合成AAV衣壳用于肌肉和中枢神经系统障碍的基因治疗的用途

技术领域

本发明涉及包含肽修饰的猪AAV血清型1(AAVpo1)衣壳的重组猪腺相关病毒(AAV)载体在肌肉和/或中枢神经系统(CNS)障碍，特别是神经肌肉疾病(如遗传性神经肌肉疾病)的基因治疗中的用途。

背景技术

重组腺相关病毒(rAAV或AAV)载体广泛用于体内(in vivo)基因转移，并且目前正在进行使用AAV载体治疗多种疾病的临床试验。

AAV载体是由直径20nm的衣壳和4.7kb的单链DNA组成的非包膜载体。基因组携带两个基因，rep和cap，两侧是两个被称为反向末端重复序列(ITR)的回文区域。cap基因编码组成AAV衣壳的三种结构蛋白VP1、VP2和VP3。VP1、VP2和VP3共享同一个C端，即整个VP3。用AAV2有参考，VP1有735个氨基酸序列(GenBank YP_680426)；VP2(598个氨基酸)起始于苏氨酸138(T138)，且VP3(533个氨基酸)起始于甲硫氨酸203(M203)。

组织特异性由衣壳血清型决定，且从人(AAV2、3、5、6)和非人灵长类动物(AAV1、4、7-11)分离的常用AAV血清型可以比其他血清型更有效地转导特定器官，如肌肉组织中的AAV6、AAV8、AAV9和AAV-rh74以及神经组织中的AAV2、AAV9、AAVrh10、AAVcy.10、AAV-PHP.B、AAV-PHP.EB和进化枝F AAVHSC(如AAVHSC7、AAVHSC15和AAVHSC17)。

然而，迄今为止测试的所有常用的天然存在的AAV血清型及其变体都具有在肝脏内积累的倾向。这就产生了问题，特别是当AAV载体通过全身途径施用时。首先，旨在肌肉中表达的转基因可能对肝脏有毒性作用。其次，AAV载体进入肝脏会减少肌肉或神经组织可利用的载体数量。因此，需要更高剂量的AAV载体。这增加了诱导肝毒性的可能性和载体生产的成本。

此外，对AAV的预先存在的免疫是从人类和非人灵长类动物中分离的常用AVV载体血清型的缺点，特别是在高达80％的人类群体中呈血清阳性的AAV2，以及其它血清型(Fuet al,Hum Gene Ther Clin Dev.、2017Dec；28(4)：187-196；Stanford et al.、Res PractThromb Haemost.、2019、3：261-267°)。

已经使用来源于不同猪AAV(AAVpo1、po2.1、po4至6)的衣壳产生了重组AAV载体，并在小鼠中进行了全身施用，AAVpo1被报道在所有主要骨骼肌类型中具有强转基因表达以及其他组织的不良转导，包括从肝脏完全去靶向。AAV po2.1在外周施用后也从肝脏去靶向，而AAVpo4和AAVpo6有效转导所有主要器官样品，包括大脑。猪AAV载体不被针对所有其他常用AAV或合并的人IgG产生的抗血清交叉中和(Bello et al.、Gene Therapy、2009、16、1320-1328.doi：10.1038/gt.2009.82；Bello et al.、Sci Rep.、2014、4、6644、DOI：10.1038/srep06644；Tulalamba et al.、Gene Therapy、2019、doi.org/10.1038/s41434-019-0106-3；Puppo et al.、PLOS ONE、2013、8、e59025；WO 2009/030025)。总之，这使得重组猪AAV载体，特别是从肝脏去靶向的AAVpo1和AAV po2.1，成为用于肌肉疾病的人类基因治疗的有吸引力的载体。然而，用重组猪AAV载体获得的在肌肉中的转基因表达水平虽然高，但仍比AAV9低2-3倍，而AAV9通常被认为是肌肉定向基因治疗的金标准。此外，AAVpo1和AAV po2.1被报道脑转导效率较低。

已经生成在各种AAV血清型表面展示短肽的AAV衣壳变体文库，以筛选具有改变的细胞特异性和/或转导效率的基因治疗载体(

具有有效转导不同肌肉群和中枢神经系统的能力；选择性地并安全地全身递送的AAV载体将有益于许多人类疾病的基因治疗。

发明内容

本发明人已经使用了重组猪腺相关病毒(AAV)载体，其包含肽修饰的来自猪AAV血清型1(AAVpo1)的衣壳蛋白，以通过在小鼠中全身施用来递送目的治疗基因。同时测试了一些常用于肌肉(AAV8、AAV9)或中枢神经系统CNS(AAV9、AAVrh10)转导的最佳AAV载体血清型，以进行比较。发明人惊奇地发现，肽修饰的AAVpo1载体在不同的肌肉群和中枢神经系统(大脑和脊髓)中有利地实现了转基因表达水平，该表达水平即使不比AAV9载体的表达水平高，也至少与AAV9载体的表达水平相当，同时对肝脏去靶向。此外，预计这种猪AAV载体不会被针对普通AAV(人和非人灵长类AAV)的预先存在的抗体中和。由于以上所有原因，使用这种肽修饰的AAVpo1载体代表了一种用于肌肉和/或CNS障碍，特别是神经肌肉疾病(如遗传性神经肌肉疾病)的基因治疗的更有效的、选择性的且潜在更安全的治疗方法。在一些实施方案中，肽修饰的AAVpo1载体用于靶向神经系统细胞或神经系统细胞和肌肉细胞，用于治疗神经系统疾病和神经肌肉疾病，特别是遗传性神经系统疾病和遗传性神经肌肉疾病。

因此，本发明的一个方面涉及用于肌肉和中枢神经系统(CNS)障碍的基因治疗的重组猪腺相关病毒(AAV)载体，其包含肽修饰的来自猪AAV血清型1的衣壳蛋白；特别是神经系统障碍和影响神经系统的神经肌肉障碍，例如CNS障碍和影响CNS的神经肌肉障碍。

在一些实施方案中，根据本发明的用于其用途的重组猪AAV载体的特征在于，在全身施用，特别是静脉内施用后，在不同肌肉群中，以及在大脑和脊髓中肝脏去靶向和转基因表达水平的组合，其如果不优于AAV9载体，也至少等同于AAV9载体。

在一些实施方案中，所述肽修饰衣壳蛋白包含至少一种肽，该肽包含序列MPLGAAG(SEQ ID NO:2)或在所述序列中仅包含一个或两个氨基酸突变(插入、缺失、取代)的变体，优选在所述序列中包含一个或两个氨基酸取代。在一些优选实施方案中，肽包含序列GMPLGAAGA(SEQ ID NO:3)，或在所述序列中包含至多四个(1、2、3或4个)氨基酸突变(插入、缺失、取代)的变体，优选在所述序列中仅有一个或两个氨基酸缺失或取代，所述缺失位于N-和/或C-末端则较为有利。在一些优选实施方案中，序列SEQ ID NO:2或3或其变体在其N-和/或C-末端侧接至多5个氨基酸，例如分别在其N-和C-末端的GQR和GAA。在一些更优选实施方案中，肽包含序列GQRGMPLGAAGAQAA(SEQ ID NO:4)或由其组成。

在一些实施方案中，所述肽被插入衣壳蛋白的残基N567和S568之间或残基N569和T570之间；所述位置通过与SEQ ID NO:1的比对来确定。优选地，所述肽被插入位置N567和S568之间，并替换来自位置565-567和568-570的所有残基，或者所述肽被插入位置N569和T570之间，并替换来自位置567-569和570-572的所有残基；所述位置通过与SEQ ID NO:1的比对来确定。

在一些优选实施方案中，所述肽修饰AAVpo1衣壳蛋白包含选自下组的序列：序列SEQ ID NO:5和与包含根据本公开的所述肽的SEQ ID NO:5具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列、以及其对应于VP2或VP3衣壳蛋白的片段。

在一些实施方案中，所述重组猪AAV载体是包装有用于治疗的目的基因的载体颗粒。

在一些优选实施方案中，目的基因与在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性的启动子可操作地连接。

在一些优选的实施方案中，所述用于治疗的目的基因选自：

(i)治疗性基因；

(ii)编码治疗性蛋白或肽的基因，诸如治疗性抗体或抗体片段和基因组编辑酶；以及

(iii)编码治疗性RNA的基因，诸如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA。

在一些实施方案中，疾病是神经肌肉疾病，优选遗传性神经肌肉疾病。优选地，该疾病是影响神经系统的神经肌肉疾病，优选地是影响神经系统的遗传性神经肌肉疾病。

在一些实施方案中，所述遗传性神经肌肉疾病选自下组：(i)肌病，例如遗传性心肌病、代谢性肌病、其他肌病、远端肌病、肌营养不良和先天性肌病；和(ii)脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病；优选先天性肌病和肌营养不良，以及脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病。

在一些实施方案中，所述用于治疗的目的基因是选自下组的导致遗传性神经肌肉障碍的基因的功能性版本：杜氏肌营养不良症、贝克肌营养不良症、肢带型肌营养不良症、强直性肌营养不良、肌小管肌病、中央核肌病、杆状体肌病、硒蛋白N相关肌病、庞贝氏症、糖原累积病III、脊髓性肌萎缩症、肌萎缩性侧索硬化症、或靶向导致疾病的所述基因的治疗性RNA。

在一些实施方案中，所述导致遗传性神经肌肉障碍的基因选自下组：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、MTM1、DNM2、BIN1、ACTA1、KLHL40、KLHL41、KBTBD13、TPM3、TPM2、TNNT1、CFL2、LMOD3、SEPN1、GAA、AGL、SMN1和ASAH1基因。

在一些优选的实施方案中，所述遗传性神经肌肉疾病选自下组：(i)肌病，例如包括先天性肌营养不良的肌营养不良，；(ii)脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病；(iii)肌强直综合征，特别是1型和2型强直性肌营养不良；(iv)遗传性运动及感觉神经病变；(v)遗传性截瘫和遗传性共济失调；(vi)先天性肌无力综合征；优选先天性肌无力综合征、包括先天性肌营养不良的肌营养不良、脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病。

在一些优选实施方案中，用于治疗的目的基因是选自下组的导致影响神经系统的遗传性神经肌肉障碍的基因的功能性版本：杜氏肌营养不良和贝克肌营养不良(DMD基因)；肢带型肌营养不良(DYSF、FKRP基因)；强直性肌营养不良1型(DMPK基因)和2型(CNBP/ZNF9基因)；中央核肌病(DNM2、BIN1基因)；庞贝氏症(GAA基因)；糖原累积病III(AGL基因)；脊髓性肌萎缩症(SMN1、ASAH1基因)；肌萎缩性侧索硬化(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN和其它)；遗传性截瘫(SPAST(SPG4)、SPG7和其他SPG基因，如SPG11、SPG20和SPG21)；腓骨肌萎缩症，4B1型(MTMR2)、以及先天性肌无力综合征(CHAT、AGRN)，或靶向导致疾病的所述基因的治疗性RNA

在一些更优选的实施方案中，所述导致影响神经系统的遗传性神经肌肉障碍的基因选自下组：DMD、DYSF、FKRP、DNM2、BIN1、GAA、AGL、SMN1和ASAH1基因。

在其它更优选的实施方案中，所述导致影响神经系统的遗传性神经肌肉障碍的基因选自下组：FKTN、POMT1、POMT2、POMGNT1、POMGNT2、LMNA、ISPD、GMPPB、LARGE、LAMA2、TRIM32和B3GALNT2基因。

在一些实施方案中，所述重组猪AAV载体用于脊髓性肌萎缩症的基因治疗，并且所述载体包含肽修饰衣壳蛋白，所述肽修饰衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5或与包含SEQ IDNO:2至4中任一项的肽的所述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述载体进一步包装与在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性的启动子可操作地连接的人SMN1基因。

在一些实施方案中，根据本公开的重组猪AAV载体被全身施用，优选静脉内施用。

在一些实施方案中，根据本公开的重组猪AAV载体用于治疗神经肌肉疾病的方法中。

具体实施方式

肽修饰AAVpo1载体

本发明涉及包含肽修饰猪AAV血清型1衣壳蛋白的重组腺相关病毒载体，其用于肌肉和神经系统障碍，例如肌肉和中枢神经系统(CNS)障碍的基因治疗。所述包含肽修饰猪AAV血清型1衣壳蛋白的重组腺相关病毒载体可用于仅影响神经系统(PNS和/或CNS)或影响神经系统和肌肉的疾病的基因治疗。特别地，这些疾病包括中枢神经系统(CNS)疾病和神经肌肉疾病。

根据本发明的用于其用途的包含肽修饰衣壳蛋白的猪AAV血清型1(AAVpo1)载体(或肽修饰的AAVpo1载体)结合从非靶器官(特别包括肝脏)的去靶向和在靶器官(即神经系统，如CNS；或肌肉和神经系统，如肌肉和CNS)中的高转基因表达水平。

如本文所用，术语“去靶向”是指将在非靶器官中的载体转导和转基因表达降低至最低水平，优选尽可能接近检测极限。与以相同剂量全身施用后的AAV8、AAV9载体相比，根据本公开的肽修饰AAVpo1载体(其在转导水平上去靶向)有利地包含每二倍体基因组至少低10倍的载体基因组拷贝数。如果使用表达人类转基因的载体，根据本公开的肽修饰的AAVpo1载体(其在转基因表达水平上去靶向)有利地包含来源于载体的低于所述蛋白质的内源水平的蛋白质水平。

如本文所用，术语“肌肉”是指心肌(即心脏)和骨骼肌。

如本文所用，术语“肌肉细胞”指肌细胞、肌管、成肌细胞和/或卫星细胞。

如本文所用，术语“神经系统”指中枢(CNS)和外周(PNS)神经系统两者。

如本文所用，术语“中枢神经系统或CNS”是指大脑、脊髓、视网膜、耳蜗、视神经和/或嗅神经和上皮。如本文所用，术语CNS细胞指CNS的任何细胞，包括神经元和神经胶质细胞(少突胶质细胞、星形胶质细胞、室管膜细胞、小胶质细胞)。

如本文所用，PNS指大脑和脊髓外的神经和神经节。

如本文所用，术语“全身施用”是指将物质(载体)施用至循环系统的途径，包括肠内或非肠道施用。非肠道施用包括注射、输液、植入和其他。

如本文所用，术语“AAV载体”是指AAV载体颗粒。

如本文所用，术语“猪AAV载体或AAVpo1载体”指包含猪AAV血清型1衣壳蛋白的AAV载体。

如本文所用，术语AAV血清型包括天然和人工AAV血清型，例如衍生自天然AAV血清型的变体和杂交衣壳。AAV血清型指能够转导靶器官并在所述靶器官中表达转基因的功能性AAV衣壳。

如本文所用，“用于肌肉和神经系统障碍，如肌肉和中枢神经系统(CNS)障碍的基因治疗”是指“通过基因治疗用于治疗肌肉和神经系统障碍，如肌肉和中枢神经系统(CNS)障碍”或“用于通过基因治疗治疗肌肉和神经系统障碍，如肌肉和中枢神经系统(CNS)障碍”。

如本文所用，“或”是指“和/或”。

神经肌肉障碍(NMD)是一个非常宽泛的术语，涵盖一系列损害肌肉功能的病症，这些病症或者直接地是随意肌的病状，或者间接地是外周神经系统或神经肌肉接头的病状。神经肌肉疾病是一组广泛定义的障碍，均涉及外周神经或肌肉或神经肌肉接头的损伤或功能障碍。损伤位点可以在细胞体(即肌萎缩性侧索硬化[ALS]或感觉神经节病变)、轴突(即轴突外周神经病或臂丛神经病变)、施万细胞(即慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病)、神经肌肉接头(即重症肌无力或Lambert-Eaton肌无力综合征)、肌肉(即炎性肌病或肌营养不良)或这些位点的任何组合中。一些神经肌肉疾病也与中枢神经系统疾病有关，如ALS。

如本文所用，“影响神经系统的神经肌肉疾病或障碍”是指包括神经系统损伤的神经肌肉疾病。所述神经肌肉疾病可进一步包括肌肉损伤，例如由原发性神经系统损伤导致的继发性肌肉损伤。

在一些实施方案中，根据本发明的用于其用途的肽修饰的AAVpo1载体在全身施用后，在靶器官(即神经系统，如CNS；或肌肉和神经系统，如肌肉和CNS)中产生高转基因表达水平，同时从肝脏中去靶向。与包含未被肽修饰的衣壳的对照AAVpo1载体相比，用肽修饰的AAVpo1载体有利地增加了在神经系统(如CNS)、或肌肉和神经系统(如肌肉和CNS)中的转导(载体拷贝数)。与包含未被肽修饰的衣壳的对照AAVpo1载体相比，用肽修饰的AAVpo1载体优选将肌肉和神经系统(例如肌肉和CNS)中的转基因表达水平增加至少两倍，优选3、4、5倍或更多倍，特别是在骨骼肌和中枢神经系统中。用肽修饰的AAVpo1载体在不同的肌肉类型和神经系统中，例如在不同的肌肉类型和CNS中达到的转基因表达水平优选至少与AAV8、AAV9、AAVrh10载体处于相同的量级(低于1.5倍；即等同于)。

载体转导和转基因表达通过在本领域众所周知的以及在本申请的实施例中有所公开的动物模型(例如小鼠模型)中全身施用所述肽修饰的AAVpo1载体来确定的。包含未修饰衣壳的AAVpo1载体和通常用于肌肉转导的最佳AAV载体血清型(AAV2、AAV8、AAV9、AAVrh10和/或其它)被有利地用于比较。载体转导可以通过本领域众所周知的标准测定法(例如本申请实施例中公开的实时PCR测定法)测量每个二倍体基因组的载体基因组拷贝数来确定。通过本领域众所周知的标准试验，例如如在本申请的实施例中公开的定量RT-PCR试验和定量蛋白质印迹分析，在mRNA或蛋白质水平上测量转基因表达。

在一些实施方案中，根据本发明的用于其用途的肽修饰的AAVpo1载体从肝脏和至少另一个非靶器官(如脾)中去靶向。

在一些实施方案中，根据本发明的用于其用途的肽修饰的AAVpo1载体在全身施用，特别是静脉内施用后，有利地在不同肌肉群，优选包括主要肌肉群中产生高转基因表达水平。组成人体上部的主要骨骼肌群是腹肌、胸肌、三角肌、斜方肌、背阔肌、竖脊肌、二头肌、三头肌和膈肌。人体下部的主要骨骼肌群是四头肌、腘绳肌、腓肠肌、比目鱼肌和臀肌。小腿前部的肌肉是胫骨前肌、趾长伸肌、拇长伸肌、腓骨长肌、腓骨短肌和腓骨第三肌。本申请的实施例(图5)说明了全身施用后所述肽修饰的AAVpo1载体在不同肌肉群中产生高转基因表达水平的能力，显示了静脉注射所述肽修饰的AAVpo1载体的小鼠的胫骨肌(TA)、趾长伸肌(EDL)、四头肌(Qua)、腓肠肌(Ga)、比目鱼肌(Sol)、三头肌、二头肌和膈肌中的高转基因表达水平。

在一些实施方案中，根据本发明的用于其用途的肽修饰的AAVpo1载体的特征在于，在全身施用，特别是静脉内施用后，在不同肌肉群中以及在大脑和脊髓中肝脏去靶向和转基因表达水平的组合，其如果不优于AAV9载体，也至少等同于AAV9载体。

AAVpo1(2016年7月24日获得的GenBank登录号FJ688147)包含部分病毒基因组序列的位置780至2930的Cap基因(2977bp)：VP1CDS位于位置780至2930；VP2 CDS是从位置1188到2930，且VP3CDS是从位置1329到2930。AAVpo1衣壳蛋白(VP1)具有2016年7月24日获得的序列GenBank登录号ACN42940.1或SEQ ID NO:1。杂交载体包括例如包含AAVpo1衣壳和AAV2 rep蛋白和/或AAV2ITRs的载体。AAVpo1血清型包括如上所列的天然AAVpo1血清型以及衍生自所述血清型的任何人工变体或杂合体。本发明涵盖衍生自与上述AAVpo1衣壳序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的AAV衣壳序列的肽修饰的AAVpo1载体的用途。

在一些实施方案中，所述肽修饰的AAVpo1衣壳蛋白衍生自与序列SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的AAV衣壳序列。

术语“同一性”指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，那么相应的分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共有的匹配位置数除以比较的位置数并乘以100。通常，当两个序列进行比对以给出最大的同一性的方式时，进行比较。可以通过使用例如GCG(遗传学计算机组，GCG软件包程序手册，第7版，麦迪逊，威斯康星州)堆积程序或任何序列比较算法(如BLAST、FASTA或CLUSTALW)进行比对来计算同一性。

肽优选具有至多30个氨基酸。在一些优选实施方案中，肽具有至多25、20或15个氨基酸(即，25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个氨基酸)。

在一些实施方案中，肽优选具有至多30个氨基酸，包含或由序列MPLGAAG(SEQ IDNO:2)或在所述序列中仅包含一个或两个氨基酸突变(插入、缺失、取代)的变体组成，优选在所述序列中包含一个或两个氨基酸取代。在一些优选实施方案中，肽包含或由序列GMPLGAAGA(SEQ ID NO:3)，或在所述序列中包含至多四个(1、2、3或4个)氨基酸突变(插入、缺失、取代)的变体组成，优选在所述序列中仅有一个或两个氨基酸缺失或取代；所述缺失有利地位于N-和/或C-末端。在一些优选实施方案中，如上定义的序列SEQ ID NO:2或3或其变体在其N-和/或C-末端侧接至多五个(1、2、3、4、5)或更多个氨基酸，例如分别在其N-和C-末端的GQR和QAA。或者，侧接序列可以包含或由丙氨酸(A)残基组成。在一些更优选实施方案中，肽包含或由序列GQRGMPLGAAGAQAA(SEQ ID NO:4)组成。

肽修饰的AAVpo1衣壳蛋白包含至少一个拷贝的被插入AAVpo1衣壳蛋白的肽。根据插入的位置，肽可以被插入VP1、VP1和VP2或VP1、VP2和VP3中。肽修饰的AAVpo1衣壳蛋白可包含至多5个拷贝的肽，优选1个拷贝的所述肽。

根据本发明的肽修饰的AAVpo1衣壳蛋白包含被插入暴露于AAV衣壳表面的位点的一个或多个肽。AAV衣壳上暴露在衣壳表面并容许肽插入的位点，即不影响病毒衣壳的装配和包装的位点，是本领域众所周知的，包括例如AAV衣壳表面环或抗原环(Girod et al.,Nat.Med.,1999,5,1052-1056；Grifman et al.,Molecular Therapy,2001,3,964-975)；其他位点公开于Rabinowitz et al.,Virology,1999,265,274-285；Wu et al.,J.Virol.,2000,74,8635-8647。

特别地，根据SEQ ID NO:1中的编号，将至少一种肽插入衣壳蛋白的位置N567、S568、N569、T570中的任一位，优选在衣壳蛋白的位置N567和S568之间或位置N569和T570之间。所述肽的插入可以导致或不导致肽插入位点之前和/或之后的一些残基的缺失，优选1-3个(1、2、3)所述残基。在一些实施方案中，肽被插入位置N567和S568之间，并替换了来自位置565-567和568-570的所有残基。在一些其他实施方案中，肽被插入位置N569和T570之间，并替换了来自位置567-569和570-572的所有残基。参考SEQ ID NO:1的AAVpo1衣壳蛋白来指示所述位置；在与SEQ ID NO:1比对后，本领域技术人员将能够容易地找到另一个AAVpo1衣壳蛋白序列中的相应位置。

在一些优选实施方案中，所述肽修饰的AAVpo1衣壳蛋白包含选自下组的序列：序列SEQ ID NO:5和与包含根据本公开的所述肽的SEQ ID NO:5具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，以及其对应于VP2或VP3衣壳蛋白的片段。VP2对应于从K136到SEQ ID NO:5末端的氨基酸序列。VP3对应于从M184到SEQ ID NO:5末端的氨基酸序列。在一些优选实施方案中，所述肽修饰的AAVpo1衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5，或其对应于VP2或VP3衣壳蛋白的片段。

本发明还涵盖衍生自根据本公开的肽修饰的AAVpo1 VP3衣壳蛋白的AAVpo1 VP1和VP2嵌合衣壳蛋白，其中VP1-特异性N-末端区和/或VP2-特异性N-末端区来自另一种天然或人工AAV血清型，优选选自已知AAVpo血清型的另一种AAVpo血清型，特别是AAVpo2.1血清型。本发明还涵盖镶嵌肽修饰的AAVpo1载体，其中载体颗粒还包含来自另一种天然或人工AAV血清型的另一种AAV衣壳蛋白，优选选自已知AAVpo血清型的另一种AAVpo血清型，特别是根据本公开的AAVpo2.1血清型。

所述肽修饰AAVpo1载体的基因组可以是单链或自互补的双链基因组(McCarty etal,Gene Therapy,2003,Dec.,10(26),2112-2118)。通过从AAV末端重复序列中的一个删除末端解离位点(trs)产生自互补载体。这些经修饰的载体(其复制基因组是野生型AAV基因组长度的一半)具有包装DNA二聚体的趋势。AAV基因组侧接ITRs。在特定的实施方案中，AAV载体是假型载体，即其基因组和衣壳衍生自不同血清型的AAV。在一些优选实施方案中，所述假型载体的基因组衍生自AAV2。

根据本公开的用于其用途的肽修饰的AAVpo1载体通过本领域众所周知的用于生产AAV载体的标准方法来生产(Review in Aponte-Ubillus et al.,AppliedMicrobiology and Biotechnology,2018,102:1045-1054)。简而言之，在用AAV Rep和衣壳蛋白的表达质粒和含有重组AAV载体基因组的质粒共转染后，所述重组载体基因组包含插入表达盒中的目的基因，侧接有AAV ITRs，在存在足够的辅助功能以允许rAAV载体基因组包装到AAV衣壳颗粒中的情况下，将细胞孵育足够的时间以允许AAV载体颗粒的产生，然后收获细胞，裂解细胞，并通过标准纯化方法(如亲和层析或碘克沙醇或氯化铯密度梯度超速离心)来纯化AAV载体颗粒。

所述肽修饰的AAVpo1载体颗粒通常包装用于治疗的目的基因。“用于治疗的目的基因”、“治疗目的的基因”、“目的基因”或“异源目的基因”是指治疗性基因或编码治疗性蛋白质、肽或RNA的基因。治疗性基因可以与基因组编辑酶联合使用。

目的基因是能够在靶器官(即神经系统，如CNS；或肌肉和/或神经系统，如肌肉和CNS)的细胞中修饰靶基因或靶细胞途径的任何核酸序列。根据疾病的类型，所述靶器官可以主要包括神经系统，例如CNS，或者还可以包括肌肉。在一些特定实施方案中，所述靶器官至少包括神经系统，例如CNS。在一些优选实施方案中，所述靶器官包括神经系统和肌肉，例如CNS和肌肉。例如，所述基因可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调节。在一些实施方案中，目的基因是基因或其片段的功能性版本。所述基因的功能性版本包括野生型基因、变体基因(例如属于相同家族和其他家族的变体)或截短的版本，其至少部分保留了所编码蛋白质的功能。基因的功能性版本可用于替换或附加基因治疗，以替换患者体内有缺陷或无功能的基因。在其他实施方案中，目的基因是使导致常染色体显性遗传疾病的显性等位基因失活的基因。基因片段可用作重组模板，与基因组编辑酶组合使用。

或者，目的基因可以编码用于特定应用的目的蛋白质(例如抗体或抗体片段、基因组编辑酶)或RNA。在一些实施方案中，蛋白质是治疗性蛋白质，包括治疗性抗体或抗体片段，或基因组编辑酶。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。

在一些实施方案中，所述目的基因的序列被优化而用于在经治疗的个体，优选在人类个体中表达。序列优化可以包括核酸序列中的许多变化，包括密码子优化、GC含量的增加、CpG岛数量的减少、可选开放阅读框(ARF)数量的减少和/或剪接供体和剪接受体位点数量的减少。

目的基因是能够在疾病的靶细胞中产生编码的蛋白质、肽或RNA的功能性基因，特别是肌肉细胞和神经系统(CNS和/或PNS)细胞，例如肌肉细胞和CNS细胞。根据疾病的类型，靶细胞可以主要包括神经系统细胞，例如CNS细胞，或者可以进一步包括肌肉细胞。在一些特定的实施方案中，疾病的靶细胞至少包括神经系统细胞，例如CNS细胞。在一些优选实施方案中，疾病的靶细胞包括神经系统细胞和肌肉细胞，例如CNS细胞和肌肉细胞。在一些实施方案中，目的基因是人类基因。肽修饰的AAVpo1载体以在靶器官(即神经系统，如CNS；或肌肉和/或神经系统，例如肌肉和/或CNS)细胞中可表达的形式包含目的基因。在一些特定的实施方案中，目的基因是至少在神经系统细胞(如CNS细胞)中可表达的形式。在一些优选实施方案中，目的基因是在神经系统细胞和肌肉细胞中可表达的形式，例如CNS细胞和肌肉细胞。特别地，目的基因可以与用于在个体的靶细胞、组织或器官中的转基因表达的适当调节序列可操作地连接。本领域众所周知的这种序列特别包括启动子和能够进一步控制所述转基因表达的其他调节序列，例如但不限于增强子、终止子、内含子、沉默子，特别是组织特异性沉默子和microRNA。目的基因与在靶器官(即肌肉和/或神经系统，如肌肉和/或CNS)的细胞中具有功能性的遍在的、组织特异性的或诱导型启动子可操作地连接。在一些特定实施方案中，靶器官至少包括神经系统，例如CNS。在一些优选实施方案中，靶器官包括神经系统和肌肉，例如CNS和肌肉。在一些特定实施方案中，目的基因与在神经系统细胞，如神经元和/或神经胶质细胞中；或者在神经系统细胞中，例如神经元和/或神经胶质细胞，以及在肌肉细胞中具有功能性的遍在的、组织特异性的或诱导型的启动子可操作地连接。在一些具体实施方案中，目的基因与至少两个启动子可操作地连接，其中至少一个是神经元和/或神经胶质细胞特异性或诱导型启动子，其在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性。在一些具体实施方案中，所述目的基因与至少两个启动子可操作地连接，其中一个是神经元和/或神经胶质细胞特异性或诱导型启动子，其在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性且另一个是肌肉特异性或诱导型启动子，其在肌肉细胞中具有功能性。

可以将目的基因插入到表达盒中，该表达盒还包含如上所述的额外的调节序列。遍在启动子的实例包括CAG启动子、磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子、巨细胞病毒增强子/启动子(CMV)、SV40早期启动子、逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子和EF1启动子。

肌肉特异性启动子包括但不限于结蛋白(Des)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、CK6启动子、α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、肌球蛋白轻链2(MLC-2)启动子、心肌肌钙蛋白C(cTnC)启动子、合成肌肉特异性SpC5-12启动子、人骨骼肌肌动蛋白(HSA)启动子。

用于在神经系统(如CNS表达)的启动子包括驱动遍在表达的启动子和驱动进入神经元表达的启动子。驱动遍在表达的代表性启动子，但不限于：CAG启动子(包括巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白基因的第一外显子和第一内含子以及兔β-珠蛋白基因的剪接受体)；PGK(磷酸甘油酸激酶1)启动子；β-肌动蛋白启动子；EF1a启动子；CMV启动子。驱动进入神经元表达的代表性启动子包括但不限于降钙素基因相关肽(CGRP)的启动子，这是一种已知的运动神经元衍生因子。其他神经元选择性启动子包括胆碱乙酰转移酶(ChAT)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、突触蛋白、Hb9的启动子和包括神经元限制性沉默元件(NRSE)的遍在启动子。驱动神经胶质细胞中选择性表达的代表性启动子包括神经胶质纤维酸性蛋白基因(GFAP)的启动子。

对于在肌肉细胞(骨骼肌和心肌细胞)中的表达，目的基因有利地结蛋白启动子，特别是人结蛋白启动子的控制之下(Raguz et al.,Dev.Biol.,1998,201,26-42；PaulinD&Li Z,Exp.Cell.Res.,2004,Nov 15；301(1):1-7)。对于在骨骼肌细胞中的表达，目的基因有利地处于结蛋白启动子，特别是人结蛋白启动子的控制之下，并且还包含抑制在心肌细胞中表达的miR208a靶序列(即在心脏中；Roudault et al.,Circulation,2013,128,1094-104.doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.113.001340)。

所述RNA有利地与靶DNA或RNA序列互补或与靶蛋白结合。例如，所述RNA是干扰RNA，如shRNA、microRNA、与Cas酶或类似酶联合用于基因组编辑的向导RNA(gRNA)、能够外显子跳跃的反义RNA，如修饰的小核RNA(snRNA)或长的非编码RNA。干扰RNA或microRNA可用于调节与肌肉或神经系统疾病(如肌肉或CNS疾病)相关的靶基因的表达。在一些实施方案中，疾病是神经系统疾病，例如CNS疾病。根据该实施方案，靶基因在神经系统细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞。在一些其他实施方案中，疾病是神经系统和肌肉的疾病，例如CNS和肌肉的疾病。根据该另一个实施方案，靶基因至少存在于神经系统细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞；靶基因可以基本上在神经系统细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞；或者可以在神经系统细胞和肌肉细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞和肌肉细胞。与Cas酶或用于基因组编辑的类似酶复合的向导RNA可用于修饰靶基因的序列，特别是校正突变/缺陷基因的序列或修饰疾病中涉及的靶基因的表达，特别是肌肉或神经系统障碍，如肌肉或中枢神经系统(CNS)障碍。能够外显子跳跃的反义RNA特别用于校正阅读框和恢复具有被破坏的阅读框的缺陷基因的表达。在一些实施方案中，RNA是治疗性RNA。

根据本发明的基因组编辑酶是能够修饰靶基因或靶细胞途径的任何酶或酶复合物，特别是在肌肉细胞和/或神经系统细胞中，例如在肌肉细胞和/或CNS细胞中。在一些实施方案中，靶基因至少在神经系统细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞；靶基因可以基本上在神经系统中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞；或者可以在神经系统细胞和肌肉细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞和肌肉细胞。在一些具体实施方案中，靶基因在神经系统细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞。在一些其他具体实施方案中，靶基因在神经系统细胞和肌肉细胞中，例如CNS和/或PNS细胞，特别包括神经元和/或神经胶质细胞和肌肉细胞。例如，基因组编辑酶可以修饰靶基因或细胞途径的表达、序列或调节。基因组编辑酶有利地是工程化核酸酶，例如但不限于巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALENs)、来自成簇的规则间隔回文重复序列(CRISPR)-Cas系统的Cas酶和类似的酶。基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶(如Cas酶)和类似的酶，可以是在靶基因组座中产生双链断裂(DSB)或单链DNA断裂(缺口酶，如Cas9(D10A))的功能性核酸酶，并用于位点特异性基因组编辑应用，包括但不限于：基因校正、基因置换、基因敲入、基因敲除、诱变、染色体易位、染色体缺失等。对于位点特异性基因组编辑应用，基因组编辑酶，特别是工程化核酸酶(如Cas酶)和类似的酶可以与同源重组(HR)基质或模板(也称为DNA供体模板)组合使用，该基质或模板通过双链断裂(DSB)诱导的同源重组来修饰靶基因组座。特别地，HR模板可将目的转基因引入靶基因组座或修复靶基因组座中的突变，优选修复引起肌肉或神经系统(如肌肉或中枢神经系统(CNS)障碍)的异常或缺陷基因中的突变。在一些实施方案中，疾病是神经系统疾病，例如CNS疾病。在一些其他实施方案中，疾病是神经系统和肌肉疾病，特别是诸如CNS疾病和肌肉疾病。或者，基因组编辑酶，例如Cas酶和类似的酶可以被工程化成核酸酶缺陷型，并用作各种基因组工程应用中的DNA结合蛋白，例如但不限于：转录激活、转录抑制、表观基因组修饰、基因组成像、DNA或RNA pull-down等。

在一些实施方案中，包装用于治疗的目的基因的肽修饰AAVpo1载体颗粒靶向骨骼肌细胞和/或神经元。

根据本发明的用于其用途的优选载体的实例是包含肽修饰衣壳蛋白的AAVpo1载体，所述衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5或与包含SEQ ID NO:2-4中任一项的肽的所述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述载体进一步包装用于治疗的目的基因，所述基因与结蛋白启动子，优选人结蛋白启动子可操作地连接，并最终进一步与miR208a靶序列可操作地连接。该第一载体可用于在肌肉中表达目的基因。(骨骼和心脏；不含miR208a靶序列的表达盒)或仅在骨骼肌中表达(含miR208a靶序列的表达盒)，但在全身施用，特别是血管内施用后，在肝脏中不表达。

根据本发明的用于其用途的优选载体的另一个实例是包含肽修饰衣壳蛋白的AAVpo1载体，所述衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5或与包含SEQ ID NO:2-4中任一项的肽的所述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述载体进一步包装用于治疗的目的基因，所述基因与CAG启动子可操作地连接，并且优选进一步包含人β珠蛋白多聚腺苷酸化信号。该第二载体可用于在包括心脏在内的肌肉和神经系统中表达目的基因，例如在全身施用，特别是血管内施用后，在包括心脏在内的肌肉和CNS中表达，但在肝脏中不表达。

根据本发明的用于其用途的优选载体的另一个实例是AAVpo1载体，其包含肽修饰衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5或与包含SEQ ID NO:2-4中任一项的肽的所述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述载体进一步包装用于治疗的目的基因，所述基因与在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性的启动子可操作地连接。所述启动子可以是遍在启动子，如CAG或其它启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子，其在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性。在一些具体实施方案中，所述启动子是神经元和/或神经胶质细胞特异性或诱导型启动子，其在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性。该第三载体可用于在全身施用，特别是血管内施用后，在神经系统中表达目的基因，但在肝脏中不表达。

根据本发明的用于其用途的优选载体的另一个实例是包含肽修饰衣壳蛋白的AAVpo1载体，所述衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5或与包含SEQ ID NO:2-4中任一项的肽的所述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述载体进一步包装用于治疗的目的基因，所述基因与在肌肉细胞以及神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性的启动子或启动子组合可操作地连接。该第四载体可用于在包括心脏在内的肌肉和神经系统中表达目的基因，例如在全身施用，特别是血管内施用后，在包括心脏在内的肌肉和中枢神经系统中表达，但在肝脏中不表达。启动子可以是遍在启动子，如CAG或其它启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子，或所述启动子的组合，包括在肌肉细胞中具有功能性的第一启动子和在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性的第二启动子。在一些具体实施方案中，目的基因与至少两个启动子可操作地连接，其中一个是神经元和/或神经胶质细胞特异性或诱导型启动子，其在神经元和/或神经胶质细胞中具有功能性，且另一个是肌肉特异性或诱导型启动子，其在肌肉细胞中具有功能性。

肌肉和神经系统障碍(如肌肉和CNS障碍)的基因治疗

根据本公开的肽修饰的AAVpo1载体用于肌肉和/或神经系统疾病或障碍(例如肌肉和/或CNS疾病或障碍)的基因治疗。在一些实施方案中，根据本发明的肽修饰的AAVpo1载体用于影响至少神经系统(例如CNS)的疾病的基因治疗，其中所述疾病可主要影响神经系统(例如CNS)或可影响神经系统和肌肉(例如CNS和肌肉)。例如，该疾病可主要影响神经系统，并且神经系统的原发性损伤可能导致肌肉的继发性损伤。在一些特定的实施方案中，根据本公开的肽修饰的AAVpo1载体用于神经系统疾病，特别是CNS疾病的基因治疗。在一些其他具体实施方案中，根据本公开的肽修饰的AAVpo1载体用于神经系统和肌肉疾病的基因治疗，例如CNS和肌肉的疾病，特别是影响至少神经系统(CNS和/或PNS)的神经肌肉疾病。

根据本公开的肽修饰的AAVpo1载体优选以药物组合物的形式使用，所述药物组合物包含治疗有效量的肽修饰的AAVpo1载体颗粒，优选包装根据本公开的治疗性目的基因的肽修饰的AAVpo1载体颗粒。

基因治疗可以通过基因转移、基因编辑、外显子跳跃、RNA干扰、反式剪接或对细胞中任何编码或调节序列的任何其它遗传修饰来进行，包括包含在细胞核、线粒体中的序列或作为共生核酸的序列，例如但不限于细胞中包含的病毒序列。

基因治疗的两种主要类型如下：

-旨在为缺陷/异常基因提供功能性替代基因的治疗：此为替代或附加基因治疗；

-旨在基因或基因组编辑的治疗：在这种情况下，目的是为细胞提供必要的工具来纠正序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调节，以便表达功能性基因或抑制异常基因(失活)：此为基因编辑治疗。

在附加基因治疗中，目的基因可以是基因的功能性版本，其在患者中是缺陷的或突变的，例如在遗传病中。在这种情况下，目的基因将恢复功能性基因的表达。

基因或基因组编辑使用一个或多个目的基因，例如：

(i)编码如上定义的治疗性RNA的基因，例如干扰RNA如shRNA或microRNA，与Cas酶或类似酶组合使用的向导RNA(gRNA)或能够外显子跳跃的反义RNA如修饰的小核RNA(snRNA)；和

(ii)编码如上定义的基因组编辑酶的基因，例如工程化核酸酶，如巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物基核酸酶(TALENs)、Cas酶或类似酶；或者这些基因的组合，也可以是用作重组模板的基因功能性版本的片段，如上所述。

基因治疗用于治疗影响肌肉和/或神经系统，例如肌肉和/或CNS，包括骨骼肌或心肌、脑或脊髓的结构或功能的各种遗传性(基因性)或获得性疾病或障碍。这些疾病可以是由创伤、感染、变性、结构或代谢缺陷、肿瘤、自身免疫性疾病、中风或其他引起的。在一些实施方案中，基因治疗用于治疗影响至少神经系统(PNS和/或CNS)，特别是CNS，包括脑和/或脊髓的结构或功能的遗传性(遗传性)或获得性疾病或障碍。该疾病可主要影响神经系统(PNS和/或CNS)，特别是CNS，包括脑和/或脊髓，或者可进一步影响肌肉，包括骨骼肌和/或心肌。在一些特定的实施方案中，疾病是神经系统疾病，特别是CNS疾病和/或PNS疾病；CNS疾病可影响大脑和/或脊髓。在一些其他具体实施方案中，疾病是神经系统(PNS和/或CNS)和肌肉的疾病，例如CNS和肌肉的疾病；该疾病影响神经系统，如大脑和/或脊髓，并进一步影响肌肉，如骨骼肌和/或心肌。如本文所用，神经系统和肌肉疾病包括继发性肌肉受累或损伤的疾病，特别是由于神经系统(特别是CNS)的原发性受累或损伤所导致的。因此，本文公开的神经系统和肌肉疾病不同于以原发性肌肉损伤或受累为特征的肌肉疾病。

在一些实施方案中，基因治疗用于治疗神经系统疾病，特别是CNS疾病，特别是遗传性神经障碍。CNS疾病包括例如阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆和其他。

遗传性神经障碍中突变基因的实例列于下表中，其可通过使用本发明的药物组合物的基因治疗来靶向：

遗传性神经障碍

可以通过使用本发明的药物组合物进行基因治疗来靶向的遗传性神经障碍中的突变基因的其它实例是导致脊髓性肌肉萎缩(SMAs)&运动神经元疾病；遗传性运动及感觉神经病变；遗传性截瘫和遗传性共济失调的基因；列于下表中。在一些具体实施方案中，所述神经疾病选自下组：脊髓性肌萎缩症(SMN1、ASAH1基因)；肌萎缩侧索硬化(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN和其它)；遗传性截瘫(SPAST(SPG4)、SPG7，和其他SPG基因，如SPG11、SPG20和SPG21；特别是SPAST(SPG4)和SPG7)和腓骨肌萎缩症、4B1型(MTMR2)。在一些优选实施方案中，所述基因选自下组：SMN1、ASAH1、DNM2、MTMR2和SPAST基因。在一些其他优选实施方案中，所述基因选自下组：SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4和OPTN。

在一些实施方案中，基因治疗用于治疗神经肌肉疾病，特别是人类遗传性神经肌肉障碍。遗传性神经肌肉障碍中突变基因的实例列于下表中，其包括可通过使用本发明的药物组合物进行基因治疗来靶向的遗传性肌肉障碍：

肌肉营养不良

先天性肌营养不良症

先天性肌病

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远端肌病

/>

其他肌病

肌强直综合征

离子通道肌肉疾病

恶性高热

代谢性肌病

/>

遗传性心肌病

/>

/>

先天性肌无力综合征

/>

脊髓性肌肉萎缩(SMAs)&运动神经元疾病

/>

遗传性运动及感觉神经病变

/>

/>

遗传性截瘫

/>

其他神经肌肉障碍

/>

遗传性共济失调

/>

上面列出的基因中的任何一个都可以在替代基因治疗中靶向，其中所述目的基因是缺陷或突变基因的功能性版本。

或者，上面列出的基因可以用作基因编辑的靶标。基因编辑用于纠正突变基因的序列或修饰缺陷/异常基因的表达或调节，从而使功能性基因在肌肉细胞中表达。在这种情况下，目的基因选自那些编码治疗性RNA的基因，例如干扰RNA、用于基因组编辑的向导RNA和能够外显子跳跃的反义RNA，其中治疗性RNA靶向前述列表的基因。诸如CRISPR/Cas9的工具可用于此目的。

因此，通过基因编辑或基因替换，在受影响患者的肌肉细胞和/或神经系统(PNS和/或CNS)细胞中，特别是在受影响患者的肌肉细胞和CNS细胞中，提供了该基因的正确版本，这可有助于对该疾病的有效治疗。

在一些实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是导致以上列出的神经肌肉疾病之一的基因，优选选自下组：(i)肌病，例如遗传性心肌病、代谢性肌病、其他肌病、远端肌病、肌营养不良和先天性肌病；(ii)脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病；(iii)肌强直综合征，特别是1型和2型强直性肌营养不良；先天性肌无力综合征；遗传性运动及感觉神经病变；遗传性截瘫和遗传性共济失调，特别是先天性肌病和肌营养不良，以及脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病。

在一些特定的实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是导致以上列出的神经肌肉疾病之一的基因，优选选自下组：杜氏肌营养不良和贝克尔肌营养不良(DMD基因)、肢带型肌营养不良(LGMDs)(CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5基因和其他)、脊髓性肌萎缩症(SMN1、ASAH1基因)和肌萎缩性侧索硬化(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN和其它)、肌小管肌病(MTM1基因)、中央核肌病(MTM1、DNM2、BIN1基因)、杆状体肌病(ACTA1、KLHL40、KLHL41、KBTBD13基因)、硒蛋白N相关肌病(SEPN1基因)、先天性肌无力(ColQ、CHRNE、RAPSN、DOK7、MUSK基因)、庞贝氏症(GAA基因)、糖原累积病III(GSD3)(AGL基因)、强直性肌营养不良1型(DMPK基因)和2型(CNBP/ZNF9基因)；遗传性截瘫(SPAST)和腓骨肌萎缩症，4B1型(MTMR2)。在一些更优选的实施方案中，靶基因选自下组：DMD、CAPN3、DYSF、FKRP、ANO5、MTM1、DNM2、BIN1、ACTA1、KLHL40、KLHL41、KBTBD13、TPM3、TPM2、TNNT1、CFL2、LMOD3、SEPN1、GAA、AGL、SMN1和ASAH1基因。

在一些优选的实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是导致以上列出的影响至少神经系统的一种神经肌肉疾病的基因，优选选自下组：(i)肌病，如肌营养不良，包括先天性肌营养不良；(ii)脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病；(iii)肌强直综合征，特别是1型和2型强直性肌营养不良；(iv)遗传性运动及感觉神经病变；(v)遗传性截瘫和遗传性共济失调；(vi)先天性肌无力综合征，特别是肌营养不良，包括先天性肌营养不良、先天性肌无力综合征和脊髓性肌肉萎缩(SMAs)和运动神经元疾病。

在一些更优选的实施方案中，用于基因治疗的靶基因是导致影响至少神经系统的肌病的基因，例如肌营养不良，包括影响至少神经系统的先天性肌营养不良，选自下组：FKTN、POMT1、POMT2、POMGNT1、POMGNT2、LMNA、ISPD、GMPPB、LARGE、LAMA2、TRIM32和B3GALNT2。

在一些其他更优选的实施方案中，用于基因治疗的靶基因是导致影响至少神经系统的肌病(例如先天性肌无力综合征，例如先天性肌无力)的基因，选自上表列出的导致先天性肌无力综合征的基因。

在一些其他更优选的实施方案中，用于基因治疗(附加基因治疗或基因编辑)的靶基因是导致以上列出的影响至少神经系统的神经肌肉疾病之一的基因，优选选自下组：杜氏肌营养不良症和贝克肌营养不良症(DMD基因)、肢带型肌营养不良症(LGMDs)(DYSF、FKRP)、脊髓性肌萎缩症(SMN1、ASAH1基因)和肌萎缩性侧索硬化症(SOD1、ALS2、SETX、FUS、ANG、TARDBP、FIG4、OPTN和其它)、中央核肌病(DNM2、BIN1基因)、庞贝氏症(GAA基因)、糖原累积病III(GSD3)(AGL基因)、强直性肌营养不良1型(DMPK基因)和2型(CNBP/ZNF9基因)；遗传性截瘫(SPAST(SPG4)、SPG7和其他SPG基因，如SPG11，SPG20和SPG21；特别是SPAST(SPG4)和SPG7)；腓骨肌萎缩症，4B1型(MTMR2)；和先天性肌无力综合征，例如先天性肌无力(CHAT、AGRN基因)。

在一些进一步优选的实施方案中，靶基因选自下组：DMD、DYSF、FKRP、DNM2、BIN1、GAA、AGL、SMN1、和ASAH1基因。

在一些优选的实施方案中，根据本公开的肽修饰的AAVpo1载体用于靶向运动神经元以治疗运动神经元疾病。靶基因可以是上表中列出的与脊髓性肌肉萎缩(SMAs)&运动神经元疾病有关的任何一种基因。运动神经元疾病包括肌萎缩性侧索硬化(ALS)、进行性延髓麻痹(PBP)、假性延髓麻痹、进行性肌萎缩(PMA)、原发性侧索硬化(PLS)、脊髓性肌萎缩症(SMA)和单体性萎缩(MMA)，以及一些类似ALS的罕见变体。

肌营养不良疾病(Dystrophinopathies)是由编码蛋白质肌营养不良蛋白的DMD基因的致病变异体引起的一系列X连锁肌肉疾病。肌营养不良疾病包括杜氏肌营养不良(DMD)、贝克尔肌营养不良(BMD)和DMD相关的扩张型心肌病。

肢带型肌营养不良症(LGMDs)是一组临床上类似于DMD的障碍，但由于常染色体隐性和常染色体显性遗传，在男女两性中都有发生。肢带型肌营养不良症是由编码肌聚糖和其他与肌细胞膜相关的蛋白质的基因突变引起的，这些蛋白质与肌营养不良蛋白相互作用。术语LGMD1指显示显性遗传(常染色体显性)的基因类型，而LGMD2指具有常染色体隐性遗传的类型。已经报道了超过50个基因座的致病变异体(LGMD1A至LGMD1G；LGMD2A至LGMD2W)。钙蛋白酶病(LGMD2A)是由CAPN3基因突变引起的，已描述了超过450种致病变体。对LGMD表型起作用的基因包括：anoctamin 5(ANO5)、血管心外膜物质(BVES)、钙蛋白酶3(CAPN3)、小窝蛋白3(CAV3)、CDP-L-核糖醇焦磷酸化酶A(CRPPA)、dystroglycan 1(DAG1)、结蛋白(DES)、DnaJ热休克蛋白家族(Hsp40)同源物，亚家族B，成员6(DNAJB6)、dysferlin(DYSF)、fukutin相关蛋白(FKRP)、fukutin(FKT)、GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)、异质核核糖核蛋白D样(HNRNPDL)、含LIM锌指结构域2(LIMS2)、lain A：C(LMNA)、肌收缩蛋白(MYOT)、网蛋白(PLEC)、蛋白O-葡萄糖基转移酶1(PLOGLUT1)、蛋白O-连接甘露糖N-乙酰葡糖胺基转移酶1(β1、2-)(POMGNT1)、蛋白O-甘露糖激酶(POMK)、蛋白O-甘露糖基转移酶1(POMT1)、蛋白O-甘露糖基转移酶2(POMT2)、肌聚糖α(SGCA)、肌聚糖β(SGCB)、肌聚糖δ(SGCD)、肌聚糖γ(SGCG)、肌联蛋白-cap(TCAP)、转运蛋白3(TNPO3)、torsin 1A相互作用蛋白(TOR1AIP1)、贩运蛋白颗粒复合物11(TRAPPC11)、含三重基序32(TRIM 32)和肌联蛋白(TTN)。对LGMD表型的主要贡献基因包括CAPN3、DYSF、FKRP和ANO5(Babi Ramesh ReddyNallamilli et al.,Annals of Clinical and Translational Neurology,2018,5,1574-1587.)。

Dysferlin与包括多发性硬化(Hochmeister et al.,J.Neuropathol.Exp.Neurol.,2006Sep；65(9)：855-65)；阿尔茨海默病(Galvin et al.,Acta Neuropathol.,2006Dec；112(6)：665-71)和舞蹈样运动(Takahashi T,et al.,Mov.Disord.,2006,Sep；21(9)：1513-5)在内的神经障碍有关。

脊髓性肌萎缩症是一种由存活运动神经元1(SMN1)基因突变引起的遗传性障碍，其特征是用于运动的肌肉虚弱和消瘦(萎缩)。ASAH1基因突变导致SMA-PME(伴随进行性肌阵挛性癫痫的脊髓性肌萎缩症)。

X-连锁肌小管肌病是一种由肌微管素(MTM1)基因突变引起的遗传性障碍，其影响用于运动的肌肉(骨骼肌)，并且几乎只发生在男性中。这种症状的特征是肌肉无力(肌病)和肌张力降低(张力减退)。

庞贝氏症是一种由酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)基因中的突变引起的遗传性障碍。GAA基因中的突变阻止酸性α-葡萄糖苷酶有效分解糖原，这使得这种糖在溶酶体中积累到有毒水平。这种累积会损害全身的器官和组织，特别是肌肉，导致庞贝氏症的进行性体征和症状。

糖原累积病III(GSD3)是一种常染色体隐性代谢障碍，由编码糖原脱支酶的淀粉-α-1,6-葡糖苷酶，4-α-葡糖基转移酶(AGL)基因中的纯合或复合杂合突变引起，并与具有短外链的异常糖原积累有关。临床上，GSD III患者在婴儿期或幼儿期出现肝肿大、低血糖和生长迟缓。IIIa患者的肌肉无力在儿童时期很轻微，但在成年后会变得更加严重；有些病人会发展成心肌病。

全基因组关联研究将BIN1基因座鉴定为阿尔茨海默病(AD)遗传风险的主要调节因子(Voskobiynyk et al.,eLife doi：10.7554/eLife.57354；July 13,2020)。遗传性痉挛性截瘫(HSPs)是一组罕见的遗传性神经系统疾病，其特征在于广泛的临床和遗传异质性。与第一运动神经元有关的下肢痉挛是所有HSPs的核心症状。导致HSPs的基因包括至少79个SPG基因。SPG7和SPAST的突变是遗传性痉挛性截瘫(HSP)的常见原因(Review inLallemant-Dudek P.et al.Fac.Rev.,2021,Mar 10；10：27)。

用于肌小管肌病的基因治疗的载体的非限制性实例是AAVpo1载体，其包含肽修饰衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5或与包含SEQ ID NO:2至4中任一项的肽的所述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述载体进一步包装与人结蛋白启动子可操作地连接的人MTM1基因，并且进一步与miR208a靶序列可操作地连接。该载体可用于在全身施用(如血管内)注射后在骨骼肌中表达目的基因，但在肝脏中不表达。

用于脊髓性肌萎缩症基因治疗的载体的另一个非限制性实例是AAVpo1载体，其包含肽修饰衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含序列SEQ ID NO:5或与包含SEQ ID NO:2至4中任一项的肽的所述序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，所述载体进一步包装与CAG启动子可操作连接的人SMN1基因，并且优选进一步包含人β珠蛋白多聚腺苷酸化信号。该载体可用于在包括心脏的肌肉和神经系统中表达目的基因，特别是在包括心脏的肌肉和CNS中，但在全身施用(如血管内)注射后在肝脏中不表达。

包含具有降低的肝嗜性的肽修饰AAVpo1载体颗粒的本发明的药物组合物可以施用于患有并发的肝变性如纤维化、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性或中毒性肝炎或诱发肝变性的潜在遗传障碍的患者。

在本发明的上下文中，治疗有效量是指足以逆转、减轻或抑制该术语所适用的障碍或病症的发展，或者逆转、减轻或抑制该术语所适用的障碍或病症的一种或多种症状的发展的剂量。

有效剂量的确定和调整取决于多种因素，例如所用的组合物、施用途径、所考虑的个体的身体特征，例如性别、年龄和体重、同时使用的药物以及医学领域的技术人员将认识到的其他因素。

在本发明的各种实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

“药学上可接受的载体”是指当适当地施用于哺乳动物，特别是人时，不会产生不良反应、过敏反应或其它不良反应的载体。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。

优选地，药物组合物包含赋形剂，其对于可注射的制剂而言是药学上可接受的。其可以特别是等渗的无菌盐溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冻干的组合物，其在根据情况加入无菌水或生理盐水后，可以制成可注射溶液。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或悬浮液。溶液或悬浮液可包含与病毒载体相容且不阻止病毒载体颗粒进入靶细胞的添加剂。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是流动的，以达到易于注射的能力。它在生产和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。合适的溶液的实例是缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乳酸林格氏液。

本发明还提供用于治疗肌肉或神经系统障碍，特别是根据本公开的肌肉或CNS障碍的方法，其包括：向患者施用治疗有效量的如上所述的药物组合物。更优选地，本发明提供用于治疗肌肉和神经系统障碍，特别是根据本公开的肌肉和CNS障碍的方法。

本发明还提供根据本公开的药物组合物在制备用于治疗肌肉或神经系统障碍，特别是根据本公开的肌肉或CNS障碍的药物中的用途；优选肌肉和神经系统障碍，特别是根据本公开的肌肉和CNS障碍。

如本文所用，术语“患者”或“个体”表示哺乳动物。优选地，根据本发明的患者或个体是人。

在本发明的上下文中，本文所用的术语“治疗”是指逆转、减轻或抑制该术语所适用的障碍或病症的发展，或者逆转、减轻或抑制该术语所适用的障碍或病症的一种或多种症状的发展。

本发明的药物组合物通常根据已知的方法，以在患者体内有效诱导治疗效果的剂量和时间段施用。

施用可以是全身施用、局部施用或全身与局部联合施用。全身施用优选肠胃外施用，例如皮下(SC)、肌内(IM)、例如静脉内(IV)或动脉内施用的血管内施用；腹膜内(IP)；皮内注射或其他方式。局部施用优选为脑内、脑室内、脑池内和/或鞘内施用。施用可以例如通过注射或灌注。在一些优选实施方案中，施用肠胃外施用，优选血管内施用，例如静脉内(IV)或动脉内。在一些其他优选的实施方案中，施用是脑内、脑室内、脑池内和/或鞘内施用，单独进行或与非肠道施用，优选血管内施用组合。在一些其他优选的实施方案中，施用是肠胃外施用，优选单独进行血管内施用或与脑内、脑室内、脑池内和/或鞘内施用联合施用

除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。

现在将参考附图，用以下非限制性的实施例来举例说明本发明，其中：

附图说明

图1

图2

图3：

图4

图5：

图6

图7

图8

实施例

材料和方法

在先前描述的肌微管素基因(Mtm1 KO小鼠系)的组成型敲除中(Buj-Bello etal.,PNAS,2002,99,15060-5.doi：10.1073/pnas.212498399；Al-Qusairi,et al.,PNAS,2009,106,18763-8.doi：10.1073/pnas.0900705106)，将猪来源的AAVpo1A1衣壳(编码SEQID NO:5的蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO:13包含SEQ ID NO:4的肽，替代SEQ ID NO:1的AAVpo1衣壳蛋白的位置567-569和570-572的所有残基)与血清型8、9、rh10和po1进行比较(Bello et al,Gene Therapy,2009,16,1320-1328.doi：10.1038/gt.2009.821)。这些载体都是通过使用HEK 293细胞的三重转染法产生的，并且携带在人结蛋白启动子(1kb)和miR208a靶序列控制下的表达人MTM1的表达盒(Raguz et al.,Dev.Biol.,1998,201,26-42；Paulin D&Li Z,Exp.Cell.Res.,2004,Nov 15；301(1)：1-7；Roudault et al.,Circulation,2013,128,1094-104.doi：10.1161/CIRCULATIONAHA.113.001340)。还在C57BL/6小鼠中评估了AAVpo1A1和AAV9衣壳，其中表达与HA标签序列融合的人SMN的表达盒在遍在CAG启动子的控制下(Meyer et al,Molecular Therapy,2015,23.doi：10.1038/mt.2014.210)。

在3周龄的突变小鼠中静脉内施用单剂量的2×10

使用LightCycler480热循环仪(Roche)通过Taqman实时PCR从32ng总DNA中定量每个二倍体基因组的载体基因组数量。用下述引物和探针用titin基因进行标准化：5’-AAAACGAGCAGTGACGTGAGC-3’(正向；SEQ ID NO:6)，5'-TTCAGTCATGCTGCTAGCGC-3’(反向；SEQ ID NO:7)和5’-TGCACGGAAGCGTCTCGTCTCAGTC-3’(探针；SEQ ID NO：8)。用于载体基因组(MTM1)扩增的引物是：5’-TTGGTTGTCCAGTTTGGAGTCTACT-3’(正向；SEQ ID NO:9)，5’-CCGTCACTGCAATGCACAAG-3’(反向；SEQ ID NO:10)和5’-ATATCAAGCTCGTTTTGAC-3’(探针；SEQ ID NO：11)。用于载体基因组(SMN1)扩增的引物是：5’-CAGTGCAGGCTGCCTATCAG-3’(正向；SEQ ID NO:15)，5’-TGTGGGCCAGGGCATTAG-3’(反向；SEQ IDNO:16)，5’-AAGTGGTGGCTGGTGTG-3’(探针；SEQ ID NO：17)。用于载体基因组(SMN1)扩增的其它引物是：5’-GCTGCCTCCATTTCCTTCTG-3’(正向；SEQ ID NO:18)，5’-ACATACTTCCCAAAGCATCAGCAT-3’(反向；SEQ ID NO:19)，5’-CACCACCTCCCATATGTCCAGATTCTCTTG-3’(探针；SEQ ID NO：20)。

从350ng通过使用RevertAid H负逆转录酶试剂盒(Thermo Scientific)进行了逆转录的总RNA中定量MTM1转录物的水平。接下来，使用LightCycler480热循环仪(Roche)通过qPCR扩增cDNA量。用引物和探针用RPLP0基因进行标准化：5’-CTCTGGAGAAACTGCTGCCT-3’(正向；SEQ ID NO:21)，5’-CTGCACATCACTCAGAATTTCAA-3’(反向；SEQ ID NO:22)和5’-AGGACCTCACTGAGATTCGGGATATGC-3’(探针；SEQ ID NO：23)。

通过NuPAGE 4-12％ Bis-Tris凝胶电泳和蛋白质印迹提取蛋白质并进行分析。用抗人肌管蛋白(Abnova)的多克隆抗体探测膜。对GAPDH特异的小鼠单克隆抗体(MerckMillopore)用作内对照。用二抗(驴抗山羊800或山羊抗小鼠680(Invitrogen))和Odyssey红外成像系统(LI-COR Biotechnology Inc.)进行检测。

对于载体衍生的HA-SMN的免疫染色，给C57BL/6小鼠注射单剂量5×10

结果

将表达MTM1的AAV载体(AAVpo1、AAVpo1A1、AAV8、AAV9、AAVrh10)以2×10

根据骨骼肌中的载体基因组定量(图3和4)，AAVpo1A1载体转导大多数骨骼肌的效率与AAV8载体一样高。有趣的是，AAVpo1A1载体在诸如心脏、肝脏、脾、肾、肺和大脑等器官中表现出的低转导水平。

通过RT-qPCR分析在不同肌肉和器官中MTM1转基因的表达(图5和6)。与AAV8相比，AAVpo1A1载体在所有骨骼肌中表现出更高的MTM1转录水平，而与AAV9载体相比，尽管转导水平相似，但达到了与之相当的转基因表达水平。此外，施用AAVpo1A1载体使转基因表达在器官(如肝脏和脾)中去靶向，与AAV8载体递送后观察到的相比，MTM1转录水平低得多。与AAV8组相比，AAVpo1A1处理的小鼠的中枢神经系统区域(如皮质和脊髓)中的转基因表达水平更高，且甚至高于AAV9处理的小鼠的脊髓中的转基因表达水平。

通过免疫印迹分析各种肌肉(腓肠肌、三头肌和膈肌)中的MTM1蛋白表达(图7)。与AAV8和AAVpo1载体相比，AAVpo1A1载体施用得到了突变小鼠骨骼肌中更高的MTM1蛋白水平。

在4周龄的C57BL/6小鼠中以8×10

通过RT-qPCR分析转基因表达，结果显示在AAVpo1A1和AAV9载体转导后，骨骼肌中SMN1转录水平相似。与AAV9相比，AAVpo1A1衍生的SMN1 mRNA在心脏、肝脏、脾和肾中的水平较低。在中枢神经系统中，AAVpo1A1衍生的SMN1转录物存在于所有进行分析的区域(皮质、小脑和脊髓)，脊髓中的水平略高。

为了评估SMN在脊髓中的细胞定位，在注射5×10

综上所述，这证明了AAVpo1A1载体对于以肌肉和/或CNS靶向基因转移的改进的效力和组织特异性，因为其有利地将与AAV9载体相当的骨骼肌、大脑和脊髓中的高转基因表达水平，和在其它器官(如肝脏和脾)中的载体去靶向性转基因表达结合在了一起。