β-1,4-内切木聚糖酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种β-1,4-内切木聚糖酶突变体及其应用。

背景技术

β-1,4-D-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)是木聚糖酶酶系中最重要的成分，它以内切的方式将木聚糖的β-1,4-D-糖苷键断裂，形成低聚木糖，在食品、医药、饲料和新能源等方面应用广泛。但由于其热稳定性较差，在高温条件下不能保持较高的酶活力，从而限制了使用。其中，最具代表性的11家族木聚糖酶表现出较广泛的pH耐受性和底物特异性，但热稳定性较差是亟需解决的问题。

木聚糖酶的改造主要在N端，根据序列比对，将其替换成嗜热型木聚糖酶的N端，进而提高其热稳定性。柏文琴等人在N端引入芳香族氨基酸，使最适反应温度提高了5℃，65℃的半衰期从22min增长到106min。何瑶等人将Aspergillus oryzae来源的木聚糖酶AoXyn11A替换成Thermobifida fusca的N端，结果显示其最适温度提高了15℃，半衰期提高了41.5倍。虽然N端是影响11家族木聚糖酶热稳定性的关键区域，但通过N端改造可能会降低酶的表达水平和催化活性，并不合适于所有的木聚糖酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的β-1,4-内切木聚糖酶突变体及其应用。

本发明构思如下：由于木聚糖酶C端与N端在结构上靠近，相互作用力较多。通过C端的改造不仅可以从结构上影响N端，进而提高热稳定性，而且对酶的表达水平和催化活性的影响较小。通过C端替换，从而使11家族的黑曲霉木聚糖酶的热稳定性提高。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种β-1,4-内切木聚糖酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

第二方面，本发明提供编码所述β-1,4-内切木聚糖酶突变体的核酸分子。

第三方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。

第四方面，本发明提供所述β-1,4-内切木聚糖酶突变体在木聚糖降解中的应用。

第五方面，本发明提供所述β-1,4-内切木聚糖酶突变体在制备木聚糖降解剂中的应用。

第六方面，本发明提供一种木聚糖降解剂，其有效成分为所述β-1,4-内切木聚糖酶突变体。

第七方面，本发明提供一种木聚糖高温降解的方法，以木聚糖为底物，加入所述β-1,4-内切木聚糖酶突变体，在40-60℃下反应。

优选地，反应温度为50-58℃，更优选55-58℃。

本发明中，所述木聚糖的分子量为20-21kDa。

第八方面，本发明提供一种通过C端氨基酸替换提高木聚糖酶热稳定性的方法，包括：将嗜热菌来源的木聚糖酶的C端氨基酸残基替换xynA(SEQ ID NO:2)的C端，以提高木聚糖酶的热稳定性。

优选地，所述嗜热菌为Nesterenkonia xinjiangensis。

本发明首次揭示了C端对11家族的木聚糖酶热稳定性具有重要意义，通过氨基酸序列比对和科学设计，将两种嗜热菌(Thermopolyspora flexuosa和Nesterenkoniaxinjiangensis)来源的木聚糖酶C端替换xynA的C端，显著提高了木聚糖酶的热稳定性。结果表明不仅N端对木聚糖酶的热稳定性有重要影响，C端的改造也具有重要借鉴意义。本发明还为11家族的木聚糖酶的热稳定机制的阐明和酶的蛋白工程改造奠定理论基础。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中重组质粒pMD19-xynA/N.xinjiangensis-C的结构示意图。

图2为本发明较佳实施例中xynA(WT)和突变体(N.xinjiangensis-C)的热稳定性图。

图3为本发明较佳实施例中将xynA与同源性较高的7种木聚糖酶的氨基酸序列比对结果。

具体实施方式

本发明提供一种来源于黑曲霉(Aspergillus niger AG11)的β-1,4-内切木聚糖酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

通过与嗜热型木聚糖酶C端序列进行比对，并通过大片段引物PCR的基因工程手段构建突变体以及对突变体的酶学性质进行测定。通过酶学性质测定，xynA/N.xinjiangensis-C突变体的最适反应温度从初始的50℃提升至58℃。半衰期t

本发明采用如下技术方案：

1、C端序列的比对：将xynA(SEQ ID NO:2)与同源性较高的7种木聚糖酶氨基酸序列(图3)进行比对，发现与五种木聚糖酶的C端是相同的，而另外两种存在较大差异。分别为嗜热菌Thermopolyspora flexuosa和Nesterenkonia xinjiangensis。

2、载体的构建：以黑曲霉(A.niger AG11)的基因组为模板，PCR扩增xynA表达框。同时扩增载体pMD19，产物回收与xynA进行一步克隆连接，得到载体pMD19-xynA。经测序正确后分别对pMD19-xynA和潮霉素(hyg)表达框进行扩增并连接得到载体pMD19-xynA/hyg，最后PCR扩增获得插入片段。设计突变引物构建突变体xynA/T.flexuosa-C和xynA/N.xinjiangensis-C，以相同的引物扩增得到各突变体的插入片段。引物信息见表1。

3、利用菌株A.niger/pMD19-xynA/hyg表达xynA作为对照，同时表达各突变体蛋白。经蛋白纯化和酶学性质测定，xynA/T.flexuosa-C突变体热稳定性不变，xynA/N.xinjiangensis-C的最适反应温度从原始的50℃提升至58℃。半衰期t

其中，t

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1β-1,4-内切木聚糖酶突变体的制备

本实施例对来源于黑曲霉11家族的木聚糖酶xynA与同源性大于50％以上的耐热型木聚糖酶进行序列比对，发现xynA的C端同源性较低，通过大片段引物PCR扩增将xynA的C端替换。经酶学性质测定，其热稳定性有较明显的提升，比酶活不变。xynA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

xynA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，xynA的C端替换后的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。

(1)木聚糖酶酶活测定

采用3,5-二硝基水杨酸法测定木聚糖酶酶活。将500μL稀释至适当浓度的酶液与500μL桦木木聚糖底物(pH 4.0，10mg/mL，底物分子量为150.13Da)混合，在50℃条件下反应10min后用3,5-二硝基水杨酸试剂终止反应。反应的样品于沸水内显色5min后立即用水冷却，并在545nm条件下测定吸光度。酶活力单位(U/mL)定义为每分钟水解木聚糖所产生的1μmol还原糖所需的酶量。

(2)最适反应温度的测定

最适反应温度是纯化后的酶液经NaH

(3)温度稳定性的测定

温度稳定性是将上述稀释后酶液分别在40-60℃条件下孵育0-90min后置于冰上保存，测定各条件下的酶活。以孵育0min时的酶活为100％，计算各孵育时间下的相对酶活。在上述温度稳定性测定的基础上拟合不同温度下的回归方程，计算各温度下木聚糖酶的半衰期。

木聚糖酶基因的突变、表达和酶学性质测定如下：

1、C端序列的比对：将xynA与同源性较高的7种木聚糖酶氨基酸序列(表1)进行比对，发现与五种木聚糖酶的C端是相同的，而另外两种存在较大差异。分别为嗜热菌Thermopolyspora flexuosa和Nesterenkonia xinjiangensis。

2、载体的构建和突变体：以黑曲霉(A.niger AG11)的基因组为模板，通过设计上、下游引物F1和R1(表1)，PCR扩增xynA表达框。同时通过引物F2、R2扩增载体pMD19，产物回收与xynA进行一步克隆连接，得到载体pMD19-xynA。PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸50s，循环34次；最后72℃延伸5min。经测序正确后利用F3、R3和F4、R4分别对pMD19-xynA和潮霉素(hyg)表达框进行扩增并连接得到载体pMD19-xynA/hyg，最后用F1和R4扩增获得插入片段。设计突变引物(表1)构建突变体xynA/T.flexuosa-C和xynA/N.xinjiangensis-C，以相同的引物扩增得到各突变体的插入片段。重组质粒pMD19-xynA/N.xinjiangensis-C的结构示意图见图1。突变体xynA/T.flexuosa-C的氨基酸序列见SEQ ID NO:4。

3、XynA和突变体的表达、纯化和酶学性质测定：利用菌株A.niger/pMD19-xynA/hyg表达xynA作为对照，同时表达各突变体蛋白。发酵一定时间收集菌体并离心，经滤膜过滤后用HisTrap

表1各质粒构建引物表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国石油化工股份有限公司 中国石油化工股份有限公司大连石油化工研究院江南大学

<120> β-1,4-内切木聚糖酶突变体及其应用

<130> KHP211119260.3

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 564

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

tcgaccccga gctcgaccgg cgagaacaac ggcttctact actccttctg gaccgacggc 60

ggtggcgacg tgacctacac caacggagat gctggtgcct acactgttga gtggtccaac 120

gtgggcaact ttgtcggtgg aaagggctgg aaccccggaa gtgcgcagga catcacctac 180

agcggcacct tcacccctag cggcaacggc tatctctccg tctatggctg gaccactgac 240

cccctgatcg agtactacat cgtcgagtcc tacggcgact acaaccccgg cagtggaggc 300

acatacaagg gcaccgtcac ctcggacgga tccgtttacg atatctacac ggctacccgt 360

accaatgctg cttccattca gggaaccgct accttcactc agtactggtc cgtccgccag 420

aacaagagag ttggcggaac tgttaccacc tccaaccact tcaatgcttg ggctaagctg 480

ggaatgaacc tgggtactca caactaccag atcgtggcta ccgagggtta ccagagcagt 540

ggatcttcgt ccatcactgt tcag 564

<210> 2

<211> 188

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

Ser Thr Pro Ser Ser Thr Gly Glu Asn Asn Gly Phe Tyr Tyr Ser Phe

1 5 1015

Trp Thr Asp Gly Gly Gly Asp Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asp Ala Gly

202530

Ala Tyr Thr Val Glu Trp Ser Asn Val Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys

354045

Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala Gln Asp Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Phe

505560

Thr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr Thr Asp

65707580

Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro

859095

Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Ser Val

100 105 110

Tyr Asp Ile Tyr Thr Ala Thr Arg Thr Asn Ala Ala Ser Ile Gln Gly

115 120 125

Thr Ala Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asn Lys Arg Val

130 135 140

Gly Gly Thr Val Thr Thr Ser Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Lys Leu

145 150 155 160

Gly Met Asn Leu Gly Thr His Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly

165 170 175

Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Thr Val Gln

180 185

<210> 3

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Thr Pro Ser Ser Thr Gly Glu Asn Asn Gly Phe Tyr Tyr Ser Phe

1 5 1015

Trp Thr Asp Gly Gly Gly Asp Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asp Ala Gly

202530

Ala Tyr Thr Val Glu Trp Ser Asn Val Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys

354045

Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala Gln Asp Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Phe

505560

Thr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr Thr Asp

65707580

Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro

859095

Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Ser Val

100 105 110

Tyr Asp Ile Tyr Thr Ala Thr Arg Thr Asn Ala Ala Ser Ile Gln Gly

115 120 125

Thr Ala Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asn Lys Arg Val

130 135 140

Gly Gly Thr Val Thr Thr Ser Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Lys Leu

145 150 155 160

Gly Met Asn Leu Gly Thr His Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly

165 170 175

Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Thr Val His Thr Ala Pro

180 185 190

<210> 4

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Thr Pro Ser Ser Thr Gly Glu Asn Asn Gly Phe Tyr Tyr Ser Phe

1 5 1015

Trp Thr Asp Gly Gly Gly Asp Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asp Ala Gly

202530

Ala Tyr Thr Val Glu Trp Ser Asn Val Gly Asn Phe Val Gly Gly Lys

354045

Gly Trp Asn Pro Gly Ser Ala Gln Asp Ile Thr Tyr Ser Gly Thr Phe

505560

Thr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Thr Thr Asp

65707580

Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro

859095

Gly Ser Gly Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Asp Gly Ser Val

100 105 110

Tyr Asp Ile Tyr Thr Ala Thr Arg Thr Asn Ala Ala Ser Ile Gln Gly

115 120 125

Thr Ala Thr Phe Thr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Asn Lys Arg Val

130 135 140

Gly Gly Thr Val Thr Thr Ser Asn His Phe Asn Ala Trp Ala Lys Leu

145 150 155 160

Gly Met Asn Leu Gly Thr His Asn Tyr Gln Ile Val Ala Thr Glu Gly

165 170 175

Tyr Gln