血浆样本稀释液及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及体外诊断技术领域，特别是涉及一种血浆样本稀释液及其制备方法和应用。

背景技术

化学发光免疫分析是进行过敏原检测的手段之一。免疫反应中常见的干扰包括内源性干扰和外源性的干扰，其中内源性干扰物质一般为类风湿因子RF、自身抗体、嗜异性抗体、补体等；外源性干扰主要有脂血、溶血、黄疸、纤维蛋白等。纤维蛋白由纤维蛋白原转化而来，不易溶于水。纤维蛋白干扰通常由于血液凝固不全或血液采集后未按照厂家要求的离心力和离心时间进行离心，使分离出的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在放置或检测时生成纤维蛋白，干扰抗原与抗体反应，导致非特异性结合，造成检测结果的假阳性。

在进行过敏原检测前，通常需要对高浓度的血液样本进行稀释，避免待测物浓度过高使反应空间压缩导致检测结果的假阴性。

传统的样本稀释方法中，如CN113671170A记载的一种样本稀释液和消除新鲜样本检测异常的免疫分析方法，主要在稀释液中加入硫酸葡聚糖和硫辛酸，两者通过诱导纤维蛋白溶解，增强纤溶酶原激活物的活性，从而提高纤溶酶的作用，降低纤维蛋白干扰；CN110579614A记载的消除纤维蛋白原干扰的化学发光试剂盒配方；上述两种方法均是对血清样本进行稀释，不适用于过敏原血浆样本的稀释。此外，CN108896380A记载了一种化学发光仪在机用血清稀释液，但组成成分复杂多样，工艺繁琐。

发明内容

基于此，本申请提供了一种配方简单的用于过敏原检测的血浆样本稀释液。

根据本申请的一个方面，提供了一种血浆样本稀释液，其特征在于，所述血浆样本稀释液包括分散剂、缓冲液和抗凝剂；

所述分散剂选自PEG6000和吐温20中的一种或多种；

所述缓冲液选自MOPS缓冲液、HEPES缓冲液和PBS缓冲液中的一种或多种；

所述抗凝剂选自肝素钠、肝素和肝素锂中的一种或多种；

以在所述血浆样本稀释液中的用量计，所述分散剂的体积分数为0.01％～15％；

所述抗凝剂的浓度为1U/mL～50U/mL。

在其中一些实施例中，所述血浆样本稀释液还包括抗干扰剂和阻断剂中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述抗干扰剂为MAK33。

在其中一些实施例中，所述阻断剂为鼠抗人IgG。

在其中一些实施例中，所述抗干扰剂的体积分数为0.01％～5％。

在其中一些实施例中，所述阻断剂的体积分数为0.01％～5％。

根据本申请的另一个方面，还提供了一种制备上述的血浆样本稀释液的方法，包括如下步骤：

将所述分散剂、所述抗凝剂及所述缓冲液混合均匀，制备所述稀释液。

在其中一些实施例中，所述方法还包括如下步骤：

在所述稀释液中加入抗干扰剂和阻断剂中的一种或多种。

根据本申请的另一个方面，还提供了一种过敏原检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的血浆样本稀释液。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括第二抗体和发光试剂中的一种或多种。

根据本申请的另一个方面，还提供了一种化学发光免疫分析的方法，包括采用上述的稀释液稀释待测血浆样本后进行化学发光免疫分析的步骤。

与传统技术相比，本申请具有如下有益效果：

本申请通过成分种类及用量的调节，提供了一种配方简单的血浆样本稀释液，该血浆样本稀释液无需较多成分的辅助，就能用于过敏原的检测，且检测的过程中，能够消除样本中纤维蛋白的干扰，保持待测血浆样本维持pH值和渗透压，使化学发光检测时具有较好的灵敏度和信号值。本申请的稀释液成分简单，能够降低生产成本和节约资源。

进一步地，本申请在稀释液中加入抗干扰剂和/或阻断剂，能够有效消除样本中的内源性干扰，使过敏原检测时准确性较好。此外，本申请的稀释液制备方法简单、原材料安全无毒害作用，具备环境友好性。

具体实施方式

为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

术语

除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本申请中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。

本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。

本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本申请的技术方案、解决本申请的技术问题、实现本申请预期的技术效果为准。

本申请中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本申请保护范围的限制。

本申请中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本申请中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1-10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。

本申请中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本申请中“IgG”指免疫球蛋白G，是一种由血浆B细胞产生和释放的抗体。

本申请的一些实施方式提供了一种血浆样本稀释液，包括分散剂、缓冲液和抗凝剂；分散剂选自PEG6000和吐温20中的一种或多种；缓冲液选自MOPS缓冲液、HEPES缓冲液和PBS缓冲液中的一种或多种；抗凝剂选自肝素钠、肝素和肝素锂中的一种或多种；以在血浆样本稀释液中的用量计，分散剂的体积分数为0.01％～15％；抗凝剂的浓度为1U/mL～50U/mL。

优选地，抗凝剂为肝素钠；分散剂为PEG6000；缓冲液为MOPS缓冲液。

进一步地，分散剂的体积分数为0.05％～10％，抗凝剂的浓度为2.5U/mL～30U/mL；更进一步地，分散剂的体积分数为1％～5％，抗凝剂的浓度为10U/mL～15U/mL。

肝素因其首先从肝脏中发现而得名，是一种由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，平均分子量为15KDa，呈强酸性；它也存在于肺、血管壁、肠黏膜等组织中，是动物体内一种天然抗凝血物质。肝素天然存在于肥大细胞，主要从牛肺或猪小肠黏膜提取获得。肝素作为一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内和体外都有抗凝血作用。

肝素钠为抗凝血药，是一种黏多糖类物质，由猪、牛、羊的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖的钠盐，在人体内由肥大细胞分泌而自然存在于血液中。肝素钠具有防止血小板集聚和破坏，抑制纤维蛋白原转变成纤维蛋白单体，抑制凝血因子的形成和对抗已形成的凝血因子，阻止凝血酶原转变成凝血酶和对抗凝血酶等作用。在过敏原血浆样本中添加肝素钠可有效防止纤维蛋白原转化成纤维蛋白，降低纤维蛋白的干扰，防止检测结果假阳性。

小剂量的肝素锂可以使凝血酶失活，从而抑制纤维蛋白原转化成为纤维蛋白。

PEG6000是一种高分子聚合物，吐温20是一种表面活性剂，两者都具有优良的分散性，保证稀释液能够迅速作用于样本。MOPS缓冲液是一种两性离子生物缓冲液，能较长时间控制恒定的pH范围。

在其中一些实施方式中，上述血浆样本稀释液还包括抗干扰剂和阻断剂中的一种或多种。

在其中一些实施方式中，抗干扰剂为MAK33。

可以理解的是，MAK33作为抗干扰剂可以有效地消除样本中嗜异性抗体的干扰，从而降低免疫检测中的非特异性反应。

在其中一些实施方式中，阻断剂为鼠抗人IgG。

可以理解的是，鼠抗人IgG作为阻断剂，可以结合样本中的IgG，使待测样本中IgE位点充分与目的抗原结合，从而提高检测的灵敏度。

在其中一些实施方式中，抗干扰剂的体积分数为0.01％～5％。

在其中一些实施方式中，阻断剂的体积分数为0.01％～5％。

进一步地，抗干扰剂的体积分数为0.01％～1％；阻断剂的体积分数为0.1％～5％。更进一步地，抗干扰剂的体积分数为0.1％～0.5％；阻断剂的体积分数为0.1％～1％。限制抗干扰剂和阻断剂的体积分数在上述范围内，即可有效地消除样本中的干扰因素。

在其中一些具体示例中，上述稀释液由抗凝剂、分散剂和缓冲液组成。

在其中一些具体示例中，上述稀释液由抗干扰剂、阻断剂、抗凝剂、分散剂和缓冲液组成。

本申请的稀释液至少具有如下优点：本申请的血浆样本稀释液仅由抗凝剂、分散剂和缓冲液组成时，即可有效地消除待测样本中的干扰因素，从而提高化学发光检测的灵敏度、降低化学发光检测的本底信号值，还能够使待测样本保持稳定的pH值和渗透压。

上述稀释液用于稀释血浆样本，使其保持一定的pH值、渗透压，可取代人血清稀释带来的伦理及本底方面的影响，极大的降低了研发成本。

本申请的另一些实施方式还提供了一种制备上述血浆样本稀释液的方法，包括如下步骤：

在其中一些实施方式中，制备上述血浆样本稀释液的方法还包括如下步骤：

在稀释液中加入抗干扰剂和阻断剂中的一种或多种。

本申请的血浆样本稀释液制备方法至少具有如下优点：工艺简单、快速；组分安全、无毒害作用。

本申请的另一些实施方式还提供了一种包括上述血浆样本稀释液的过敏原检测试剂盒。

在其中一些实施方式中，上述试剂盒还包括第二抗体和发光试剂中的一种或多种。

本申请的另一些实施方式还提供了一种化学发光免疫分析的方法，包括采用上述的血浆样本稀释液稀释待测血浆样本，然后进行化学发光免疫分析的步骤。

下面将结合具体实施例和对比例对本申请作进一步说明，但不应将其理解为对本申请保护范围的限制。

按照如下方法制备实施例1～8的血浆样本稀释液：

(1)配制125U/mL的肝素钠母液：称取100mg肝素钠(相当于12500U)溶解于100mL生理盐水中，2℃～8℃保存。

(2)配制125U/mL肝素母液：称取100mg肝素(相当于12500U)溶解于100mL生理盐水中，2℃～8℃保存。

(3)配制150IU/mL肝素锂母液：称取100mg肝素锂(相当于15000IU)溶解于100mL生理盐水中，2℃～8℃保存。

(4)0.01mol/L HEPES缓冲液配制：称取2.38g HEPES粉末，溶解在800mL蒸馏水中，磁力搅拌器上搅拌10分钟使其充分溶解，使用氢氧化钠调节pH至7.3～7.4，再用蒸馏水定容至1000mL，搅拌均匀后备用，于4℃保存。

(5)0.01mol/L PBS缓冲液配制：称取8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na

(6)0.01mol/L MOPS缓冲液配制：称取8.37g MOPS粉末、1.36g醋酸钠、0.7g EDTA，溶解于800mL蒸馏水中，磁力搅拌器上搅拌10分钟使其充分溶解，再用蒸馏水定容至1000mL，搅拌均匀后备用，4℃保存备用。

(7)按照如表1所示的配方将各个成分溶解在缓冲液中，磁力搅拌器搅拌10分钟，使其充分溶解，再用缓冲液定容至100mL，搅拌均匀，制备血浆样本稀释液。

表1实施例1～8的稀释液制备成分

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对比例1

按体积百分数计，添加0.12％ EDTA(乙二胺四乙酸)、0.05％ PEG4000、余量0.01mol/L MOPS缓冲液，混合均匀、充分溶解，制备血浆样本稀释液。

性能测试1

使用实施例1～8和对比例1制备的稀释液，稀释待测过敏原血浆样本，配合江苏三联生物工程股份有限公司自制的蛋白芯片阅读仪(SLXP-001B)测定过敏原样本的信号值，并计算实施例与对比例的信号值的相对偏差。

(1)以过敏原中的户尘螨(D1)指标为例，收集10例D1样本。

(2)准备工作：在检测仪器内放入江苏三联生物工程股份有限公司自制的过敏原芯片，将检测用过敏原第二抗体、发光液、稀释液等试剂放入对应的位置；启动仪器自检。

(3)将待检的样本放入试剂架，仪器进行自动扫描，扫描结束，自动检测仪开启检测过程，具体检测加样流程为：

吸取待测的过敏原血液样本于反应杯中→清洗吸样针→吸取稀释液加入反应杯中，混匀→爪夹夹取过敏原检测芯片放入到反应杯中，反应40min→清洗芯片→将清洗吹干后的芯片放入已添加过敏原第二抗体的反应杯中，反应40min→反应结束，加入发光液进行发光和信号读取→得到检测结果。信号值的检测结果如表2所示。

表2过敏原D1的信号值检测结果

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与对比例1相比，本申请实施例1～3的血浆样本稀释液，仅由抗凝剂、分散剂和缓冲液组成时，即可有效地增强过敏原检测的信号值；由实施例4～8可知，本申请的血浆样本稀释液中再添加抗干扰剂和阻断剂，能够进一步提升过敏原检测的信号值，提高检测的灵敏度。

性能测试2

使用实施例1～8和对比例1制备的稀释液，配合江苏三联生物工程股份有限公司自制的蛋白芯片阅读仪(SLXP-001B)测定过敏原样本中D1的浓度。

(1)以过敏原D1指标为例，收集10例D1指标假阳性样本。

(2)分别用实施例和对比例的稀释液对同一样本进行稀释并检测，并比较各个样本的浓度；蛋白芯片阅读仪的工作流程与实施例2相同。过敏原D1的浓度检测结果如表3所示。

表3过敏原D1浓度检测结果(单位：IU/mL)

上述结果表明，本申请实施例1～3的血浆样本稀释液，仅由抗凝剂、分散剂和缓冲液组成时，即可有效地降低过敏原检测样本中的干扰；由实施例4～8可知，再添加抗干扰剂和阻断剂，能够进一步地消除样本中的干扰因素，提高检测的准确性。

性能测试3

使用实施例1～8和对比例1制备的稀释液，配合江苏三联生物工程股份有限公司自制的蛋白芯片阅读仪(SLXP-001B)测定过敏原样本的信号值。

(1)以过敏原D1指标为例，收集D1阴性样本。

(2)D1样本于室温放置0h、2h、4h、6h、8h后，分别用实施例和对比例所制得的稀释液对D1样本进行稀释并检测，比较实施例和对比例的差异。其它配套试剂均为江苏三联生物股份有限公司的过敏原产品中的配套试剂。蛋白芯片阅读仪的工作流程与实施例2相同。

本底信号值和D1信号值的检测结果如表4所示。

表4本底信号值和过敏原D1信号值的检测结果

由实施例1～8与对比例1可知，随着样本放置时间延长，对比例1处理后的样本本底信号值和阴性信号值都逐渐升高，实施例1～8处理后的样本信号值无明显变化。表明本申请的稀释液可以有效抑制血浆样本凝固，降低纤维蛋白原的干扰。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。