包含硅酮的抗微生物制剂

本发明涉及抗微生物制剂，特别是包含硅酮和抗微生物小分子肽或类似肽的分子的制剂。这些制剂可用于抗微生物制品中或用作抗微生物制品，诸如伤口敷料、隐形眼镜和其他医疗器械，诸如植入物，或用作医用粘合剂和粘合贴剂。

硅酮弹性体也称为聚硅氧烷弹性体，是一类柔性、轻质、热稳定和耐化学性聚合物。由于其有利性质，硅酮弹性体具有广泛的用途，包括在医疗器械中，诸如导管和植入物，例如在乳房植入物中。硅酮弹性体也用作医用粘合剂和伤口敷料。硅酮水凝胶用于隐形眼镜中。

诸如导管、骨科器械和其他植入物等医疗器械的使用已日益增加。尽管器械设计和外科手术有所改善，但与此类医疗器械相关的感染仍是主要问题。常规抗生素治疗通常由于实际感染部位和感染部位周围区域的抗生素水平低而失败。引入的生物材料/器械上存在的生物膜会损害抗生素治疗的功效，而耐药菌株的存在也会损害抗生素治疗的功效。

由于抗微生物肽(AMP)对广谱浮游细菌和生物膜(包括抗生素抗性菌株)具有活性，因此他们是作为新抗微生物剂的前景斐然的候选物。此外，由于细菌的作用模式(包括脂膜的破坏，而不是作用于蛋白质靶)，细菌不太可能对这些快速作用的肽产生抗性。

Mishra等人，J.Mater.Chem.B,2014,2,1706-1716公开了涂有AMP Lasioglossin-III的硅酮导管。在该研究中，AMP共价固定在硅胶导管表面。经处理的导管防止大肠杆菌和粪肠球菌的生物膜生长，并且当浸没在磷酸盐缓冲盐水和合成尿中4天时显示出抗微生物活性。

然而，仍然需要可用于医疗器械的替代制剂，其可用于提供抗微生物剂的受控释放以及限制器械本身的定殖。为了提供抗微生物活性，在制剂的制备期间，AMP还必须不被热降解或以其他方式降解。尽管硅酮在医疗器械中用途广泛，但不能认为抗微生物肽或类似肽的分子可以以提供抗微生物肽的受控释放以及限制器械本身定殖的方式与硅酮基质组合。无法直接将肽配制到可提供受控释放的基质中，与其他类型的药物相比，肽通常溶解性差，并且通常在将肽共混至硅酮基质中所需的温度下降解。

本发明人已经能够制备可用于提供活性抗微生物剂的受控释放的制剂，即，抗微生物剂是可浸出的并且可抑制周围环境中的细菌生长。抗微生物剂还用于控制制剂内和制剂表面上的微生物生长。

因此，在一个方面，本发明提供了一种包含硅酮基质(或由硅酮基质组成)的受控释放制剂，所述硅酮基质包含式(I)的化合物

AA-AA-AA-X-Y (I)

其中，以任意顺序，所述AA(氨基酸)部分中的2个是阳离子氨基酸，优选赖氨酸或精氨酸，但可以是组氨酸或在pH 7.0携带正电荷的任何非遗传编码或修饰的氨基酸，并且所述AA中的1个是具有大亲脂性R基团的氨基酸，所述R基团具有14至27个非氢原子并且优选含有2个或更多个、例如2或3个可稠合或连接的环状基团，这些环状基团通常包含5或6个非氢原子，优选6个非氢原子(在稠合环的情况下，非氢原子当然可以共享)；

X是N原子，其可以被支链或非支链的C

Y选自R

R

其中：

R

R

R

R

R

优选的化合物并入直链或支链的R

在一些实施方案中，R

一些优选的实施方案中，R

在包含环状基团的R

可提供阳离子氨基酸的合适的非遗传编码氨基酸和修饰氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸的类似物，诸如高赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基庚二酸、二氨基丙酸和高精氨酸以及三甲基赖氨酸和三甲基鸟氨酸、4-氨基哌啶-4-羧酸、4-氨基-1-甲脒哌啶-4-羧酸和4-胍基苯丙氨酸。

AA的大亲脂性R基团可含有杂原子，诸如O、N或S，通常存在不超过一个杂原子，优选其为氮。该R基团优选具有不超过2个极性基团，更优选没有极性基团或具有一个极性基团，最优选没有极性基团。

优选为肽的化合物优选具有式(II)

AA

其中：

AA

AA

X和Y如上所定义。

进一步优选的化合物包括式(III)和(IV)的化合物：

AA

AA

其中AA

在上述化合物中，某些化合物是特别优选的。特别地，其中以下化合物是最优选的：具有大亲脂性R基团的氨基酸(本文方便地称为AA

另一组优选的化合物是其中如上定义Y为-R

进一步优选的一组化合物是其中-X-Y一起为基团-NHCH

所述化合物包括所有对映体形式，包括D和L氨基酸以及由氨基酸R基团和C-末端封端基团“-X-Y”内的手性中心产生的对映体。β和γ氨基酸以及α氨基酸包括在术语“氨基酸”内，N-取代的甘氨酸也包括在术语“氨基酸”内，N-取代的甘氨酸可以全部被认为是AA单元。本发明的分子包括β肽和缩肽。

最优选的化合物如下：

t-Bu表示叔丁基基团。并入氨基酸2,5,7-三-叔丁基-L-色氨酸的第二种化合物是本发明中最优选使用的化合物(本文也称为AMC-109)。并入其他阳离子残基代替精氨酸(特别是赖氨酸)的该化合物的类似物也是高度优选的。还高度优选并入如上所定义的替代C端封端基团的类似物。

进一步优选的一组化合物是以下的那些：其中-X-Y一起选自-NHCH(CH

优选的化合物是其中AA

用于本发明的化合物优选为肽。

式(I)至(IV)的化合物可以是肽模拟物，并且本文描述和定义的肽的肽模拟物也代表根据本发明使用的化合物。肽模拟物的特征通常在于保留了其肽等价物的极性、三维大小和功能性(生物活性)，但是其中肽键通常被更稳定的键连取代。“稳定的”是指对水解酶的酶促降解更具耐受性。通常，取代酰胺键的键(酰胺键替代物)保留酰胺键的许多性质，例如构象、空间体积、静电特性、氢键的可能性等，“药物设计和开发(Drug Design andDevelopment)”第14章(Krogsgaard,Larsen,Liljefors和Madsen(编著)1996,Horwood学术出版社)提供了肽模拟物的设计和合成技术的一般讨论。在分子与膜反应而非与酶的特定活性位点反应的当前情况下，所描述的精确模拟亲和力和功效或底物功能的一些问题并不相关，并且可以基于给定的肽结构或所需官能团的基序容易地制备肽模拟物。合适的酰胺键替代物包括以下基团：N-烷基化(Schmidt,R.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,1995,46,47)、逆反酰胺(Chorev,M和Goodman,M.,Acc.Chem.Res,1993,26,266)、硫代酰胺(Sherman D.B.和Spatola,A.F.J.Am.Chem.Soc.,1990,112,433)、硫酯、膦酸酯、酮亚甲基(Hoffman,R.V.和Kim,H.O.J.Org.Chem.,1995,60,5107)、羟基亚甲基、氟乙烯基(Allmendinger,T.等人,Tetrahydron Lett.,1990,31,7297)、乙烯基、亚甲基氨基(Sasaki,Y和Abe,J.Chem.Pharm.Bull.1997 45,13)、亚甲基硫醇(Spatola,A.F.,MethodsNeurosci,1993,13,19)、烷烃(Lavielle,S.等人,Int.J.Peptide Protein Res.,1993,42,270)和磺酰氨基(Luisi,G.等人.Tetrahedron Lett.1993,34,2391)。

本发明的肽模拟化合物通常具有3个可鉴别的亚单位，其大小和功能与氨基酸(AA单元)近似相等。因此，术语“氨基酸”在本文中可方便地用于指肽模拟物化合物的等价亚单位。此外，肽模拟物可具有与氨基酸的R基团等同的基团，并且本文对合适的R基团以及N和C末端修饰基团的讨论比照适用于肽模拟物化合物。

如上文引用的教科书中所讨论的，除了酰胺键的取代，肽模拟物可涉及用二肽或三肽模拟物结构取代较大的结构部分，并且在这种情况下，涉及肽键的模拟物部分，诸如吡咯衍生的模拟物可用作二肽取代。然而，优选肽模拟物，因此优选其中酰胺键已被如上所述取代的肽模拟物主链。

合适的肽模拟物包括还原的肽，其中通过用还原剂(例如硼烷或氢化物试剂，诸如氢化铝锂)处理将酰胺键还原成亚甲基胺。此类还原具有增加分子整体阳离子性的额外优点。

其他肽模拟物包括例如通过逐步合成酰胺官能化的聚甘氨酸而形成的肽类。一些肽模拟物主链将容易地由他们的肽前体获得，诸如已经被过甲基化的肽，合适的方法由Ostresh,J.M.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91,11138-11142中描述。强碱性条件将有利于N-甲基化而不是O-甲基化，并导致肽键和N-末端氮中的一些或全部氮原子的甲基化。

优选的肽模拟物主链包括聚酯、聚胺及其衍生物以及取代的烷烃和烯烃。肽模拟物优选具有N和C末端，其可以如本文所述进行修饰。

根据本发明使用的化合物(例如肽)表现出抗微生物活性(通常是抗细菌活性)，特别是他们通过直接的膜影响机制发挥细胞毒性作用并且可以被称为膜作用抗微生物剂。这些化合物裂解细胞膜、使细胞膜不稳定或甚至穿透细胞膜。这相对于作用于靶细胞的蛋白质组分(例如细胞表面受体)或与靶细胞的蛋白质组分相互作用的药剂提供了明显的治疗优势。尽管突变可产生导致抗生素抗性的新形式的靶蛋白，但是，可能性更小的是，发生对脂膜的自由基改变以防止细胞毒性作用。裂解作用导致细胞极为快速死亡，因此具有在细菌有机会繁殖之前杀死细菌的优点。此外，分子可具有杀死或损害靶微生物的其他有用性质，例如抑制蛋白质合成的能力，因此他们可具有多靶活性。

用于本发明的化合物可以以任何方便的方式合成。通常，存在的反应性基团(例如氨基、硫醇和/或羧基)将在整个合成期间得以保护。因此，合成中的最后步骤将是对本发明的受保护衍生物进行脱保护。

在构建肽时，原则上可以在C-末端或N-末端开始，然而，优选C-末端开始的程序。

肽合成的方法是本领域熟知的，但是对于本发明，在固相载体上进行合成可能特别方便，此类载体是本领域熟知的。

氨基酸保护基的广泛选择是已知的，合适的胺保护基可包括苄酯基(也称为Z)叔丁氧基羰基(也称为Boc)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr)和9-芴基甲氧基-羰基(也称为Fmoc)。应当理解，当从C-末端开始构建肽时，胺保护基将存在于每个添加的新残基的α-氨基基团上，并且在下一个偶联步骤之前需要被选择性地除去。

例如，可以使用的羧基保护基包括容易裂解的酯基，诸如苄基(Bzl)、对硝基苄基(ONb)、五氯苯基(OPClP)、五氟苯基(OPfp)或叔丁基(OtBu)基团以及固体载体上的偶联基团，例如与聚苯乙烯连接的甲基。

硫醇保护基包括对甲氧基苄基(Mob)、三苯甲基(Trt)和乙酰胺基甲基(Acm)。

存在多种除去胺保护基和羧基保护基团的程序。然而，这些必须与所采用的合成策略一致。侧链保护基团必须对用于在下一偶联步骤之前除去临时α-氨基保护基团的条件稳定。

可以通过酸处理，例如用三氟乙酸，同时除去胺保护基团(诸如Boc)和羧基保护基团(诸如tBu)。可以使用氧化剂(诸如碘)选择性地除去硫醇保护基团(诸如Trt)。

硅酮基质主要(至少50％、60％、70％、80％或90％)或全部(至少99％)由硅酮的重量形成。制剂中存在的硅酮可以是单一或多种不同类型。硅酮在本领域中可称为聚硅氧烷。

硅酮或聚硅氧烷是由硅酮的重复单元组成的聚合物，硅酮是交替的硅原子和氧原子与碳、氢已经有时其他元素结合的链。因此，聚硅氧烷含有无机硅-氧主链(…-Si-O-Si-O-Si-O-…)，其中有机侧基团连接至硅原子，使得每个硅原子呈四价。因此，直链硅酮可由化学通式[R

通过改变-Si-O-链长和有机侧基团的性质，可以合成具有多种性质和组成的硅酮。优选的R基团包括氢、甲基、乙基、丙基和苯基，其可以可选地被例如卤素(诸如氟)取代。因此，合适的聚合物可包含二甲基和二苯基单体亚单元。硅酮可优选为乙烯基封端的。

硅酮优选是硅酮弹性体。硅酮通常是医用级硅酮弹性体。各种不同的硅酮基材料和基质是本领域已知的，他们可用作与人体或动物体接触的医疗和其他器械。以下类型的硅酮适用于本发明：硅酮密封剂/粘合剂、液体硅酮橡胶(LSR，主要用于注塑产品)、硅酮涂层/分散体、硅酮泡沫、硅酮膜、硅酮流体和凝胶(例如用于乳房植入物)、高稠度硅酮橡胶(主要用于挤出产品)、低粘度弹性体、压敏粘合剂(PSA)和粘性凝胶。这些中的任一种可与式(I)的化合物组合。

可通过交联单个聚合物链以形成3D网络而形成聚硅氧烷或硅酮弹性体。交联聚硅氧烷以形成聚硅氧烷弹性体的方法可称为固化或硫化。固化可以在式(I)的化合物的存在下进行，例如用浸渍的硅酮PSA，但在其他生产方法中将不出现固化。固化可以有利地在铂催化剂的存在下进行，该铂催化剂出人意料地对具有化学式(I)的化合物不具有有害作用。

硅酮优选为固化的硅酮弹性体，固化可包括可选在合适的催化剂存在下加热至约100-200℃的温度约1-5小时。在其他实施方案中，固化可包括在环境温度下干燥(例如12或更多，或24或更多小时)。合适的催化剂包括铂、钯和过氧化物基催化剂。可以采用缩合固化体系。

合适的硅酮的供应商包括Avantor/Nusil和Dow/DuPont。

一些优选的硅酮基质含有可用于溶解式(I)化合物的溶剂，或(更通常)可与式(I)化合物已溶解于其中的溶剂混溶，例如为PSA的硅酮。可流动的硅酮产品(诸如PSA)可通过浸渍或刷涂被施加至基质上。

根据本发明，可以使用泡沫硅酮基质，例如由Molynlycke Healthcare以名称Mepilex Lite销售的伤口敷料或由Smith&Nephew销售的Allevyn Gentle Border。此类具有预成型空腔的产品可以吸收溶解式(I)化合物的液体，例如乙醇或水。他们可以像海绵一样起作用，吸收液体并因此已溶解的化合物渗透到材料中。泡沫可溶胀，但通常在其干燥时恢复至其正常尺寸；溶剂蒸发，但化合物保持分散在硅酮泡沫中。

较硬的硅酮用于其他应用中，例如用于提供固体医疗器械或其部件，他们是像粘合剂那样的不可流动的产品。较硬的硅树脂包括优选的Nusil MED-4065和LSR。较硬的硅酮可在活性剂存在下形成，使得活性剂在整个硅酮基质中配混。

优选的较硬类型的硅酮弹性体通过将式(V)的化合物：

与有机聚硅氧烷(其具有与硅键合的烯基基团)和可选的无机填料反应，然后在合适的固化条件下固化所得混合物(可固化硅酮弹性体组合物)以形成硅酮弹性体。“m”优选比“n”大，例如大至少2、3、4或5倍。聚合物被分类为具有高分子量。

式(V)的化合物被称为甲基氢硅氧烷、二甲基硅氧烷共聚物、三甲基硅氧烷封端的(有时称为二甲基甲基氢(硅氧烷与硅酮)(CAS号：68037-59-2)。

本发明人已经开发了硅酮与式(I)化合物可以组合的多种不同方式。

根据本发明，可通过将式(I)的化合物与式(V)的化合物、、具有与硅键合的烯基基团的有机聚硅氧烷以及可选的无机填料混合，而将硅酮与式(I)的化合物配混。式(V)化合物与其他组分的组合顺序不受限制。例如，式(I)的化合物可与可固化硅酮弹性体组合物的组分之一(诸如式(V)的化合物)混合，然后与可固化硅酮弹性体组合物的其他组分组合。在向其中加入式(I)的化合物之后，固化硅酮。在实施例中描述了此类方法，并且此类方法是本发明的另一个方面。

包含式(V)的化合物、具有与硅键合的烯基基团的有机聚硅氧烷和铂催化剂的试剂盒是可商购的，例如以商品名Nusil

可以使用本领域公知的常规方法，例如使用双辊磨机，以混合所述组分。

固化条件可包含加热至约100-200℃范围内的温度。在合适的催化剂存在下，固化时间通常为约1-5小时。优选地，固化条件包含加热至约120-180℃范围内的温度持续约1-5小时。更优选地，热固化反应包含加热至约130-150℃范围内的温度持续约2-4小时。合适的催化剂是铂催化剂。

根据ASTM D2240使用A型硬度计硬度测试仪(邵氏A硬度)测量，硅酮弹性体的硬度可以为25-90，更优选40-80，最优选50-70。优选地，根据ASTM D412测量，硅酮弹性体的拉伸强度为约5-20MPa，更优选约6-15MPa，最优选约8-10MPa。优选地，硅酮弹性体的断裂伸长率为约800-1300％，更优选约900-1100％。这些优选特征可以以任何方式组合。

用于本发明的其他合适的硅酮弹性体是US2016369100A中公开的类型，其公开内容通过引用并入本文。这些硅酮特别用作需要坚固硅酮的医疗器械，诸如植入物、导管或缝合线。

可通过对可固化硅酮弹性体组合物进行固化，形成这些硅酮弹性体，可固化硅酮弹性体组合物包含：

(A)有机聚硅氧烷，其具有与硅键合的烯基基团；

(B)有机氢硅氧烷，其在分子中具有平均两个或更多个与硅键合的氢原子；

(C)无机填料；以及可选地

(D)至少一种填料处理剂，更优选填料处理剂的混合物。

可以在式(I)化合物的存在下进行固化。

组合物可以进一步包括(E)催化有效量的加成反应催化剂，或者可以在晚些时候向包括组分(A)至(D)的组合物提供所述催化剂。当组合物包括催化剂(E)时，优选进一步包括固化延迟剂(即，抑制剂)。

基于通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量的以标准聚苯乙烯当量计的数均分子量(下文称为“数均聚合度”)，(A)有机聚硅氧烷优选地具有2000或更大的数均聚合度，并且其在室温下表现出生橡胶状态或胶(gum)状态。优选地，(A)的数均聚合度为2000至100000，更优选3000至8000。

(A)有机聚硅氧烷可包括具有烃基团R(例如-SiOR2-)的硅氧烷单元，其中每个R可相同或不同并且为取代或未取代的单价烃基团。此类R基团可具有1-10个碳，优选1-8个碳。R的实例包括：烷基基团，诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、环己基、辛基、壬基和癸基；芳基基团，诸如苯基、甲苯基、二甲苯基和萘基；芳烷基基团，诸如苄基、苯基乙基和苯基丙基；烯基基团，诸如乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、己烯基、环己烯基和辛烯基；通过用诸如氟原子、溴原子和氯原子的卤素原子、氰基基团等取代上述基团中的一些或全部氢原子而获得的基团，诸如氯甲基、氯丙基、溴乙基、三氟丙基和氰基乙基，但优选90％或更多的R基团为甲基。

根据聚合度和主链上存在/不存在支链来确定与硅键合的烯基基团在组分(A)中的含量，但组分(A)优选为其中烯基基团含量为0.001至0.1重量％的直链或部分支化的有机聚硅氧烷，并且更优选直链有机聚硅氧烷在两个分子末端具有平均两个或更多个与硅键合的烯基基团。

在一个实施方案中，组分(A)的结构使得分子末端被具有与硅键合的烯基基团的三有机甲硅烷氧基基团封端，并且主链具有包含重复的二有机硅氧烷单元的直链结构，但可以是部分支化的链结构。组分(A)的分子量使得数均聚合度为2000或更大(2000至100000)，并且组分(A)呈现生橡胶状态或胶状态，并且数均聚合度优选为3000或更大(3000至8000)。如果数均聚合度小于上述下限，则难以获得令人满意的橡胶感，表面可能变粘或发粘。

组分(B)是用于组合物的交联剂。组分(B)中与硅键合的氢原子的键合位点没有特别限制，并且可以是分子末端，或侧接于(沿着)分子链或分子末端以及侧接于分子链。此外，组分(B)中除氢原子以外的与硅键合的基团的实例包括单价烃基基团，例如烷基基团，诸如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基；环烷基基团，诸如环戊基和环己基；芳基基团，诸如苯基、甲苯基和二甲苯基；芳烷基基团，诸如苄基和苯乙基；卤代烷基基团，诸如3,3,3-三氟丙基和3-氯丙基；烯基，诸如乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、己烯基、环己烯基和辛烯基，优选烷基基团和芳基基团，特别优选甲基和苯基。

组分(B)的分子结构不受限制，并且可以是例如直链、支链、具有一些支链的直链、环状、树枝状(树枝状)或树脂状。组分(B)可以是具有这些分子结构的均聚、包含这些分子结构的共聚物或其混合物。

组分(C)是无机填料，其赋予硅酮弹性体强度等性能。可以使用一种或多种类型的无机填料，并且组分(C)可以是：增强填料，诸如二氧化硅细粉或热解氧化钛；非增强填料，诸如硅藻土、铝硅酸盐、氧化铁、氧化锌或碳酸钙；或导热填料，诸如氧化铝或氮化硼。

组分(D)是用于无机填料的表面处理剂，其包括含烯基的基团。此类填料处理剂的实例包括含烯基的有机基硅烷、有机基硅氮烷、有机基硅烷醇、烷氧基有机基硅烷或其任何组合。

组分(E)的加成反应催化剂是用于促进本发明组合物固化的催化剂，并且可以是铂基催化剂、钯基催化剂、铑基催化剂等。铂金属类催化剂是特别优选的。

组分(E)的实例包括铂基催化剂，例如铂细粉、铂黑、氯铂酸、四氯化铂、醇改性的氯铂酸、铂的烯烃络合物、铂的烯基硅氧烷络合物、铂的羰基络合物、铂的卡宾络合物、位于细碎固体载体(诸如二氧化硅)上的铂、含有这些铂基催化剂的粉末状热塑性有机树脂和硅酮树脂；铑基催化剂、钯基催化剂、其他过渡金属基催化剂。

可加成固化的硅酮弹性体组合物可含有固化延迟剂以调节固化速度或适用期。固化延迟剂的实例包括：具有碳-碳三键的醇衍生物，诸如3-甲基-1-丁炔-3-醇、3,5-二甲基-1-己炔-3-醇、苯基丁炔醇和1-乙炔基-1-环己醇；烯-炔化合物，诸如3-甲基-3-戊烯-1-炔和3,5-二甲基-3-己烯-1-炔；含烯基基团的低分子量硅氧烷，诸如四甲基四乙烯基环四硅氧烷和四甲基四己烯基环四硅氧烷；以及含炔的硅烷，诸如甲基-三(3-甲基-1-丁炔-3-氧基)硅烷和乙烯基-三(3-甲基-1-丁炔-3-氧基)硅烷。

可通过将组分(A)至(E)连同任何可选的成分一起均匀混合，来制备可固化硅酮弹性体组合物。可以通过任何常规方式实现组分和成分的混合，诸如Morehouse Cowles混合器、双辊磨机或捏合机混合器。可固化硅酮弹性体组合物还可包含式(I)的化合物。

作为在式(I)化合物的存在下固化硅酮的替代方案，本发明人已经开发了在硅酮基底固化之后将式(I)的化合物引入到硅酮基底中的方法。这通过溶胀和干燥技术来实现，其中式(I)化合物已溶解于其中的溶剂载体用于浸渍该硅酮基底。在该方法中，可以使用与上述相同的较硬的硅酮。制备或选择硅酮基底，并进行经由溶胀的浸渍步骤以将式(I)的化合物引入到硅酮基底中。该方法可以在预成形的硅酮材料或器械上进行。

所谓的“溶胀-干燥”技术描述于实施例中并且具有以下优点：在一些实施方案中，仅基质、器械或制品的外部部分含有活性剂，并且因此产品制造起来成本更低而功效不受损。

在医疗器械中使用的另一种类型的硅酮是作为压敏粘合剂(PSA)。这些硅酮比上述硅酮软得多且更粘，但也适于与式(I)的化合物组合以提供本发明的制剂。

他们可包含分散在溶剂中的高分子量聚二甲基硅氧烷和增粘硅酮树脂。可以使用铂、钯或过氧化物催化剂来实现固化。在用过氧化物催化剂进行固化之前，可以通过在中等温度下加热然后升高温度以固化并最终分解过氧化物催化剂，来除去溶剂。

优选在加入式(I)化合物后进行固化，例如通过空气干燥数小时。例如，将PSA加化合物混合物施加至基底(例如目标医疗器械)上，然后通过缓慢干燥过程固化，以在基底上留下粘性层。

PSA可施加在基底(诸如Kapton或Mylar、泡沫或橡胶)的一面或两面上，或直接施加在剥离膜上。

PSA的一种替代物是粘性硅酮凝胶，其也提供粘性产品；基础硅氧烷聚合物化学组成是相同的，但凝胶缺少硅酮树脂。这些硅酮凝胶通常由两种类型的硅氧烷聚合物组成：乙烯基官能化聚硅氧烷和氢化物官能化聚硅氧烷。这些硅酮凝胶是不分散在溶剂体系中的低粘度材料。这些硅酮凝胶在铂催化剂的存在下固化成不流动的固体形式；可以配制凝胶以在低温下完全固化。市售的实例包括MED-6340(一种二甲基聚硅氧烷)和GEL-9502-30(一种二苯基二甲基聚硅氧烷)。这些产品具有比硅酮PSA产品更低的剥离强度和更高的表面粘性。

其他硅酮凝胶是不粘的并且可适用于乳房植入物。这些凝胶的粘度可为100厘泊至100000厘泊，但优选约1000厘泊。硅酮凝胶可作为两部分体系提供，其中部分A含有乙烯基封端的二甲基硅氧烷聚合物和铂催化剂。部分B含有乙烯基封端的二甲基硅氧烷聚合物、甲基-氢交联剂和合适的抑制剂(诸如甲基乙烯基环硅氧烷)。反应性硅氧烷聚合物可具有末端乙烯基、侧接乙烯基或两者的组合。硅氧烷聚合物应沿着主链具有二甲基取代的基团，但也可具有二苯基、甲基苯基和三氟丙基取代。交联剂可具有末端氢化物基团、侧链氢化物基团或两者的组合。氢化物浓度范围可以为10-80摩尔％，但优选50摩尔％。催化剂应当是铂，其浓度为2-10ppm，但优选8ppm。其他催化剂可以是铱、钯、铑和其他合适的催化剂。合适材料的实例包括Nusil MED-6342、Nusil MED-6345、Nusil MED-6350、Nusil MED-6311(NuSil技术公司，加利福尼亚州Carpinteria)和Applied Silicone 40022、AppliedSilicone 40135和Applied Silicone 40008(Applied Silicone公司，加利福尼亚州SantaPaula)。硅酮基凝胶是特别适用于乳房植入物的材料。

基于固体物质的总重量含量，本发明的制剂可包含的式(I)化合物的量为约0.005-10重量％、优选0.1-5重量％，在一些实施方案中为0.5-5重量％。当化合物不分散于整个硅酮基质中，而是仅存在于周边，例如可通过溶胀/干燥方法实现，式(I)化合物的百分比将倾向于较低。

为了避免疑问，应当注意，在本发明的制剂中，在硅酮和式(I)的化合物之间没有共价连接。因此，可以认为该化合物可释放地与硅酮缔合。

式(I)的化合物能够从本发明的制剂中释放(或从本发明的制剂中浸出或扩散出)。这在本发明的上下文中是重要的，因为式(I)的化合物具有抗微生物活性，并且期望在使用中所述化合物能够从制剂释放至需要抗微生物活性的区域，例如以预防或治疗伤口、或医疗器械的植入部位的感染。

优选地，在使用中，式(I)的化合物从制剂中受控(即，持续)释放。例如，可以释放治疗有效量的化合物至少6、12、24、36、48、72小时。治疗有效量将优选导致递送至局部环境的化合物浓度超过化合物对目标细菌的最小抑制浓度(MIC)。

可以通过任何合适的方法容易地确定活性化合物从本发明制剂中释放的能力，并且技术人员熟悉这些方法。在本文的实施例中描述了合适的方法。例如，可以使本发明的制剂与接种了细菌(例如葡萄球菌属的细菌)的琼脂板接触，并且在适当的孵育时间后，可以检查所述板在缝合线周围是否存在“抑制区”(即，没有细菌生长或细菌生长减少的区)。“抑制区”的存在(例如，与包含硅酮(该硅酮不含抗微生物化合物)的制剂的试验相比)指示化合物可从制剂中释放。可替代地，可以如实施例中所述执行浸提方法。

式(I)的化合物可被认为分散(可释放地分散)穿过硅酮。这可以是在整个硅酮基底中的均匀分散体，或者可以仅在一个或更多个区域中，例如在基底的外部部分中。例如，基于穿过硅酮基质的切割截面，2-100％或2-90％、优选5-75％、更优选5-50％或5-30％、例如5-20％或10-20％的硅酮含有分散于其中的式(I)化合物。

在另一方面，本发明提供了一种方法，其包含将硅酮基底或形成硅酮基底的组分与式(I)的化合物混合，并可选地固化所述混合物以提供本发明的制剂。优选地，当通过组合两种组分形成(弹性体)硅酮基底时，首先进行该组合，然后向其中加入式(I)的化合物，然后固化整个混合物。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。可以使用本领域公知的常规方法，例如使用双辊磨机，来混合组分。固化条件可包含加热至约100-200℃范围内的温度。在合适的催化剂存在下，固化时间通常为约1-5小时。优选地，固化条件包含加热至约120-180℃范围内的温度持续约1-5小时。更优选地，热固化反应包含加热至约130-150℃范围内的温度持续约2-4小时。合适的催化剂是铂催化剂。

本发明提供了一种制备包含与式(I)化合物配混的硅酮基底的制剂的方法，所述方法包含在合适的固化条件下固化其中已混入式(I)化合物的可固化硅酮弹性体组合物以提供与式(I)化合物配混的硅酮基底。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

在另一方面，本发明提供了制备本发明的制剂的方法，该方法包含：(i)制备一种或更多种溶剂和溶解于其中的式(I)化合物的溶液，以及(ii)将所述溶液施加至硅酮基质上。硅酮基底可以是本文所述的任何类型，例如泡沫、PSA或预成形(弹性体)硅酮产品。在一些优选实施方案中，硅酮基质将在步骤(ii)之前已经固化，但是该方法可以包括对步骤(ii)的产物进行固化的步骤(iii)，该步骤(ii)的产物即已经施加了溶解在溶剂中的式(I)的化合物的硅酮基质。当步骤(ii)中使用的硅酮是用于制备PSA的可流动硅酮时，通常采用固化步骤(iii)。在这种情况下，通常通过干燥进行固化。

对于其中不进行固化步骤(iii)的制剂，通常仍将存在对步骤(ii)的产物进行干燥的步骤(其可被认为是步骤(iii a))。优选在室温下进行空气干燥，但是可以使用加速干燥的标准方法，例如中温加热。

如果硅酮基底为泡沫，则步骤(i)中采用的溶剂仅需要能够溶解式(I)的化合物，因为溶剂可将化合物带入硅酮泡沫内的腔中。因此，可以采用单一溶剂，诸如乙醇或甚至水。更大的挑战在于将化合物引入非泡沫硅酮基底。对于那些产物，步骤(i)中使用的溶剂必须能够溶解式(I)的化合物和；或者(a)与已经存在于硅酮基底中的溶剂相容以允许混合化合物和硅酮，例如在可流动硅酮产品(诸如用于制备PSA的那些)的情况下；或者(b)包含相容的溶剂混合物(通常为两种溶剂)，其能够溶解化合物并渗透硅酮并使硅酮溶胀，从而允许式(I)的化合物分散在硅酮内。

在另一方面，本发明提供了一种制备包含硅酮粘合剂(硅酮PSA)的本发明的制剂的方法，所述方法包含将式(I)的化合物溶解在第一溶剂中并与含粘合剂硅酮的制剂混合，所述制剂还包含与所述第一溶剂相同或可混溶的溶剂。可以将所述混合物冷却至低于20℃的温度，例如冷却至2.5-15℃的温度，优选冷却至5-10℃的温度，以确保均匀性。所述制剂可以可选地施用到背衬材料、织物、泡沫、橡胶或器械或其他基底上。所述制剂可以例如通过使其在环境温度下干燥至少6小时、例如至少8小时、例如10-16小时而固化。

如上所述，本发明人还开发了一种在硅酮基底固化后将式(I)的化合物引入到硅酮基底中的方法。这可通过溶胀和干燥技术得以方便地实现，其中将式(I)的化合物溶于其中的溶剂载体用于浸渍硅酮基质。制备或选择硅酮基底，并进行经由溶胀的浸渍步骤，以将式(I)的化合物引入到硅酮基底中。该方法可以在预成形的硅酮材料或器械上进行。

在根据本发明的优选方法中，通过将式(I)的化合物的溶液施加至硅酮基质，然后使硅酮干燥，来制备本发明的制剂。通常，在施用式(I)的化合物的溶液之后，硅酮溶胀(当他吸收溶液时)。

因此，在另一方面，本发明提供了一种制备浸渍有式(I)化合物的硅酮基底的方法，所述方法包含：(i)将式(I)化合物的溶液施加至硅酮，以及(ii)对已施加所述溶液的硅酮进行干燥，从而制备浸渍有式(I)化合物的硅酮基底。通常，步骤(i)的施加导致硅酮溶胀。因此，步骤(ii)的干燥通常是在步骤(i)中施加溶液之后获得的溶胀硅酮的干燥。干燥可以在环境温度下进行(即，被动干燥)，或者可以进行主动干燥步骤。在一些实施方案中，可以在约20℃(即，在环境温度)进行干燥，例如持续6至24小时，可选地持续约12小时。用作溶胀剂和/或用于将式(I)化合物递送至硅酮中的溶剂在干燥步骤期间被蒸发掉；干燥时间和条件将根据所用溶剂而变化。适度升高的温度可用于加速干燥时间。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。例如，优选式(I)的化合物。

优选地，该溶胀-干燥过程是可逆的，因此不会引起硅酮基底的体积和形状的材料变化。不希望受理论束缚，据信这种方法仅导致硅酮基质的外部部分被式(I)化合物浸渍，并且这减少了提供本发明的有用制剂(或由所述制剂制成或包含所述制剂的器械)所需的化合物的量。因此，优选地，根据该技术，硅酮基底的总厚度的小于95％、90％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％可以用式(I)的化合物浸渍。可替代地，可使用溶胀-干燥方法用式(I)化合物浸渍整个硅酮基底。

据信，在溶胀过程中，可存在浓度梯度，其中硅酮外层是饱和的，内层(离表面最远)仅部分饱和(或未饱和)。通过在达到整个硅酮基底的总饱和(或浸渍)之前停止溶胀过程，可获得其中表面/外层含有所需浓度的化合物的制剂。因此，硅酮的内层可含有比表面/外层更少的化合物(或不含有化合物)。换言之，并且再次不受理论束缚，通过控制溶胀时间，可以控制溶胀剂(以及因此化合物)渗透硅酮的程度(或深度)。因此，通过控制溶胀时间，可以控制硅酮的浸渍以实现(如果需要的话)仅硅酮的表面/外层的浸渍。然后浸渍部分(或层)的厚度可以确定化合物的浸出速率和化合物的耗尽时间。

可以使用用于式(I)化合物的溶液的任何合适的溶剂。在优选的实施方案中，选择两种可混溶的溶剂，即溶解式(I)化合物的第一溶剂和特别适于溶胀(即，渗透)硅酮基质的可混溶的第二溶剂。合适的第一溶剂包括醇，诸如乙醇和2-丙醇，合适的第二溶剂包括氯仿和戊烷。在一些实施方案中，施加至硅酮的溶剂是乙醇/氯仿混合物(例如，乙醇：氯仿为2：1的混合物)或丙醇/戊烷混合物(例如，丙醇：戊烷为2：1至1：2混合物)。可以首先将式(I)的化合物溶解在一种溶剂中，然后将该溶液与第二溶剂混合，以提供待施加的溶液，也称为溶胀剂。

通常，将式(I)化合物的溶液施加至硅酮，使得治疗有效(抗微生物有效)量的化合物浸渍到硅酮中。优选治疗有效量的浸出和抗定殖剂。在一些情况下，可将式(I)化合物的溶液施加至硅酮，使得每平方厘米硅酮浸渍至少0.05mg、至少0.1mg、至少0.5mg或至少1mg化合物。

在一些实施方案中，用于溶胀硅酮的式(I)化合物的溶液(溶胀剂)的式(I)化合物浓度为0.25％-10％、0.5％-10％、1％-10％、2％-10％或5％-10％、0.25％-5％、0.5％-5％、1％-5％、2％-5％、0.25％-3％、0.5％-3％、1％-3％(例如，重量/体积％)。在一些实施方案中，用于溶胀硅酮的式(I)化合物的溶液的式(I)化合物浓度为至多1％、至多2％、至多3％或至多5％(例如，重量/体积％)。在一些实施方案中，用于溶胀硅酮的式(I)化合物的溶液的式(I)化合物浓度为至少0.5％、至少1％、至少2％或至少3％(例如，重量/体积)。

在制备用式(I)化合物浸渍的硅酮的方法的一些实施方案中，包含将式(I)化合物的溶液施加至硅酮基底以使硅酮溶胀，该溶液可施加10秒至6小时、10秒至3小时、30秒至180分钟、30秒至120分钟、1分钟至2小时或2分钟至2小时。

可基于待浸渍的硅酮的性质(例如厚度、孔隙率)和/或期望硅酮浸渍的深度，来选择施加的时间长度(溶胀时间)。

应当理解，本发明的制剂不包含其中式(I)的化合物简单地连接至其表面的硅酮基底、材料或器械，而是化合物分散或共混在一些或所有硅酮中，从而提供含有分散/共混的化合物的均匀产物或(外)层。因此，本发明的制剂包含用式(I)化合物浸渍的硅酮基底。当硅酮材料原位放置时，例如放置在留置器械或伤口敷料中时，该性质提供化合物的受控释放。

在进一步的方面中，本发明提供了一种包含式(I)的化合物并且已经根据上述任何方法生产的硅酮基底，特别是其中硅酮在式(I)化合物的存在下被固化或其中式(I)化合物已经通过如上所述溶胀-干燥方法被引入的方法。

本发明的制剂可用作抗微生物制品。因此，本发明的另一方面提供了一种抗微生物制品，其包含本发明的制剂。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

在一个实施方案中，抗微生物制品是医疗器械，诸如导管或植入物。合适的植入物包括骨科植入物(诸如髋和膝植入物)以及牙科植入物、销钉、支架和乳房植入物。制剂也可用于或用作敷料或透皮贴剂，例如用作多层敷料中的抗微生物层。

在另一个实施方案中，抗微生物制品是敷料，其包含由本发明的制剂制成的层。优选地，敷料是伤口敷料。在一个实施方案中，伤口敷料由与式(I)化合物配混的硅酮层(或网或片等)组成。在另一个实施方案中，敷料是多层敷料。例如，在一些实施方案中，多层伤口敷料可包含与式(I)化合物配混的硅酮层(或网或片等)和一种或更多种另外的伤口敷料组分，例如另外的吸收层和/或第二层(或外层或覆盖层或背衬层)，其例如可用于将伤口敷料固定至皮肤。多层伤口敷料可包含其他伤口敷料组分，例如纱布、绷带和/或辅助敷料。

伤口可以是部分厚度伤口或完整厚度伤口。伤口可以是皮肤撕裂、擦伤、裂伤(割伤)或烧伤(例如，一度或二度烧伤)。伤口可以是切口伤口。伤口可以是切除伤口。伤口可以是手术伤口。

伤口可以是急性的或慢性的。急性伤口是在愈合过程的三个公认阶段(即，炎症阶段、增殖阶段和重塑阶段)中有序进行而未延长时间过程的伤口。然而，慢性伤口是那些没有完成生物化学事件的有序序列的伤口，因为伤口在愈合阶段之一已经停滞。可替代地，慢性伤口是指在至少40天、优选至少50天、更优选至少60天、最优选至少70天内未愈合的伤口。在一些实施方案中，优选慢性伤口。

待处理的伤口可以是例如由手术切口或创伤(例如机械创伤、热创伤、电创伤、化学创伤或辐射创伤)引起的组织中的裂口或损伤；自发形成的损伤，诸如皮肤溃疡(例如静脉性、糖尿病性或压迫性溃疡)；水疱(例如摩擦或热水疱或由病原体感染(诸如水痘)引起的水疱)；肛裂或口腔溃疡。

在一个实施方案中，抗微生物制品是隐形眼镜。

在另一个实施方案中，抗微生物制品是假体内衬。

在另一个实施方案中，抗微生物制品是(透)皮贴剂，例如粘合剂(透)皮贴剂。

本发明的另一方面提供了一种粘合剂，特别是压敏粘合剂，例如用于将敷料或医疗器械固定至患者皮肤，其包含本发明的制剂。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。本发明的可流动硅酮基底可用于提供其中分散有式(I)化合物的硅酮层或涂层。

本发明的制剂可以作为涂层加入到医疗器械中。因此，本发明的另一方面是用如本文所定义的本发明的制剂涂覆的医疗器械，其包括部分涂覆的医疗器械。在本发明的另一方面，提供了如本文所定义的本发明的制剂，其已经应用于医疗器械。器械包括缝合线、外科紧固件、导管、线等和植入物，包括骨科植入物(诸如髋和膝植入物)以及牙科植入物、销钉和支架。

可将待涂覆的器械浸渍在包含式(I)化合物的可固化硅酮弹性体组合物中(可能若干次，例如3-10次)，然后可在合适的固化条件下在器械上固化所述可固化硅酮弹性体组合物。这种浸渍方法特别适合于诸如缝合线的器械。可替代地，本发明的制剂可以通过涂刷到器械表面上，例如通过喷涂，而施加至医疗器械，例如植入物。包含本发明制剂的医疗器械也可通过3D打印生产。

可应用本发明制剂的合适缝合线包括可吸收的、可选编织的缝合线。此类缝线可由尼龙制成，包括Surgilon和Nurolan缝合线。优选使用不含或具有除本发明制剂之外的任何涂层的缝合线。例如，可以首先处理缝合线以除去硅涂层。

在另一方面，本发明提供了一种生产本发明的医疗器械的方法，所述方法包含：(i)提供包含式(I)化合物的可固化硅酮弹性体组合物；(ii)将所述组合物施加至医疗器械(例如通过将器械浸入所述制剂中或将所述制剂涂到器械上)；以及(iii)对器械上的组合物进行固化。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

另一方面提供了一种制剂，其包含硅酮基质，硅酮基质含有式(I)的化合物，或一种抗微生物制品或粘合剂，其包含此类制剂，其中通过本发明的方法制备该制剂。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

本发明的另一方面提供了本发明的制剂、抗微生物制品或粘合剂用于疗法的用途。

“疗法(therapy)”包括治疗(treatment)和预防，即，他包括治疗和预防用途。

在一些实施方案中，本发明提供了本发明的制剂、抗微生物制品或粘合剂用于治疗或预防受试者感染的用途。在一些优选的实施方案中，感染或潜在感染是手术部位感染或伤口感染。在其他优选的实施方案中，感染或潜在感染是与植入物(如上所述)相关的感染，包括在器械上或器械周围形成生物膜。

优选地，感染是细菌感染，例如由革兰氏阳性细菌(例如葡萄球菌属或链球菌属的细菌)引起的感染。在一些实施方案中，感染是金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中，感染是表皮葡萄球菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌感染。

本发明的另一方面提供了本发明的制剂、抗微生物制品或粘合剂用于抑制受试者中细菌生长的用途。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

本发明的另一方面提供了本发明的制剂、抗微生物制品或粘合剂用于疗法的用途，优选用于治疗或预防受试者感染的用途。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

换一个角度来看，本发明提供了一种治疗或预防感染的方法，该方法包含向有需要的受试者施加(或施用)治疗有效量的本发明的制剂、抗微生物制品或粘合剂。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

将基于所选择的式(I)化合物的临床评估和针对靶细菌的MIC值来确定治疗有效量。

本发明的另一个方面提供了式(I)化合物用于疗法的用途，优选用于治疗或预防受试者的感染的用途，其中所述化合物作为包含与所述化合物配混的硅酮的制剂或以本发明的抗微生物制品或粘合剂的形式施用于(或施加于)受试者。本文描述的本发明的其他方面的实施方案加以必要的变更适用于本发明这一方面。

本文所用的术语“受试者”或“患者”包括任何哺乳动物，例如人和任何家畜、家养动物或实验室动物。具体实例包括小鼠、大鼠、猪、猫、狗、绵羊、兔、牛和猴。然而，优选地，受试者或患者是人类受试者。因此，根据本发明治疗的受试者或患者优选是人。

在一些实施方案中，受试者或患者是患有感染的那些，或怀疑患有感染的那些，或处于患有(或染上)感染的风险中的那些。处于风险中的患者是优选的患者组，并且包括需要医疗植入物或必须进行手术或需要手术或其他伤口闭合的患者。对于这些患者，可选择掺入本发明制剂的本发明医疗器械、敷料或粘合剂。此类器械释放抗微生物的式(I)化合物以促进形成器械周围患者体内无感染的局部环境，并且器械上/内的式(I)化合物的存在抑制了器械本身被细菌定殖。

本发明还提供了试剂盒，该试剂盒包含一种或更多种本发明的制剂、抗微生物制品或粘合剂。优选地，所述试剂盒用于本文所述的治疗方法和用途。优选地，所述试剂盒包含试剂盒组分的使用说明书。优选地，所述试剂盒用于治疗或预防感染，例如如本文别处所述，并且可选地包含使用试剂盒组分治疗此类感染的说明书。

如在整个申请中所使用的，术语“一(a)”和“一个(an)”以他们表示所引用的组分或步骤中的“至少一个”、“至少第一”、“一个或更多个”或“多个”的意义使用，除了其中之后本文具体陈述上限的情况。

另外，当在本文中使用术语“包括(comprise)”、“包含(comprises)”、“具有(has)”或“含有(having)”或其他等效术语时，那么在一些更具体的实施方案中，这些术语包括术语“由…组成”或“基本上由…组成”或其他等效术语。

现在将参考以下非限制性实施例和附图进一步描述本发明，其中：

图1是显示在鼠科动物皮肤感染模型中使用化合物2针对金黄色葡萄球菌FDA486的一天局部处理的效果的图。菌落形成单位(CFU)的数目显示在Y轴上，并且施加于小鼠的局部处理的类型显示在X轴上。化合物2在本文中也称为AMC-109。

图2是显示在鼠科动物皮肤感染模型中使用化合物2针对酿脓链球菌的一天局部处理的效果的图。菌落形成单位(CFU)的数目显示在Y轴上，并且施加于小鼠的局部处理的类型显示在X轴上。化合物2在本文中也称为AMC-109。

图3是显示在鼠科动物皮肤感染模型中针对金黄色葡萄球菌FDA486的一天局部处理的效果的图。在上午9点、中午12点和下午3点处理每只小鼠。在下午6点采集皮肤活组织检查。显示了中值。

图4是显示在鼠科动物皮肤感染模型中针对酿脓链球菌CS301的一天局部处理的效果的图。在上午7点、上午10点和下午1点处理每只小鼠。在下午4点采集皮肤活组织检查。显示了中值。

图5是显示小鼠皮肤感染模型中针对金黄色葡萄球菌FDA486的一天局部处理的效果的图。在上午9点、中午12点和下午3点处理每只小鼠。在下午6点采集皮肤活组织检查。显示了中值。

图6和图7是显示AMC-109配混的硅酮对表皮葡萄球菌(图6)和金黄色葡萄球菌(图7)生长的影响的照片集合。A幅(左)显示了硅酮片周围的抑制区。B幅(右)显示了除去硅酮片后的抑制区域。

图8和图9是暴露于金黄色葡萄球菌(图8)和表皮葡萄球菌(图9)16小时后样品2/19(左)的荧光显微照片。

图10和图11是显示AMC-109配混的硅酮在第二次使用后对金黄色葡萄球菌(图10)和表皮葡萄球菌(图11)生长的影响的照片集合。

实施例1

肽合成

化学试剂

受保护的氨基酸Boc-Trp-OH、Boc-Arg-OH、Boc-4-phenyl-Phe和Ac-Arg-OH购自Bachem公司，而Boc-4-碘苯丙氨酸、Boc-3,3-二苯丙氨酸和Boc-(9-蒽基)丙氨酸购自Aldrich。构成肽C-末端的苄胺、2-苯乙胺、3-苯丙胺、(R)-2-苯丙胺、(S)-2-苯丙胺、N,N-甲基苄胺、N,N-乙基苄胺和N,N-二苄胺购自Fluka，除了N-乙基苄胺购自Acros。二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并三唑(1-HOBt)、氯代三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyCloP)和O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)购自Fluka。4-正丁基苯基硼酸、4-叔丁基苯基硼酸、4-联苯基硼酸、2-萘基硼酸、三邻甲苯基膦、苄基溴和乙酸钯购自Aldrich。溶剂购自Merck、Riedel-de

氨基酸的制备

Boc-2,5,7-三叔丁基色氨酸-OH的制备：将H2N-Trp-OH(1.8g，8.8mmol)、t-BuOH(4.7g，63.4mmol)在三氟乙酸(19mL)中的混合物于70℃搅拌3小时。将所得中棕色半透明溶液的体积在旋转蒸发器上于室温减少30分钟，然后通过逐滴添加60mL 7％(按重量计)NaHCO

从粗产物中第一次结晶产生相对于样品中的所有其他物质纯度为80-83％(HPLC)且相对于已知TBT类似物纯度为约94-95％的分离产物。该阶段的收率为60-65％。

Boc-4-碘苯丙氨酸的苄基化。将Boc-4-碘苯丙氨酸(1当量)溶于90％甲醇的水溶液中，并通过加入碳酸铯中和直至弱碱性pH(通过石蕊试纸测定)。通过旋转蒸发除去溶剂，并通过与甲苯重复共沸蒸馏进一步减少Boc-4-碘苯丙氨酸铯盐中剩余的水。将所得干燥盐溶解在二甲基甲酰胺(DMF)中，加入苄基溴(1.2当量)，并将所得混合物搅拌6-8小时。反应结束时，减压除去DMF，形成含有标题化合物的油。将该油状物溶于乙酸乙酯，所得溶液用等体积的柠檬酸溶液(三次)、碳酸氢钠溶液和盐水洗涤。通过快速色谱法使用二氯甲烷:乙酸乙酯(95:5)作为洗脱剂分离标题化合物，为淡黄色油状物，85％收率。可以通过从正庚烷中重结晶获得结晶苄基Boc-4-碘苯丙氨酸。

Suzuki偶联的一般程序：将苄基Boc-4-碘苯丙氨酸(1当量)、芳基硼酸(1.5当量)、碳酸钠(2当量)、乙酸钯(0.05当量)和三邻甲苯基膦(0.1当量)加入到二甲氧基乙烷(6ml/mmol苄基Boc-4-碘苯丙氨酸)和水(1ml/mmol苄基Boc-4-碘苯丙氨酸)的脱气混合物中。将反应混合物保持在氩气下并加热至80℃达4-6h。冷却至室温后，通过硅凝胶和碳酸钠短垫过滤混合物。将滤饼进一步用乙酸乙酯洗涤。合并滤液，减压除去溶剂。使用乙酸乙酯和正己烷的混合物作为洗脱液，通过快速色谱法分离产物。

Boc-Bip(n-Bu)-OBn的制备：使用Suzuki偶联的一般程序，由4-正丁基苯基硼酸以53％收率制备标题化合物。使用80:20乙酸乙酯:正己烷洗脱液分离Boc-Bip(n-Bu)-OBn。

Boc-Bip(t-Bu)-OBn的制备：使用Suzuki偶联的一般程序，由4-叔丁基苯基硼酸以79％收率制备标题化合物。使用80:20乙酸乙酯:正己烷洗脱液分离Boc-Bip(t-Bu)-OBn。

Boc-Bip(4-Ph)-OBn的制备：使用Suzuki偶联的一般程序，由4-联苯基硼酸以61％收率制备标题化合物。通过从正庚烷重结晶粗产物而分离Boc-Bip(4-Ph)-OBn。

Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn的制备：使用Suzuki偶联的一般程序，由2-萘基硼酸以68％收率制备标题化合物。通过从正庚烷重结晶粗产物而分离Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn。

Boc-Bip(4-(1-萘基))-OBn的制备：使用Suzuki偶联的一般程序，由2-萘基硼酸制备标题化合物。通过从正庚烷重结晶粗产物而分离Boc-Bip(4-(1-萘基))-OBn。

苄基酯的脱酯化的一般程序：将苄基酯溶解在DMF中并在环境压力下使用10％碳载Pd作为催化剂氢化2天。在反应结束时，通过过滤除去催化剂，并在减压下除去溶剂。通过从乙醚中重结晶分离游离酸。

Boc-Bip(4-n-Bu)-OH的制备：使用用于脱酯化的一般程序，由Boc-Bip(n-Bu)-OBn以61％收率制备标题化合物。

Boc-Bip(4-t-Bu)-OH的制备：使用用于脱酯化的一般程序，由Boc-Bip(t-Bu)-OBn以65％收率制备标题化合物。

Boc-Bip(4-Ph)-OH的制备：使用用于脱酯化的一般程序，由Boc-Bip(4-Ph)-OBn以61％收率制备标题化合物。

Boc-Bip(4-(2-萘基))-OH的制备：使用用于脱酯化的一般程序，由Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn以68％收率制备标题化合物。

Boc-Bip(4-(2-萘基))-OH的制备：使用用于脱酯化的一般程序，由Boc-Bip(4-(2-萘基))-OBn以68％收率制备标题化合物。

使用HBTU的溶液相肽合成的一般程序。根据以下一般程序，使用Boc保护策略通过逐步氨基酸偶联在溶液中制备肽。将具有游离氨基团的C-末端肽部分(1当量)和Boc保护的氨基酸(1.05当量)和1-羟基苯并三唑(1-HOBt)(1.8当量)溶于DMF(2-4ml/mmol氨基组分)中，然后加入二异丙基乙胺(DIPEA)(4.8当量)。将混合物在冰上冷却并加入O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)(1.2当量)。将反应混合物于环境温度振摇1-2h。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用柠檬酸、碳酸氢钠和盐水洗涤。真空除去溶剂，所得肽的Boc保护基在暗处使用95％TFA或乙酰氯的无水甲醇溶液脱保护。

使用PyCloP形成溶液相酰胺。Boc-Arg-N(CH

肽纯化和分析。使用反相HPLC在Delta-Pak(Waters)C

实施例2

本文定义的肽的体外活性

材料和方法

抗微生物剂

预称重的化合物1和化合物2的小瓶由Lytix Biopharma公司提供。

细菌分离株

本研究中使用的细菌分离株来自世界范围内的各种来源，储存于GR Micro公司，并以最少传代培养保持，在-70℃下深度冷冻，作为未稀释马血清的高蛋白基质中的浓悬浮液。所用菌种及其特性列于表1中。这些菌种包括54种革兰氏阳性菌、33种革兰氏阴性菌和10种真菌。

最低抑制浓度(MIC)的测定

使用由临床和实验室标准协会(CLSI，以前称为NCCLS)公布的用于抗微生物敏感性试验的以下微量肉汤稀释方法来测定MIC：

M7-A6第23卷第2期，2003年1月，对有氧生长的细菌进行稀释抗微生物药敏试验的方法；批准的标准——第6版。M100-S15第25卷第1期，2005年1月，抗微生物药敏试验的性能标准；第十五次信息增补。M11-A6第24卷第2期，厌氧细菌的抗微生物药敏试验方法；批准的标准——第6版。M27-A2第22卷第15期，酵母肉汤稀释法抗真菌药敏试验参考方法；批准的标准——第二版。M38-A第22卷第16期，丝状真菌肉汤稀释抗真菌药敏试验参考方法；批准的标准。

使用在GR Micro公司制备的含有抗细菌剂或抗真菌剂的湿平板进行MIC估算。

将阳离子调节的Mueller-Hinton肉汤(Oxoid公司(英国Basingstoke)和TrekDiagnostic Systems公司(英国East Grinstead))(补充有5％的用于链球菌属、杰氏棒杆菌和单核细胞增生利斯特氏菌的裂解马血)用于需氧细菌，初始接种物为约10

将嗜血杆菌试验培养基(含有0.5％酵母提取物的Mueller-Hinton肉汤和含有15mg/L血红蛋白和15mg/L NAD的嗜血杆菌试验培养基补充物，均得自Oxoid公司，英国Basingstoke)用于流感嗜血杆菌并接种约10

补充的布氏肉汤(SBB)用于厌氧菌株，接种物为约10

酵母和丝状真菌MIC在MOPS缓冲的RPMI 1640培养基(MOPS缓冲液得自SigmaAldrich公司，RPMI 1640得自Invitrogen公司(苏格兰Paisley))中进行。酵母接种物为7.5×10

按照常规操作，预先制备含有Mueller-Hinton肉汤的所有平板，在制备当天于-70℃冷冻，并在使用当天解冻。真菌、嗜血杆菌和厌氧MIC测定均在同一天制备的平板中进行。

为了评价冷冻是否影响肽的活性，使用含有新鲜制备的Mueller-Hinton肉汤的平板重复一些MIC测定。

对照菌株

试验菌株组中包括以下对照(参考)菌株

大肠杆菌ATCC 25922

金黄色葡萄球菌ATCC 29213

粪肠球菌ATCC 29212

肺炎链球菌ATCC 49619

铜绿假单胞菌ATCC 27853

克鲁斯念珠菌ATCC 6258

以下对照菌株在试验菌株组之外，并在适当情况下纳入，以检查比较物是否在范围内。

流感嗜血杆菌ATCC 49247

近平滑念珠菌ATCC 22019

脆弱拟杆菌ATCC 25285

迟缓埃格特菌ATCC 43055

结果

结果作为单行列表示于表1中。重复对照菌株结果示于表2中。可以看出，对照菌株结果是高度可再现的，包括来自含有冷冻储存或新鲜使用的Mueller Hinton肉汤的平板的数据。冷冻平板对其他细菌菌株的MIC也没有影响。

获得的MIC数据非常令人鼓舞，表明肽具有相当广谱的活性。

表1：两种抗微生物肽和比较物抗一组革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的体外活性的单行列表。

/>

/>

表2：两种抗微生物肽和比较物抗ATCC对照菌株的体外活性

(包括试验菌株组之外的ATCC对照菌株)

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MHB，Mueller Hinton肉汤；HTM，嗜血杆菌试验培养基；SBB，补充的布鲁氏肉汤。

实施例3对胰蛋白酶降解和抗微生物活性的稳定性

检测式AA

肽半衰期的测量和计算

将每种肽溶解在0.1M NH

抗菌试验

对金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25923、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株ATCC 33591和甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(MRSE)菌株ATCC 27626的MIC测定由Toslab公司使用标准方法进行。Amsterdam,D.(1996)，在液体培养基中对抗微生物剂进行敏感性试验，《实验室药物中的抗生素(Antibiotics in Laboratory Medicine)》第4版(Lorian,V.编著)第75-78页，Williams和wilkins公司，巴尔的摩。

表3.AA

a

b

c

d

e

f

实施例4化合物2的体内活性

用金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌感染小鼠皮肤，随后以3小时间隔给予总共3次治疗。最后一次处理后3小时，收集皮肤活组织检查并测定皮肤样品中存在的集落形成单位(CFU)的数目。结果如图1和图2所示，表示为每只小鼠的集落形成单位数。

在实验1(图1)中，将化合物2作为含有2％(w/w)化合物2的乳膏或凝胶的一部分施加于鼠科动物皮肤。不含化合物2的相同乳膏或凝胶用作阴性对照(安慰剂)。可以清楚看出，与阴性对照相比，当将含有化合物2的乳膏或凝胶施加于小鼠皮肤时，CFU的数量减少，表明化合物2对金黄色葡萄球菌发挥抗微生物作用。载体、乳膏或凝胶的性质没有显著影响。

在实验2(图2)中，化合物2以两种不同浓度施加，作为1％或2％凝胶。安慰剂凝胶和已知的抗细菌剂“百多邦(bactroban)”用作对照。可以看出，含有化合物2的凝胶在减少CFU数方面比安慰剂凝胶或百多邦更有效。含有2％化合物2的凝胶比仅含有1％化合物2的凝胶更有效。

实施例5

本发明中使用的化合物的制备以及物理、抗微生物和溶血特性

肽合成

化学品：

保护的氨基酸Boc-Arg-OH和Boc-4-苯基-Phe购自Bachem公司，而Boc-4-碘苯丙氨酸购自Aldrich。组成肽C-末端的异丙胺、丙胺、己胺、丁胺、十六烷基胺、异丁胺、环己胺和环戊胺购自Fluka。二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟基苯并三唑(1-HOBt)、氯代三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyCloP)和O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)购自Fluka。4-正丁基苯基硼酸、4-叔丁基苯基硼酸、4-联苯基硼酸、2-萘基硼酸、三邻甲苯基膦、苄基溴和乙酸钯购自Aldrich。溶剂购自Merck、Riedel-de

Boc-Phe(4-4'-联苯基)-OBn的制备：使用Suzuki偶联的一般程序，由4-联苯基硼酸以61％收率制备标题化合物。通过从正庚烷重结晶粗产物分离Boc-Phe(4-4'-联苯基)-OBn。

Boc-Phe(4-(2'-萘基))-OBn的制备：使用Suzuki偶联的一般程序，由2-萘基硼酸以68％收率制备标题化合物。通过从正庚烷重结晶粗产物分离Boc-Phe(4-(2'-萘基))-OBn。

Boc-Phe(4-4'-联苯基)-OH的制备：使用用于脱酯化的一般程序，由Boc-Phe(4-4'-联苯基)-OBn以61％收率制备标题化合物。

Boc-Phe(4-(2'-萘基))-OH的制备：使用用于脱酯化的一般程序，由Boc-Phe(4-(2-萘基))-OBn以68％收率制备标题化合物。

使用HBTU的溶液相肽合成的一般程序描述于实施例1中。

在实施例1中描述了使用PyCloP形成溶液相酰胺。

肽的纯化和分析如实施例1所述。

表4

化合物通式：Arg-AA

抗微生物试验

对金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25923、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株ATCC 33591和甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(MRSE)菌株ATCC 27626的MIC测定由Toslab公司使用标准方法进行。Amsterdam,D.(1996)，在液体培养基中对抗微生物剂进行敏感性试验，《实验室药物中的抗生素(Antibiotics in Laboratory Medicine)》第4版(Lorian,V.编著)第75-78页，Williams和Wilkins公司，巴尔的摩。

表5

本发明中使用的化合物的抗微生物和毒性特性

实施例6

所选化合物的体外大实验组筛选

材料和方法

抗微生物剂

预称重的化合物7和化合物8的小瓶由Lytix Biopharma公司提供。

细菌分离株

本研究中使用的细菌分离株如实施例2所述。

测定最低抑制浓度(MIC)

如实施例2所述测定MIC。

结果

结果作为单行列表显示于表6中。

获得的MIC数据是非常令人鼓舞的，表明肽具有相当广谱的活性。

表6：两种抗微生物肽对一组革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的体外活性的单行列表。

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实施例7化合物7和8的体内活性

用金黄色葡萄球菌或酿脓链球菌感染小鼠皮肤，随后以3小时间隔给予总共3次处理。最后一次处理后3小时，采集皮肤活组织检查并测定皮肤样品中存在的集落形成单位(CFU)的数目。

结果如图3、图4和图5所示，表示为每只小鼠的集落形成单位数。

在实验1(图3)中，将化合物7作为含有2％(w/w)化合物7的乳膏或凝胶的一部分施加于鼠皮肤。不含化合物7的相同乳膏或凝胶用作阴性对照(安慰剂)。使用百多邦2％乳膏作为阳性对照。可以清楚地看出，与阴性对照相比，当将含有化合物7的乳膏或凝胶施用于小鼠皮肤时，CFU数减少，表明化合物7对金黄色葡萄球菌发挥抗微生物作用。标准临床治疗百多邦2％乳膏的疗效在治疗方案下无显著效果。载体、乳膏或凝胶的性质没有显著影响。

在实验2(图4)中，化合物7以两种不同浓度施加，作为1％或2％凝胶。安慰剂凝胶和已知的抗细菌剂“百多邦(莫匹罗星)”用作对照。可以看出，含有化合物7的凝胶在减少来自酿脓链球菌CS 301感染的CFU数方面比安慰剂凝胶或细菌培养物更有效。含有2％化合物7的凝胶比仅含有1％化合物7的凝胶更有效。

在实验3(图5)中，将化合物8以2％乳膏制剂施加于小鼠皮肤感染模型中的金黄色葡萄球菌FDA 486感染。使用安慰剂乳膏和两种已知的抗细菌剂“夫西地酸(梭链孢酸)软膏2％”和“百多邦(莫匹罗星)乳膏2％”作为对照。可以看出，含有化合物8的乳膏在减少CFU数方面比安慰剂和夫西地酸或百多邦更有效。

实施例8

8.1 AMC-109配混的硅酮片材的制备

使用研钵(50mm直径)和研杵研磨三个0.33g批次的AMC-109。将所得批料放在一起并于研钵中一起研磨另外5分钟。

Nusil

MED-4065的将25g部分A和25g部分B在间隙为1mm的双辊磨机上混合，得到材料“C”。

将19.2g“C”和0.8g研磨的AMC-109在间隙为0.8mm的双辊磨机上混合，直至视觉上均质化。然后使均质化的混合物通过10次，间隙0.8mm，得到含有4％w/w AMC-109的材料“D”。

将10g“D”和10g“C”在间隙为0.8mm的双辊磨机上混合，直至视觉上均质化。然后使均质化的混合物通过10次，间隙0.8mm，得到含有2％w/w AMC-109的材料“E”。重复该稀释程序以产生含有1％w/w AMC-109(材料“F”)和0.5％w/w AMC-109(材料“G”)的混合物。材料D、E、F和G各自在双辊磨机上通过10次，间隙0.3mm。

由每种材料分别使用1mm的间隙形成两个样品(得到1.5mm厚的片材)，使用0.3mm的间隙形成两个样品(得到0.5mm厚的片材)。

然后在两种不同的固化条件(130℃下4小时或150℃下2小时)下使用已存在于“A”和“B”中的铂催化剂使所述材料热固化，得到表7中列出的样品。

表7

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8.2 AMC-109从配混硅酮样品中浸出到水溶液中

HPLC定量和标准曲线

通过将0.18mg、0.37mg和1.57mg的AMC-109溶解在5ml水中来制备用于定量的AMC-109的三种分析标准品。在通过HPLC分析之前，以与硅酮样品相同的方式稀释这些。

从配混硅酮样品中水性提取AMC-109

将配混的硅酮样品切成为500-600mg的0.5mm膜的样品以及为800-900mg的1.5mm膜的样品。将样品进一步切成4或5个更小的小块，然后将合并的切片置于小瓶中并加入水(5ml)。将样品放置40或42小时。取出500μl水提取物样品并加入200μl HPLC溶剂。通过HPLC分析提取样品。通过电喷雾电离质谱法(ESI-MS)确定复合硅提取物色谱图中AMC-109峰的特性。

选择配混硅酮样品#1/19(0.5mm和1.5mm厚度)用于第二次和第三次提取。在第二次和第三次提取之前用水洗涤样品#1/19，如上文用于第一次提取那样进行持续45h的持续时间。取出500μl样品并加入200μl HPLC溶剂。通过HPLC分析提取样品。

AMC-109易于通过HPLC方法定量。该方法允许在代表40μg/ml至300μg/ml浓度范围的1log范围内进行定量。AMC-109对金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最小抑制浓度(MIC)为约2-4μg/ml。

第一次提取中从样品释放的AMC-109的量显示在表8中。

表8

*NQ表示不可量化

除最低配混浓度(0.5％w/w)之外，所有含水提取物中的浓度均远高于葡萄球菌的MIC。对于最薄的膜，释放是最高的，这与较薄膜的较高表面/体积比一致。

在第一次、第二次和第三次提取中，从样品#1/19释放的AMC-109的量显示在表9中。

表9

再提取实验的结果显示，即使在第三次提取后，AMC-109也从硅酮中持续释放，总共代表6天的持续AMC-109释放。

本实施例中样品暴露于的水性条件模拟了硅胶植入物所经历的体内环境。因此，本实施例的结果显示与AMP-109配混的硅酮材料可用于防止体内硅酮植入物的细菌污染。

8.3配混硅胶样品的微生物学评价

使用琼脂扩散法评估配混的硅酮样品的抗微生物功效。

菌株(典型革兰氏阳性皮肤细菌)：

·金黄色葡萄球菌(ATCC29213)

·表皮葡萄球菌RP62a

将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的过夜菌落稀释至0.5McFarland并铺展在Mueller Hinton琼脂平板上。AMC-109配混的硅酮样品：将1/19、2/19、3/19、4/19、5/19、6/19、7/19和8/19(厚度为0.5mm或1.5mm)并置于新接种的板上两次(总共三次/样品)。所有实验重复三次进行。将板于37℃孵育16小时。

图6和图7显示AMC-109配混的硅酮对表皮葡萄球菌(图6)和金黄色葡萄球菌(图7)生长的影响。A幅(左)显示了硅酮片周围的抑制区。B幅(右)显示了除去硅酮片后的抑制区。

细菌生长抑制区的大小(用标尺测量)如表10所示。

表10

包含最高量的AMC-109(4％w/w–样品编号1/19和5/19)的硅酮片在表皮葡萄球菌(图6)和金黄色葡萄球菌(图7)中都具有最高的生长抑制区。抑制效果是剂量依赖性的：样品2/19和6/19(2％w/w)具有1mm的抑制区，而样品3/19和7/19(1％w/w)以及4/19和8/19(0.5％w/w)仅具有非常小的抑制区。硅酮片似乎以连续方式释放AMC。在图6中，A幅(顶部图片)可以看到两个清晰的斑点，其中一个斑点是由于与放置在接种板上仅一分钟的硅酮片非常短暂的接触而产生的。

在首次暴露于琼脂平板上的细菌后，通过荧光显微镜研究样品#2/19的硅酮表面。

显微照片如图8和图9所示。荧光显微照片显示，当暴露于金黄色葡萄球菌(图8)或表皮葡萄球菌(图9)时，样品#2/19上都没有细菌生长。

将来自琼脂平板的样品漂洗并再使用两次。如图10(金黄色葡萄球菌)和图11(表皮葡萄球菌)所示，与首次使用期间相比，再次使用的硅酮得到了清晰但较小的抑制区。

结论

·AMC-109从配混硅酮样品中释放并提供抗典型皮肤细菌的抗定殖功效，表明抗微生物剂配混的硅酮材料用作创伤敷料的适用性。

·AMC-109从配混硅酮中剂量依赖性地释放。

·AMC-109配混的硅酮用作持续释放器械。

·固化过程影响AMC-109从配混硅中释放到水溶液中。优选较高的温度和较短的暴露时间。

·令人惊讶地，抗微生物肽配混的硅酮弹性体可在130℃或150℃的高温下固化而不降解肽。

实施例9

9.1制备含AMC-109的硅酮压敏粘合剂(PSA)以及涂覆有含AMC-109的硅酮PSA的聚酯膜

制备以下AMC-109在乙醇中的溶液

然后将每种溶液与30ml硅酮压敏粘合剂(Nusil MED-1356，LOT：82485，其可从Avantor商购获得并在本文中称为MED-1356)混合，然后在室温下置于辊式混合器上。NusilMED-1356是低粘度医用级硅酮-PSA(根据标准ASTM D1084和ASTM D2196测量的粘度为250cP[250mPa.s])，其含有50％的乙酸乙酯溶剂。乙酸乙酯和乙醇形成稳定的混合物。

溶液编号80/19、81/19、87/19和88/19分别指30ml MED-1356与溶液83/19、84/19、85/19和86/19的混合物。12小时后，80/19和81/19为澄清液体，而87/19和88/19出现混浊和不均匀。将87/19和88/19冷却至7.5℃±2.5℃并置于辊式混合器上过夜，这提供了澄清且均匀的液体。将80/19、81/19、87/19和88/19保持在7.5℃±2.5℃，在双辊混合机上连续混合，用于研究的其余部分。还制备了两个对照样品：30ml MED-1356+7.5ml乙醇(样品号89/19)和纯MED-1356(样品号90/19)。

将厚度为0.17mm的聚酯膜(Mylar)条切割成20mm×75mm的尺寸。然后将切割的条浸入含有AMC-109的硅酮PSA溶液中并于25℃悬挂干燥(即，在室温下固化)以提供以下样品。

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*计算假定MED-1356中固体材料的密度为1g/ml并且MED-1356含有50体积％的乙酸乙酯。

发现含有AMC-109的硅酮PSA样品与对照样品一样粘(非常粘)，因此AMC-109可掺入硅酮PSA中而不影响硅酮PSA的粘性。

9.2将AMC-109从含有AMC-109的硅酮PSA样品中浸出至水溶液中并进行微生物学评价

将用具有4cm

*ND表示未检测到，NQ表示不可定量(但检测到)

对于微生物学评价，将使用表皮葡萄球菌在0.5％NaCl中制备0.5McFarland(1×10

结论

·AMC-109可采用标准技术掺入医用级硅酮PSA中，而不会不利地影响有硅酮PSA的粘附特性。

·AMC-109从硅样品中释放并提供针对典型皮肤细菌的抗定殖功效，表明适合用作抗菌粘合剂，例如用于将医疗器械(例如绷带)固定至皮肤。

·AMC-109从含有AMC-109的硅酮PSA中剂量依赖性地释放。

·样品显示AMC-109持续释放至少24小时。因此，含有AMC-109的硅酮PSA可用作缓释器械。

实施例10

10.1通过“溶胀和干燥”法将AMC-109掺入医用级硅酮中

将MED-4065的部分A和B(如实施例8中所述)以1:1重量比混合并在双辊磨机(间隙0.8mm)上加工，得到1mm厚度的片材。将热固化(120℃，1小时)的片材进行切割，以提供尺寸为2×1cm的硅酮样品。

通过混合以下物质制备溶胀剂：

0.18g AMC-109溶于2ml乙醇和4ml氯仿中，得到2.3重量％溶液，或者

0.09g AMC-109溶于2ml乙醇和4ml氯仿中，得到1.15重量％溶液。

将硅酮样品分成4片并浸泡持续不同的暴露时间，产生不同的吸收，目的是实现5％、10％、20％、50％和100％的吸收百分比。浸泡后，用纤维素擦拭物表面干燥样品，称重，然后于20℃干燥12小时。

样品编号、AMC-109在溶胀剂中的浓度、暴露时间、初始重量(每个样品总共4片)、暴露后重量和吸收百分比[100％×(溶胀后重量-初始重量)/初始重量]示于下表中。

*样品编号35/20是暴露于不含AMC-109的溶胀剂的对照样品

**样品编号35/20是未暴露于溶胀剂的对照样品

不希望受理论束缚，据信在溶胀过程中存在浓度梯度，其中材料的外层饱和，而内层仅部分饱和。通过在整个样品达到饱和之前打破溶胀过程，可以获得这样的产品，其中表面层含有所需浓度的肽，而内层含有较少的肽。这使得能够更经济有效地制备抗微生物制品。

10.2通过溶胀和干燥法将AMC-109从负载AMC-109的硅酮样品中浸出到水溶液中，并对这些样品进行微生物学评价

提取

将使用“溶胀和干燥”法制备的硅酮样品切割成尺寸大致相等的部件。将切割的样品置于小瓶中并加入水(1ml)。将样品放置1.5小时。然后过滤提取样品并通过HPLC分析。结果如下表所示。

微生物学试验

将表皮葡萄球菌(RP62A)的过夜集落在0.85％NaCl中稀释至0.5McFarland(1×10

为了测定CFU值，将样品在2ml 0.85％NaCl中涡旋并进行系列稀释(10

/>

通过CFU数检查细菌抑制水平。该材料显示出良好的抗微生物效果。所有对照样品显示高水平的细菌表面定殖。

结论

·可以使用溶胀和干燥法将AMC-109可逆地加载到医用级硅酮中。

·AMC-109将从样品中释放出来，并在硅酮制品周围的局部环境中以及在硅酮制品的表面和内部提供抗定殖和抗微生物活性。

·AMC-109的释放量通常取决于溶胀溶剂中活性成分的量和溶胀时间。

实施例11

11.1通过“溶胀和干燥”法将AMC-109掺入市售硅酮假体内衬

使用解剖刀从硅胶假体内衬(

11.2AMC-109从硅酮样品浸出到水溶液中

对于从样品中的水提取，分析每种制剂的一个样品。将硅酮样品切成置于小瓶中的两个尺寸大致相等的部分并加入水(1ml)。将样品放置0.5小时。将提取样品过滤并通过HPLC使用紫外检测在280nm进行分析并使用标准曲线进行定量。下表显示了提取液中AMC-109的浓度。

水提取的结果显示溶胀时间与可提取的AMC-109的量之间具有明显相关性。结果还表明，相对大量的AMC-109存在于表面上，并且容易通过快速水洗除去，而且相当大量的AMC-109被硅酮材料吸收。已吸收但可提取的AMC-109的量将在产品附近提供有效的抗微生物环境。

11.3微生物评价

菌株：

·表皮葡萄球菌RP62A

·人类葡萄球菌58-69

将表皮葡萄球菌或人类葡萄球菌的过夜集落在0.85％NaCl中稀释至0.5McFarland(1×10

为了测定CFU，将样品在1ml 0.85％NaCl中涡旋并进行系列稀释(10

通过CFU数和生长区抑制来检测细菌抑制水平。在完成溶胀和干燥程序后，用水洗涤所有检测材料，以确保材料的活性仅归因于内部吸收的AMC-109。

下表显示了在硅酮表面上生长的细菌的溶胀时间和CFU数。与对照样品(未用AMC-109溶胀的硅酮)相比，溶胀5分钟和15分钟的硅酮均显示出优异的抗微生物效用。

下表显示了硅酮表面周围生长抑制区的尺寸。在溶胀剂含有AMC-109的具有不同溶胀时间的两个样品之间，生长抑制区域没有差异。对照样品(不用AMC-109溶胀的硅酮)则未显示生长区域抑制。

结论

·可以使用溶胀和干法将AMC-109配混到硅假体内衬中。

·包含2-丙醇/戊烷溶剂混合物的溶胀剂适于提供可逆溶胀。可逆溶胀是理想的，以避免浸渍材料的变形，但仍使活性剂沉积在材料内。

·从样品中释放AMC-109，并提供抗金黄色葡萄球菌和人类葡萄球菌(后者造成与硅酮内衬相关的多种难闻气味)的抗定殖和局部抗微生物功效。

AMC-109的释放量取决于溶胀时间。

实施例12

12.1将AMC-109掺入硅酮泡沫伤口敷料吸收剂中

制备含有AMC-109的硅酮伤口敷料

材料：Mepilex Lite(

Allevyn Gentle border(Smith&Nephew)

使用剪刀将来自市售敷料的硅酮泡沫吸收剂切割成2cm×2cm的正方形贴片。滴加具有不同量的AMC-109的乙醇溶液(400μl)以均匀地覆盖切片的表面，然后在通风橱中干燥72小时。仅使用乙醇以类似方式制备吸收敷料的对照样品。

12.2微生物分析

改良AATCC 100法

将金黄色葡萄球菌的过夜集落在0.9％NaCl中稀释至0.5McFarland(1×10

结果

金黄色葡萄球菌的集落形成计数(显示中值数据)。

结论

·可用AMC-109浸渍硅酮泡沫

·AMC-109从样品中释放并提供抗金黄色葡萄球菌的抗微生物功效。

实施例13

13.1通过“溶胀和干燥”法将AMC-109掺入固体硅酮中

硅酮膜样品：

由医用级硅酮(Tada Medical AB生产的固体硅酮膜瓣膜)组成的圆柱形部件(直径8mm，高6mm)。

溶胀和干燥

使用的溶胀溶剂是2-丙醇与戊烷的2：1(体积)混合物。进行四轮溶胀：

1.高负载——在含有AMC-109和不含AMC-109(1mg/0.120ml)的情况下，将硅酮瓣膜浸没在溶胀溶剂中30分钟

2.低负载——在含有AMC-109和不含AMC-109(0.2mg/0.120ml)的情况下，将硅酮瓣膜浸没在溶胀溶剂中30分钟

3.低负载并洗涤——将硅酮瓣膜浸入含有AMC-109(0.375mg/0.120ml)的溶胀溶剂中30分钟。将瓣膜干燥(1h)并洗涤(浸入2-丙醇中)和干燥(48h)。在不含AMC-109的溶胀溶剂中类似地处理对照材料。

4.低负载并扩大细菌组——将硅酮瓣膜浸没在含有AMC-109和不含AMC-109(0.2mg/0.120ml)的溶胀溶剂中30分钟。对表皮葡萄球菌(RP62a)、大肠杆菌(5067-6002)和铜绿假单胞菌(PAO1)进行试验。

13.2微生物学试验

改良AATCC 100法

将金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌的过夜集落在0.85％NaCl中稀释至0.5McFarland，产生1×10

通过溶胀和干燥法与AMC-109配混后，将TADA硅酮材料切割成0.4cm的片，片的直径为0.7cm，然后将片垂直切成两半。试验已切片和未切片的样品。用50μl细菌溶液(1×10

孵育后，将硅酮材料置于500μl NaCl中并涡旋20秒，然后进行系列稀释(0-10

13.3结果

溶胀功效

如所述进行溶胀，并且材料溶胀至相当大的程度(通过目视评估——瓣膜基部直径增加10-20％)。这种约15％的线性溶胀表示体积增加约50％。

干燥后，硅酮膜样品重新获得其原始尺寸(通过目视检查)。

微生物功效

与确定CFU在10

用AMC-109浸渍的硅酮膜样品的金黄色葡萄球菌(ATCC 8325)CFU值。

A*＝材料的原始表面

B*＝材料切片产生的表面

用AMC-109(低负载)浸渍的硅酮膜样品的表皮葡萄球菌(RP62a)、大肠杆菌(5067-6002)和铜绿假单胞菌(PAO1)CFU值。

A*＝材料的原始表面

所有材料在AMC-109存在下溶胀，显示无定殖和完全细菌杀灭。使用两种方法消除沉积在材料表面上的AMC-109(即，未真正一体化)；或者用2-丙醇洗涤，或者仅切割和暴露内表面。任一技术(单独或一起)证明了完全的抗微生物功效。

结论

·可以使用溶胀和干燥法将AMC-109浸渍到固体硅酮产物中。

·对金黄色葡萄球菌(ATCC 8325)、表皮葡萄球菌(RP62a)、大肠杆菌(5067-6002)和铜绿假单胞菌(PAO1)具有完全局部抗菌功效。

洗涤和切割实验的结果显示AMC-109浸渍到产品内部，但产品仍显示出非常好的抗定殖和局部抗微生物功效。