPS41的新功能。基因FocVPS41编码区由SEQ ID NO：1中第206至652位、第702至728位、第778至1769位、第1822至3565位、第3620至4426位所示的核苷酸序列组成，其所编码的蛋白FocVPS41为SEQ ID NO：2所示的蛋白质。本发明利用Split-marker策略，通过PCR扩增获得FocVPS41含有潮霉素抗性基因的上、下游同源片段，将其导入香蕉枯萎菌原生质体；利用同源重组方法将FocVPS41基因从香蕉枯萎菌中敲除，获得敲除突变体ΔFocVPS41；通过构建基因回补载体，将其导入ΔFocVPS41原生质体；利用随机插入的方法将该基因回补到敲除突变体中，获得回补突变体ΔFocVPS41-Com。该基因的敲除突变体在分生孢子产生方面存在缺陷，并且菌落直径减小，对细胞壁胁迫因子刚果红耐受性下降，提高了对渗透压调节剂山梨醇和农药氰烯菌酯耐受性。致病性测定表明，敲除突变体ΔFocVPS41致病性显著降低；回补突变体ΔFocVPS41-Com的致病性则恢复到Foc4水平。上述试验证明，香蕉枯萎菌FocVPS41为香蕉枯萎菌的致病相关基因。

本发明技术方案主要包括以下内容：

本发明提供蛋白FocVPS41在调控香蕉枯萎菌致病力中的应用，所述蛋白FocVPS41的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述应用是通过敲除蛋白FocVPS41的编码基因或抑制蛋白FocVPS41的编码基因的表达来降低香蕉枯萎菌致病力。

所述敲除蛋白FocVPS41的编码基因或抑制蛋白FocVPS41的编码基因的表达可以通过利用靶向该基因的物质或基因工程手段完成。

进一步的，所述蛋白FocVPS41的编码基因由SEQ ID NO：1中第206至652位、第702至728位、第778至1769位、第1822至3565位、第3620至4426位所示的核苷酸序列组成。

进一步的，所述应用是所述蛋白FocVPS41在抑制香蕉枯萎菌生长发育中的应用。

进一步的，所述应用是所述蛋白FocVPS41在降低香蕉枯萎菌产孢量中的应用。

进一步的，所述应用是所述蛋白FocVPS41在降低香蕉枯萎菌抗细胞壁胁迫中的应用。

进一步的，所述细胞壁胁迫为刚果红胁迫。

本发明提供一种蛋白FocVPS41作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述的植物病害是由香蕉枯萎菌导致的香蕉枯萎病。

进一步的，所述的香蕉枯萎菌为香蕉枯萎菌4号生理小种(Foc4)。

本发明还涉及蛋白FocVPS41在调控香蕉枯萎菌抗渗透压胁迫、抗氰烯菌酯中的应用，所述应用是通过敲除基因FocVPS41或抑制基因FocVPS41的表达来提高香蕉枯萎菌抗渗透压胁迫。

本发明还涉及一种香蕉枯萎菌FocVPS41基因敲除突变体，该突变体通过敲除蛋白FocVPS41的编码基因而获得。

与现有技术相比，本发明所取得的显著效果：

本发明提供了蛋白FocVPS41及其编码基因的新功能。基因FocVPS41的编码区为由SEQ ID NO：1中第206至652位、第702至728位、第778至1769位、第1822至3565位、第3620至4426位所示的核苷酸序列组成，其所编码的蛋白FocVPS41为SEQ ID NO：2所示的蛋白质；FocVPS41蛋白含有“SCOP d1fwxa2”“Clathrin”“RING”等3个保守结构域。本发明将潮霉素磷酸转移酶基因(HPH)置换基因FocVPS41，得到Foc4敲除突变体ΔFocVPS41；试验证明，与Foc4相比，ΔFocVPS41菌落直径变小且产孢量显著降低，对细胞壁胁迫因子刚果红耐受性下降，提高了对渗透压调节剂山梨醇和农药氰烯菌酯耐受性；致病性试验表明，FocVPS41的缺失使Foc4的致病力显著降低；将该基因回补后，其致病力得到恢复。本发明证实FocVPS41是香蕉枯萎菌分生孢子的产生、应对细胞壁胁迫、渗透压胁迫、杀菌剂氰烯菌酯等胁迫因子以及致病性等方面所必需的。我们的研究有助于深入阐明香蕉枯萎菌的致病分子机制，为开发有效杀菌剂提供了靶标基因。

附图说明

图1是香蕉枯萎菌FocVPS41基因敲除和回补载体构建示意图；图中，A：FocVPS41基因敲除敲除构建示意图，B：FocVPS41基因回补载体构建示意图。

图2是部分候选FocVPS41基因敲除转化子outside引物和inside引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3是部分候选FocVPS41基因回补转化子HYG引物、NEO引物和FocVPS41inside引物PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图4是香蕉枯萎菌FocVPS41基因敲除、回补转化子的Southern杂交分析；图中，A：Southern杂交转膜前的凝胶电泳图，B：FocVPS41基因敲除、回补转化子Southern杂交。

图5是香蕉枯萎菌FocVPS41基因敲除、回补转化子菌落形态；图中，A：FocVPS41基因敲除、回补转化子在PDA培养5d的菌落形态，B：FocVPS41基因敲除、回补转化子的菌落疏水性，C：FocVPS41基因敲除、回补转化子菌落的纵切面，D：FocVPS41基因敲除、回补转化子生长曲线图。

图6-A、图6-B、图6-C是FocVPS41基因敲除转化子显微观察；图6-A：FocVPS41基因敲除转化子菌丝顶端、分生孢子簇及分生孢子；图6-B：FocVPS41基因敲除转化子产孢量测定；图6-C：FocVPS41基因敲除转化子分生孢子大小测定。

图7-A、图7-B是FocVPS41基因敲除转化子对不同胁迫条件的分析；图7-A：菌落直径；图7-B：菌落生长抑制率。

图8-A、图8-B、图8-C是FocVPS41基因敲除和回补转化子的致病性分析；图8-A：FocVPS41基因敲除和回补转化子接种巴西蕉小苗1个月后的发病症状；图8-B：病情指数；图8-C：接种巴西蕉发病球茎的相对真菌生长量测定。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

1.实验材料

1.1供试菌株及植物

供试菌株为香蕉枯萎菌4号生理小种(Foc4)，供试植物为5-6片叶(株高10～15cm)的巴西蕉(Cavendish,AAA)。

1.2宿主菌及质粒载体

宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株和酵母菌XK-125(南京农业大学张海峰老师惠赠)。载体pKOV21(华中农业大学陈小林老师惠赠)，基因回补载体为pYF11-NEO(安徽农业大学张承启老师惠赠)。

2.实验方法

2.1香蕉枯萎菌FocVPS41基因上游和下游同源片段的扩增

香蕉枯萎菌FocVPS41基因敲除采用Split-marker策略扩增上游和下游同源片段，如图1所示，分别选取FocVPS41基因的上游和下游长度约3kb的序列，设计引物(表1)。

表1.FocVPS41基因敲除和回补引物

采用Split-marker策略进行PCR扩增FocVPS41上游和下游同源重组片段。分别进行2轮PCR扩增。第1轮PCR扩增，分别为：以Foc4基因组DNA为模板，用引物VPS41-LBCK和VPS41-LB-R进行PCR扩增，获得FocVPS41基因的同源臂VPS41-LB1；用VPS41-RB-F和VPS41-RBCK进行PCR扩增，获得FocVPS41基因的同源臂VPS41-RB1；以载体pKOV21质粒DNA为模板，引物HYG-F和HYG-R进行PCR扩增，获得潮霉素抗性基因片段HYG-1.4kb；上述第1轮PCR扩增产物用OMEGA Gel Extraction Kit进行纯化回收，用Nanodrop-2000c进行DNA浓度测定，将回收产物浓度稀释为50ng/μL，作为第2轮PCR扩增的模板DNA；第2轮PCR扩增FocVPS41基因含有HYG部分序列的同源重组片段，分别为：以VPS41-LB1和HYG-1.4kb为模板，引物VPS41-LB-F和HYG-R1进行Over-Lap PCR扩增，获得FocVPS41基因的上游同源重组片段VPS41-HYG-LB2；以VPS41-RB1和HYG-1.4kb为模板，引物HYG-F1和VPS41-RB-R进行Over-Lap PCR扩增，获得FocVPS41基因的下游同源重组片段VPS41-HYG-RB2。

第1轮PCR反应体系为：

第1轮PCR反应条件为：95℃反应5min；95℃反应15sec，58℃反应15sec，72℃反应2min，共35个循环；72℃反应5min。使用OMEGA Gel Extraction Kit对PCR扩增产物进行纯化回收。

第2轮PCR反应体系为：

第2轮Over-Lap PCR反应条件为：95℃反应3min；95℃反应15sec，58℃反应45sec，72℃反应2min，共32个循环；72℃反应5min。使用OMEGA Gel Extraction Kit对PCR扩增产物进行纯化回收。

2.2香蕉枯萎菌FocVPS41基因回补片段的扩增

香蕉枯萎菌FocVPS41基因回补载体的构建如图1所示。选取FocVPS41基因的上游1.8kb的启动子序列，下游为FocVPS41去除终止密码子的序列，设计引物VPS41-Native-1F和VPS41-6045R(表1)。

以Foc4基因组DNA为模板，用引物VPS41-Native-1F和VPS41-6045R进行PCR扩增，获得FocVPS41基因回补片段FocVPS41-Com-6.0kb；用OMEGA Gel Extraction Kit进行纯化回收，用Nanodrop-2000c进行DNA浓度测定。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：95℃反应5min；95℃反应15sec，60℃反应15sec，72℃反应4min，共32个循环；72℃反应5min。使用OMEGA Gel Extraction Kit对PCR扩增产物进行纯化回收。

2.3香蕉枯萎菌FocVPS41基因回补载体的构建

pYF11-NEO质粒DNA用XhoI单切线性化，切胶回收线性化pYF11-NEO(XhoI)质粒DNA，将pYF11-NEO(XhoI)质粒DNA和回补片段FocVPS41-Com-6.0kb按照摩尔比1：9共转化到酵母XK-125感受态，酵母XK-125感受态的制备和转化参照酵母转化试剂盒Alkali-cationyeast transformation kit(MP Biomedicals,catalog number:2200-200)，转化获得的酵母单克隆利用引物pYF11-seq-R和VPS41-CKF(表1)进行PCR验证，验证获得的回补载体pYF11-NEO-FocVPS41利用酵母质粒提取试剂盒抽提酵母质粒，将酵母质粒转化至大肠杆菌DH5α进行扩繁，再次抽提pYF11-NEO-FocVPS41质粒DNA，-20℃冻存备用。

2.4Foc4原生质体的制备

将Foc4接种到PDB培养基中，于28℃下150rpm培养3～5d，取5mL Foc4经3层无菌擦镜纸过滤到新的PDB中；于28℃下150rpm培养12～16h，用3层无菌擦镜纸过滤，并用0.7mol/L NaCl溶液(渗透压稳定剂)冲洗3～5次，获得新鲜菌丝体。按酶液与菌丝比例(体积质量比10：1)，加入适量10g/L崩溃酶酶液，于30℃下100rpm条件下酶解3～4h，得到原生质体酶解液。于4℃下4000×g离心10min，弃上清。加入10mL预冷的STC溶液(含10mmol/L Tris-Hcl(pH 7.5)，1.2mol/L山梨醇，50mmol/L CaCl

香蕉枯萎菌FocVPS41敲除突变体原生质体，参照上述Foc4原生质体的制备步骤制得。

2.5PEG介导的Foc4原生质体转化

将200μL Foc4原生质体置于冰上化冻后，分别加入3-5μg的上游同源重组片段VPS41-HYG-LB2和上游同源重组片段VPS41-HYG-RB2，轻弹混合均匀，冰上静置30-60min；逐滴加入1mL SPTC(40％PEG 4000，10mmol/L Tris HCl，pH7.5，1.2mol/L山梨醇，50mmol/LCaCl

FocVPS41回补转化子的获得：将pYF11-NEO-FocVPS41质粒DNA(15-20μg)与200μLΔFocVPS41敲除突变体原生质体混匀，后续参照上述FocVPS41基因敲除的转化过程，转化子选择200μg/mL新霉素G418抗性进行筛选。

2.6 FocVPS41基因敲除突变体的PCR验证分析

野生菌株Foc4和候选FocVPS41基因敲除突变体，采用CTAB抽提基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物VPS41-Outside-1F/VPS41-Outside-4762R进行FocVPS41基因Outside片段的PCR扩增；用引物VPS41-inside-F/VPS41-inside-1138R进行FocVPS41基因inside片段的PCR扩增分析。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：95℃反应5min；95℃反应15sec，58℃反应15sec，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应5min。得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2.7 FocVPS41基因回补突变体的PCR验证分析

野生菌株Foc4和候选FocVPS41基因敲除突变体，采用CTAB抽提基因组DNA，进行PCR验证分析。分别用引物HYG-F/HYG-R进行HYG基因的PCR扩增；用引物NEO-probe-F/NEO-probe-563R进行NEO基因的PCR扩增用引物VPS41-inside-F/VPS41-inside-1138R进行FocVPS41基因inside片段的PCR扩增分析。

PCR反应体系如下：

PCR反应条件为：95℃反应5min；95℃反应15sec，58℃反应15sec，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应5min。得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2.8 FocVPS41基因敲除和回补突变体的Southern杂交分析

香蕉枯萎菌Foc4、ΔFocVPS41基因敲除突变体以及ΔFocVPS41-Com基因回补突变体基因组DNA采用CTAB法提取基因组DNA，将20μg基因组DNA用限制性内切酶HindIII单切线性化，按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公司)说明书，进行Southern杂交。用引物VPS41-inside-F/VPS41-inside-1138R扩增目的基因FocVPS41探针，引物HYG-Probe-1F/HYG-Probe-598R扩增HYG探针，引物NEO-Probe-F/NEO-Probe-563R扩增NEO探针(引物见表1)。

DNA探针的PCR扩增体系如下：

PCR反应条件为：95℃反应5min；95℃反应15sec，58℃反应15sec，72℃反应1min，共30个循环；72℃反应5min。得到的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用OMEGA琼脂糖凝胶回收试剂盒进行切胶回收，-20℃冻存备用。

2.9 FocVPS41基因敲除和回补突变体菌落形态和显微结构观察

(1)菌落形态观察及生长速度测定。将Foc4、ΔFocVPS41和ΔFocVPS41-Com分别接种于PDA培养基上，于28℃倒置培养。分别在1d、3d和5d时采用十字交叉法测量菌落直径，并观察其菌落形态，在菌落上滴加20μL ddH

(2)菌丝的显微观察、分生孢子产量及大小测定。将香蕉枯萎菌分别接种至PDA和PDB培养基，28℃，接种于PDA菌株于静置培养5d，接种于PDB的菌株150rpm培养，5d后利用显微镜观察菌丝的顶端及分生孢子梗等显微结构，利用显微镜配套的成像处理软件对分生孢子进行长度和宽度进行测量，测定分生孢子的大小，利用血球计数板统计分生孢子数量。每个处理设置3个重复。

2.10FocVPS41基因敲除和回补突变体的逆境胁迫响应分析

将Foc4、ΔFocVPS41和ΔFocVPS41-Com分别接种至含有不同胁迫因子的MM培养基(分别含1.2mol/L山梨醇(Sorbitol)、5mmol/L H

2.11FocVPS41基因敲除和回补突变体的致病性分析

取5叶期的巴西蕉，分别用Foc4、ΔFocVPS41和ΔFocVPS41-Com的分生孢子(2×10

3结果与分析

3.1香蕉枯萎菌FocVPS41基因敲除同源片段的获得

采用Split-marker策略，以Foc4基因组DNA为模板，第1轮PCR扩增，FocVPS41基因上游VPS41-LB1片段大小为2114bp，FocVPS41基因下游VPS41-RB1片段大小为2103bp；第2轮Over-lap PCR扩增，分别得到FocVPS41基因上游同源臂VPS41-HYG-LB2片段，片段大小为2627bp，FocVPS41基因下游同源臂VPS41-HYG-RB2片段，片段大小为2255bp。

3.2敲除突变体ΔFocVPS41的筛选

利用同源重组方法，将FocVPS41基因上游同源臂VPS41-HYG-LB2和下游同源臂VPS41-HYG-RB2转化香蕉枯萎菌Foc4原生质体，获得了135个潮霉素抗性转化子。经DNA的提取，利用FocVPS41基因的outside和inside引物，对135个潮霉素阳性转化子进行了PCR验证分析。结果表明，由于HYG基因替换枯萎菌中的FocVPS41基因，其Outside引物扩增片段大小：野生菌株的Foc4为4762bp，而候选阳性敲除突变体的扩增大小则为1815bp，同时inside引物扩增只能在野生菌株的Foc4中扩增出1138bp的特异片段，转化子101、105、123的验证结果如图2所示。

3.3回补突变体ΔFocVPS41-Com的筛选

将回补载体pYF11-NEO-FocVPS41通过PEG介导转化ΔFocVPS41敲除突变体的原生质体，通过新霉素G418抗性筛选，获得7个新霉素G418抗性转化子。以7个候选转化子的基因组DNA为模板，引物HYG-F/HYG-R、NEO-probe-F/NEO-probe-563R、VPS41-inside-F/VPS41-inside-1138R等3对引物进行PCR验证，结果表明编号01、02、04三个NEO抗性转化子为ΔFocVPS41-Com阳性回补转化子(图3)。

3.4基因敲除突变体ΔFocVPS41和回补突变体ΔFocVPS41-Com的Southern杂交验证

对经过PCR初步验证的候选敲除突变体ΔFocVPS41(101、105、123)和回补突变体ΔFocVPS41-Com(01、02、04)进行了Southern杂交分析。结果表明，以目的基因FocVPS41作为探针进行杂交，3个敲除转化子均未有杂交条带，野生株Foc4和3个回补转化子均有杂交条带；以hph为探针进行杂交，3个敲除转化子和3个回补转化子均有单拷贝条带出现；以新霉素基因NEO为杂交探针，只在3个回补转化子上游杂交条带信号。上述试验进一步证明3个敲除转化子和3个回补转化子均为阳性转化子(图4)。

3.5基因敲除突变体ΔFocVPS41和回补突变体的菌落形态和菌落直径测定

将Foc4、敲除突变体ΔFocVPS41(ΔFocVPS41 123)和回补突变体ΔFocVPS41-Com(ΔFocVPS41-123-Com-04)分别接种于PDA培养基中，在接种5d后进行了菌落形态观察及菌落直径测定。结果表明，与Foc4相比，ΔFocVPS41的菌落显著小于Foc4，而回补突变体的恢复至野生型Foc4水平图(图5-A，图5-D)，ΔFocVPS41菌落疏水减弱，表现为易湿状态，不过回补突变体的疏水性并未完全恢复(图5-B)，纵切观察到的菌落气生菌丝显示，相较于Foc4气生菌丝的茂盛，敲除突变体ΔFocVPS41的气生菌丝少，菌丝紧贴PDA培养基表面，而回补突变体菌落气生菌丝恢复到Foc4(图5-C)。

3.6基因敲除突变体ΔFocVPS41和回补突变体的显微观察及产孢量分析

将Foc4、敲除突变体ΔFocVPS41(ΔFocVPS41 123)和回补突变体ΔFocVPS41-Com(ΔFocVPS41-123-Com-04)分别接种于PDA和PDB培养基中，培养5d后进行产孢量分析。结果显示，ΔFocVPS41 123菌落边缘菌丝致密且扭曲，中间部分产生的分生孢子梗及对应的分生孢子簇单位面积内显著变少，统计对应的产量显示，无论是PDA静置还是PDB摇培的培养条件，ΔFocVPS41 123的产孢量显示少于Foc4(相差约100倍)(图6-A，图6-B)，分生孢子尺寸大小测定显示，Foc4分生孢子大小均值为：5.89±3.30μm×2.22±0.50μm，ΔFocVPS41123分生孢子大小均值为9.07±4.27μm×2.48±0.45μm，与野生株Foc4无显著差别(图6-C)。

3.7基因敲除突变体ΔFocVPS41和回补突变体对不同逆境胁迫条件的响应分析

将Foc4、敲除突变体ΔFocVPS41(ΔFocVPS41 123)和回补突变体ΔFocVPS41-Com(ΔFocVPS41-123-Com-04)分别接种于不同胁迫因子的MM培养基中，结果表明，与Foc4相比，ΔFocVPS41对刚果红更敏感，而对荧光增白剂、山梨醇和农药氰烯菌酯则不敏感，对SDS和H

3.8基因敲除突变体ΔFocVPS41和回补突变体的致病性分析

利用伤根接种法，将Foc4、ΔFocVPS41(ΔFocVPS41-123)和ΔFocVPS41-Com(ΔFoc VPS41 123Com 04)分生孢子液分别接种巴西蕉，于30d后进行观察。结果表明，相较于阴性对照H

综上，本发明提供的FocVPS41基因及其编码的蛋白可以用于植物病害防治，特别是由香蕉枯萎病菌所导致的香蕉枯萎病。另，本发明提供的FocVPS41基因及其编码的蛋白可以作为用于香蕉枯萎病等植物病害防治的药物的靶标。本领域技术人员可以跟进本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是香蕉枯萎病的药物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。