一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术技术领域，具体为一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用。

背景技术

β-葡聚糖是一类非淀粉性多糖，广泛存在于植物和微生物细胞壁中，是葡萄糖以β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物。其次β-葡聚糖是一类重要的抗营养因子，不能被单胃动物自身分泌的消化酶水解。β-葡聚糖分子量比较大，分为水溶性和水不溶性两种，水溶性β-葡聚糖遇水溶胀形成高黏度溶液，是胃肠道食糜黏度增加，阻碍营养物质的释放和扩散，降低消化酶活性，降低营养物质的消化和吸收。

β-葡聚糖酶是一类降解谷物中β-葡聚糖的水解酶的总称，β-葡聚糖酶的应用广泛，能够用于啤酒行业，主要作用是使啤酒更澄清；在饲料行业也拥有着重要的作用，在饲料中添加β-葡聚糖酶可以降解β-葡聚糖，消除其抗营养因子作用。另外该酶可以降低消化道内容物黏度、破坏细胞壁结构、改善肠道菌群结构、提高内源酶活性、促进营养物质的吸收；在植物中作为抗菌诱导剂抵御真菌病害等，因此在食品、饲料、农业、生物技术等领域具有广泛的应用前景。而现在国内外主要利用微生物发酵生产β-葡聚糖酶，由于筛选得到的产β-葡聚糖酶菌株酶活较低，故有不少研究者在致力于筛选和培养新的产酶菌株，期望筛选出产酶活高的β-葡聚糖酶菌株，本发明即提供了一株可高产β-葡聚糖酶的黑曲霉菌株，以满足工业生产需求，降低生产成本。

发明内容

鉴于现有技术中的上述缺陷或不足，本申请旨在提供一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株，该菌株分类学命名为Aspergillussp.HL-4。

一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株的选育方法，该选育方法包括以下步骤：

步骤一、将实验室保藏菌株黑曲霉从-80℃拿出活化培养在PDA固体培养基上，培养3d，用适量的无菌生理盐水洗下活化后新鲜的黑曲霉菌株，置于已灭菌的含有玻璃珠的锥形瓶中充分震荡，使孢子充分打散，取无菌的六层纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬液，利用血球计数板在显微镜上观察，计算孢子个数，用无菌生理盐水稀释，致使最终的孢子悬液浓度为1.0×10

步骤二、将步骤一得到的孢子悬液放在15W紫外灯下距离25cm处搅拌照射1-10min，于红灯下，分别取1ml置于装有无菌生理盐水的试管中，进行梯度稀释，吸取100μL涂布于初筛选培养基平板上，在28℃培养箱中避光培养48h；

步骤三、将步骤二中初筛培养基上长出的菌株，用平板划线法分离纯化菌株；采用点接法将纯种菌株接种在初筛培养基平板上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用无菌生理盐水溶液进行洗脱，观察菌株是否有透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(Dc)和透明圈直径(Dp)，计算Dp/Dc比值，选择透明圈比值最大的几株，转接到PDA固体培养基中，28℃培养3d；用无菌生理盐水洗下孢子，倾入装有玻璃珠的无菌锥形瓶中充分振荡，使孢子充分打散，用无菌的六层纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬液，利用血球计数板在显微镜上观察，计数，使孢子悬液浓度为1.0×10

步骤四、对诱变复筛得到的黑曲霉诱变菌株进行固态发酵工艺优化。

优选的，所述PDA固体培养基成分为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，115℃灭菌30min。

优选的，步骤二所述的初筛固体培养基成分为：酵母膏2g/L，(NH

优选的，步骤三所述的固态发酵培养基成分为：麸皮18.97g，豆粕粉2.71g，(NH

优选的，步骤四所述的固态发酵培养基为：固态发酵培养基成分：以麸皮、花生壳粉、大麦粉、复合碳源(麸皮+花生壳粉+大麦粉、麸皮+大麦粉)等为供试碳源，以豆粕粉、酵母粉、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵作为氮源，以K+、Na+、Mg2+为金属离子，其中以麸皮和豆粕粉为固体基质，碳源添加量为14.97g、16.97g、18.97g、20.97g、22.97g。

优选的，步骤四所述的固态发酵条件如下：培养温度为25-33℃，培养PH为6.0-8.5，接种方式菌球和孢子，接种量2％-10％，装料量25-60g，发酵时长70h。

优选的，高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株的选育方法得到的β-葡聚糖酶可在食品、饲料行业中应用。

有益效果：该高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株及其选育方法和应用，本发明采用紫外诱变技术和刚果红染色法筛选出产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株，其黑曲霉诱变菌株可广泛应用β-葡聚糖酶的生产，具有广泛的应用前景。而采用紫外诱变技术可有效的提高突变率，降低成本。本发明采用固态发酵培养菌株，产生的β-葡聚糖酶酶系丰富，酶活性高，其操作过程简便、能耗低，微生物易生长，不易产生大面积的污染等优点。

附图说明

通过阅读参照以下附图所作的对非限制性实施例所作的详细描述，本申请的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为紫外诱变致死率曲线；在图1中，横坐标为紫外照射时间，纵坐标为致死率；

图2经过刚果红染色产生透明圈的所筛菌株HL-4示意图；

图3为光学显微镜观察的CM96、HL-4示意图；

图4为扫描电镜观察的CM96、HL-4示意图；

图5为诱变菌株与原始菌株酶活力对比图，在图5中，横坐标为诱变菌株，纵坐标为β-葡聚糖酶活力；

图6为不同固体基质对黑曲霉诱变菌株产β-葡聚糖酶的影响曲线，在图6中，横坐标为碳源种类，纵坐标为β-葡聚糖酶活力；

图7为碳源添加量对黑曲霉诱变菌株产β-葡聚糖酶的影响曲线，在图7中，横坐标为碳源添加量，纵坐标为β-葡聚糖酶活力。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。

本发明实施例中的附图：图中不同株类的剖面线不是按照国标进行标注的，也不对元件的材料进行要求，是对图中元件的剖视图进行区分。

请参阅图1-7，一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株该菌株分类学命名为Aspergillussp.HL-4；

一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株的选育方法，该选育方法包括以下步骤：

步骤一、将实验室保藏菌株黑曲霉从-80℃拿出活化培养在PDA固体培养基上，培养3d，用适量的无菌生理盐水洗下活化后新鲜的黑曲霉菌株，置于已灭菌的含有玻璃珠的锥形瓶中充分震荡，使孢子充分打散，取无菌的六层纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬液，利用血球计数板在显微镜上观察，计算孢子个数，用无菌生理盐水稀释，致使最终的孢子悬液浓度为1.0×10

步骤二、将步骤一得到的孢子悬液放在15W紫外灯下距离25cm处搅拌照射1-10min，于红灯下，分别取1ml置于装有无菌生理盐水的试管中，进行梯度稀释，吸取100μL涂布于初筛选培养基平板上，在28℃培养箱中避光培养48h；

步骤三、将步骤二中初筛培养基上长出的菌株，用平板划线法分离纯化菌株；采用点接法将纯种菌株接种在初筛培养基平板上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用无菌生理盐水溶液进行洗脱，观察菌株是否有透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(Dc)和透明圈直径(Dp)，计算Dp/Dc比值，选择透明圈比值最大的几株，转接到PDA固体培养基中，28℃培养3d；用无菌生理盐水洗下孢子，倾入装有玻璃珠的无菌锥形瓶中充分振荡，使孢子充分打散，用无菌的六层纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬液，利用血球计数板在显微镜上观察，计数，使孢子悬液浓度为1.0×10

步骤四、对诱变复筛得到的黑曲霉诱变菌株进行固态发酵工艺优化。

其中，PDA固体培养基成分为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，115℃灭菌30min。

其中，步骤二所述的初筛固体培养基成分为：酵母膏2g/L，(NH

其中，步骤三所述的固态发酵培养基成分为：麸皮18.97g，豆粕粉2.71g，(NH

优选的，步骤四所述的固态发酵培养基为：固态发酵培养基成分：以麸皮、花生壳粉、大麦粉、复合碳源(麸皮+花生壳粉+大麦粉、麸皮+大麦粉)等为供试碳源，以豆粕粉、酵母粉、硫酸铵、硝酸钠、硝酸铵作为氮源，以K+、Na+、Mg2+为金属离子，其中以麸皮和豆粕粉为固体基质，碳源添加量为14.97g、16.97g、18.97g、20.97g、22.97g。

其中，步骤四所述的固态发酵条件如下：培养温度为25-33℃，培养PH为6.0-8.5，接种方式菌球和孢子，接种量2％-10％，装料量25-60g，发酵时长70h。

其中，高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株的选育方法得到的β-葡聚糖酶可在食品、饲料行业中应用。

实施例1

高产β-葡聚糖酶的黑曲霉诱变菌株的选育

(1)将实验室保藏菌株黑曲霉从-80℃拿出活化培养在PDA固体培养基上，培养3d，用适量的无菌生理盐水洗下活化后新鲜的黑曲霉菌株，置于已灭菌的含有玻璃珠的锥形瓶中充分震荡，使孢子充分打散。取无菌的六层纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬液。利用血球计数板在显微镜上观察，计算孢子个数，用无菌的生理盐水稀释，致使最终的孢子悬液浓度为1.0×10

其中，PDA固体培养基成分：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，115℃灭菌30min；

(2)将步骤(1)得到的孢子悬液放在15W紫外灯下距离25cm处搅拌照射1-10min,于红灯下，分别取1ml置于装有无菌生理盐水的试管中，进行梯度稀释，吸取100μL涂布于初筛培养基平板上，在28℃培养箱中避光培养48h，计算致死率并绘制致死率曲线如图1所示。由图1可以看出，当紫外灯照射7min时，致死率达到80.7％，据报道当致死率达到80％左右时，正突变率较高。

即初筛培养基成分：酵母膏2g/L，β-葡聚糖10g/L，(NH

(3)将步骤(2)中初筛培养基上致死率达到80％的菌株，用平板划线法分离纯化菌株；采用点接法将纯种菌株接种在初筛培养基平板上，待菌株长出后，用刚果红溶液对菌株进行染色，再用无菌生理盐水溶液进行洗脱，观察菌株是否有透明圈，测量产生透明圈的菌株直径(Dc)和透明圈直径(Dp),计算Dp/Dc比值，选择透明圈比值最大的几株进行复筛，转接到PDA固体培养基中，28℃培养3d；用无菌生理盐水洗下孢子，倾入装有玻璃珠的无菌锥形瓶中充分振荡，使孢子充分打散，用无菌的六层纱布过滤除去菌丝，得到孢子悬液。利用血球计数板在显微镜上观察，计数，使孢子悬液浓度为1.0×10

其中，固态发酵培养基成分：麸皮18.97g，豆粕粉2.71g，(NH

(4)对诱变得到的黑曲霉诱变菌株进行固态发酵。测定各诱变菌株的β-葡聚糖酶的酶活力，选取酶活力相对原始菌株最高的诱变菌株为最终的目的菌株Aspergillussp.HL-4。从生长状况对比原始菌株CM96，诱变菌株HL-4生长速度比较慢且产孢子速度较慢。如图3所示，诱变菌株HL-4的菌丝更长，孢子更小更圆。由图4可以看出，两株菌的孢子均呈球状，但原始菌株CM96孢子表面有许多褶皱及突刺，而HL-4孢子表面褶皱变少，突刺消失。

实施例2

β-葡聚糖酶的酶活力测定

(1)粗酶液提取

取出恒温培养箱中已培养70h含β-葡聚糖酶的基质，称取烘干粉碎的β-葡聚糖酶发酵基质1g于容量瓶中加入缓冲液定容到50mL，摇床摇30min，4℃条件下避光浸提3h，摇匀，于3000r/min离心3min，上清液即为粗酶液。

(2)测定步骤

试样空白溶液：量取试样溶液2.00mL,置于具塞刻度试管中,37℃水浴中平衡10min。加人DNS试剂5.0mL,涡旋3s后加入β-葡聚糖溶液2.0mL,于37℃水浴保温30min。加入0.2mg/mL葡萄糖标准溶液1.00mL，混匀，置于沸水浴中反应5min。冷却至室温，加水定容至25mL摇匀。在540nm波长处测定吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样空白反应溶液上机浓度C

试样溶液：以β-葡聚糖为底物测定β-葡聚糖酶各诱变菌株的酶活力。量取试样溶液2.00mL,置于具塞刻度试管中，37℃水浴中平衡10min。加入β-葡聚糖溶液2.0mL，涡旋3s后37℃保温30min，加DNS试剂5.0ml，涡旋3s，以终止酶解反应。加入0.2mg/mL葡萄糖标准溶液1.00mL，混匀，置于沸水浴中反应5min,冷却至室温加水定容至25ml，摇匀。以试剂空白溶液为空白对照,在540nm波长处测定吸光度值，用标准曲线回归方程计算试样反应溶液上机浓度C。

β-葡聚糖酶活力单位定义：在37℃，PH为5.5的条件下，每分钟从浓度为4mg/mL的β-葡聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为1个β-葡聚糖酶活力单位，以U表示。

将各诱变菌株接种到固态发酵培养基中，接种量2mL孢子悬液，28℃培养70h，用DNS法测定诱变菌株和原始黑曲霉CM96的酶活，如图5所示，原始菌株的β-葡聚糖酶酶活力为2799.81U/g，经紫外诱变后酶活力为3341.29U/g，相比于原始菌株酶活提高了19.3％。

实施例3

β-葡聚糖酶发酵工艺的优化

(1)碳源种类及添加量对黑曲霉产β-葡聚糖酶的影响

以麸皮、花生壳粉、大麦粉、复合碳源(麸皮+花生壳粉+大麦粉、麸皮+大麦粉)等为供试碳源，28℃固态发酵70h，测定诱变菌株β-葡聚糖酶酶活力，结果如图6所示。由图6可以看出，当以麸皮为碳源时效果最佳，其次是复合碳源(麸皮+花生壳粉+大麦粉)、麸皮+大麦粉为碳源培养基时，其β-葡聚糖酶酶活力较高，大麦粉为碳源培养基时酶活力最差。因此选择麸皮作为碳源；

为进一步确定碳源添加量对β-葡聚糖酶的影响，选取添加量为14.97g、16.97g、18.97g、20.97g、22.97g进行试验，28℃固态发酵70h，测定β-葡聚糖酶酶活力，结果如图7所示，由图7可以看出，当麸皮添加量为20.97g时β-葡聚糖酶酶活力为最大值。因此，选择麸皮的添加量为20.97g；

本发明提供的突变菌株黑曲霉HL-4可广泛应用于β-葡聚糖酶的生产，能显著的降低该酶的生产成本，提高产量，有利于促进该酶在食品、饲料等行业的应用；

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

以上描述仅为本申请的较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。