载他克莫司长效缓释补片及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及他克莫司缓释研究技术领域，尤其涉及载他克莫司长效缓释补片及其制备方法和应用。

背景技术

他克莫司(FK506)是一种大环内酯类抗生素，其结构式如图1所示。他克莫司在1984年由日本藤泽制药株式会社(现为安斯泰来制药有限公司)研发上市，用于预防肝脏或肾脏移植术后的移植物排斥反应，治疗肝脏或肾脏移植术后应用其他免疫抑制药物无法控制的移植物排斥反应。

他克莫司是一种新型的强效免疫抑制剂，主要通过抑制IL-2、IFN-γ的释放来抑制T淋巴细胞的增殖与活化，其免疫抑制比环孢素强100倍。近年来，他克莫司作为心脏、肝脏及肾脏移植手术后抗排斥反应的一线药物。

他克莫司是一种低溶解性药物，BCS分类属于II类。目前他克莫司的剂型有口服速释制剂、口服缓释制剂、外用制剂及注射剂等。在临床应用过程中，需要每天多次给药，一天多次给药引起血药浓度波动较大，存在临床安全性问题。且他克莫司在水中的溶解性非常差(在25℃水中溶解约1.58μM)，溶出度非常低，给药剂量与实际血药浓度之间的相关性小，且治疗指数(therapeuticindex)也小，因而在设计制剂时存在各种问题。最近，他克莫司被研发出多种缓释制剂，例如安斯泰来制药有限公司生产的他克莫司缓释胶囊(商品名为新普乐可复)以及许多专利报道的缓释制剂，然而这些缓释制剂的缓释能力欠佳，仅能保证短时间(多在24h之内)的缓释效能，但移植术后病人需要长期服用此药物。因此，本领域需要开发一种制备工艺简单且具有长效缓释性能的他克莫司制剂。

发明内容

针对上述问题，本发明提供载他克莫司长效缓释补片及其制备方法和应用，主要为了解决现有的他克莫司缓释效果不佳的问题。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面

其中，他克莫司与高分子聚合物的质量比为1:100～5:100。他克莫司与高分子聚合物的负载方式可为现有的，也可如下述第三方面中采用共混在氯仿和丙酮的混合溶液进行负载。

通过将他克莫司负载于聚-ε己内酯、聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物，提升了缓释效能，使得药物服用后能够在较长时间内保持有效的药物释放剂量。

本发明第二方面

本发明第三方面介绍他克莫司缓释补片的制备方法，包括下述步骤

将他克莫司和高分子聚合物按1:100～5:100的比例混合，高分子聚合物至少为聚-ε己内酯、聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物中之一(任一或组合)，

溶解于体积比为5：1的氯仿和丙酮的混合溶液中，获得混合液；

将混合液装入电纺设备进行电纺，形成厚度100-700μm的补片；其中，电纺条件为：出料速度0.5mL/h，直流电源压力为10-15kV，电流1mA，温度为25℃，环境湿度50％。

其中，所述电纺设备包括注射器(一种实例，包括针头)、直流高压电源及收集器，电纺条件还包括：针头与接收铝箔纸的距离为15cm，针头以1-2cm/s往复运动，就该条件而言，与之相似等同的也都应当落在本发明的范围内。当采用其他类似的电纺设备时，

本发明第四方面

本发明第五方面

本发明的有益效果是：

提供他克莫司长效缓释补片，其长效缓释性能佳，可将其应用于心脏移植急性排斥反应的早期预防，且具有制备简单、安全等优点，能够实现急性排斥反应的治疗。

附图说明

图1为他克莫司的化学结构式；

图2为实施例1-3制备的电纺补片扫描电镜图；

图3为实施例1-3、对比例1-2的体外他克莫司累计释放百分比图；

图4为利用实施例3制备的电纺补片预防心脏移植急性排斥反应的效果图；

图5为对比例3的扫描电镜图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供一种他克莫司长效缓释补片，其制备方法包括以下步骤：

(1)将他克莫司和聚-ε己内酯按1:100质量比混合，溶解在氯仿和丙酮的混合溶液中(体积比为5：1)，制备成无色透明状液体，室温避光保存备用。

(2)将所述无色透明状溶液装入无菌注射器中，在直流高压电源作用下进行电纺，在收集器上形成层厚在100-700μm之间的补片；所述电纺条件是：注射速度0.5mL/h，直流电源压力为10-15kV，电流1mA，针头与接收铝箔纸的距离为15cm，针头以1-2cm/s往复运动，温度为25℃，环境湿度50％。

(3)将电纺补片裁剪至质量约10mg，并放于含0.2％Tween-80的20mL1×PBS缓冲溶液的离心管中，于不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h、120h、168h、336h)取样，利用高效液相色谱法进行他克莫司浓度测定。

实施例2

本实施例提供一种他克莫司长效缓释补片，其制备方法包括以下步骤：

(1)将他克莫司和聚-ε己内酯按2:100质量比混合，溶解在氯仿和丙酮的混合溶液中(体积比为5：1)，制备成无色透明状液体，室温避光保存备用。

(2)将所述无色透明状溶液装入无菌注射器中，在直流高压电源作用下进行电纺，在收集器上形成层厚在100-700μm之间的补片；所述电纺条件是：注射速度0.5mL/h，直流电源压力为10-15kV，电流1mA，针头与接收铝箔纸的距离为15cm，针头以1-2cm/s往复运动，温度为25℃，环境湿度50％。

(3)将电纺补片裁剪至质量约10mg，并放于含0.2％Tween-80的20mL1×PBS缓冲溶液的离心管中，于不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h、120h、168h、336h)取样，利用高效液相色谱法进行他克莫司浓度测定。

实施例3

本实施例提供一种他克莫司长效缓释补片，其制备方法包括以下步骤：

(1)将他克莫司和聚-ε己内酯按5:100质量比混合，溶解在氯仿和丙酮的混合溶液中(体积比为5：1)，制备成无色透明状液体，室温避光保存备用。

(2)将所述无色透明状溶液装入无菌注射器中，在直流高压电源作用下进行电纺，在收集器上形成层厚在100-700μm之间的补片；所述电纺条件是：注射速度0.5mL/h，直流电源压力为10-15kV，电流1mA，针头与接收铝箔纸的距离为15cm，针头以1-2cm/s往复运动，温度为25℃，环境湿度50％。

(3)将电纺补片裁剪至质量约10mg，并放于含0.2％Tween-80的20mL1×PBS缓冲溶液的离心管中，于不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h、120h、168h、336h)取样，利用高效液相色谱法进行他克莫司浓度测定。

实施例4

按照实施例1的制备方法，将聚-ε己内酯替换为聚乳酸(平均分子量为60000)，其他工艺不变，获得一种他克莫司长效缓释补片。且也都具有较好的缓释效果和有效抑制排斥反应的作用。

实施例5

按照实施例1的制备方法，将聚-ε己内酯替换为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(平均分子量为60000)，其他工艺不变，获得一种他克莫司长效缓释补片。且也都具有较好的缓释效果和有效抑制排斥反应的作用。

对比例1

将1mg他克莫司溶解与2mL75％乙醇中，配置成他克莫司溶液，将透析袋(分子量3500)一端密闭，加入他克莫司溶液，随后用夹子夹闭透析袋另一端，将之放于含0.2％Tween-80的20mL1×PBS缓冲溶液的离心管中，于不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h、120h、168h、336h)取样，利用高效液相色谱法进行他克莫司浓度测定。

对比例2

将聚-ε己内酯溶解在氯仿和丙酮的混合溶液中(体积比为5：1)，制备成无色透明状液体，室温避光保存备用。

将所述无色透明状溶液装入无菌注射器中，在直流高压电源作用下进行电纺，在收集器上形成层厚在100-700μm之间的补片；所述电纺条件是：注射速度0.5mL/h，直流电源压力为10-15kV，电流1mA，针头与接收铝箔纸的距离为15cm，针头以1-2cm/s往复运动，温度为25℃，环境湿度。

将电纺补片裁剪至质量约10mg，并放于含0.2％Tween-80的20mL1×PBS缓冲溶液的离心管中，于不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h、120h、168h、336h)取样，利用高效液相色谱法进行他克莫司浓度测定。

对比例3

(1)将他克莫司和聚-ε己内酯按5:100质量比混合，溶解在氯仿和丙酮的混合溶液中(体积比为5：1)，制备成无色透明状液体，室温避光保存备用。

(2)将所述无色透明状溶液装入无菌注射器中，在直流高压电源作用进行电纺，在收集器上形成层厚在100-700μm之间的补片；所述电纺条件是：注射速度1mL/h，直流电源压力为10kV，电流1mA，针头与接收铝箔纸的距离为10cm，针头以1-2cm/s往复运动，温度为25℃，环境湿度50％。

(3)将电纺补片裁剪至质量约10mg，并放于含0.2％Tween-80的20mL1×PBS缓冲溶液的离心管中，于不同时间点(4h、8h、12h、24h、48h、72h、120h、168h、336h)取样，利用高效液相色谱法进行他克莫司浓度测定。

成品测定：

1、扫描电镜检测：

将实施例1-3以及对比例3制备的电纺补片进行扫描电镜检测，实施例1-3的电纺补片电镜下观察粗细均匀(如图2)，但对比例3所制备的电纺补片微观结构显示粗细不均(如图5)，可见在本发明的技术方案下可使得电纺补片微观结构粗细更加均匀。

2、体外缓释性能检测(高效液相色谱法)：

精密称取10mg电纺补片置于50mL离心管中，并加入0.5％的Tween80作助溶剂，另准备透析袋，透析夹。分别将样品浸润在含有20mL1×1×PBS的离心管中，将离心管置于恒温摇床上，转速100，温度37℃。

时间点取样：分别在4h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、168h、336h取1mL液体置于2mL离心管中并重新加入1mL1×1×PBS至释放体系中，然后15000rpm，离心10min，取上清液转移至进样瓶中。分别将样品转移至进样瓶中，上机检测，流动相为乙腈与0.1％的磷酸水溶液(70/30)，高效液相色谱柱选用C18(4.6mm×250mm,5μm)，柱温50℃，流速1mL/min，进样体积10μL，检测波长215nm，检测时间10min。

体外累计释放曲线(见图3)，电纺补片的缓释性能良好，能保持长达14天的释放效果，且相对于其他的补片具有更好的缓释效果。

3、电纺补片治疗心脏移植急性排斥的疗效验证(应用举例)

(1)手术建立大鼠心脏移植模型。其具体操作为：准备体重200-250g雄性大鼠，4％异氟烷诱导麻醉，2％维持麻醉，固定于自制手术台上，备皮、75％酒精表皮消毒后于腹部正中开口，开口长约3-5cm；用棉签分离肠管暴露下腔静脉，注入肝素钠盐水2mL(125U/ml)，待循环1min后，剪断腹主动脉。接下来从两侧剪断肋骨暴露胸腔，打开心包，加入冰盐水促使心脏停跳，然后分离胸腺及周围脂肪组织，暴露升主动脉并用显微直剪刀垂直剪断，保证切口平整。随后从下腔静脉注入20-50mL低温肝素化生理盐水，待心脏颜色呈淡粉色可结束灌注。准备6-0丝线，依次分离、结扎、剪断下腔静脉、双侧上腔静脉、双侧心耳。最后分离肺动脉主干，利用显微直剪刀在肺动脉分叉前将其剪断，另将剩余心底血管一并结扎后取下供心，置于4℃低温盐水中保存备用。分别将2个显微血管夹置于肾动脉以下水平的位置及髂动脉以上水平的位置，分别在主动脉及下腔静脉前壁做一开口，开口长度与供心的升主动脉内径、肺动脉干内径相匹配；将供心置于受体右下腹部，并用湿纱布覆盖。用9-0带针显微缝线将升主动脉与腹主动脉吻合，肺动脉与下腔静脉吻合，吻合方式为连续缝合法。缝合完毕后，移除动脉夹同时用棉签加压止血。观察3-5min在无明显出血的情况，将肠管回于腹中，此时动作不易过大，防止二次出血。2mL硫酸庆大霉素冲洗腹腔后用3-0缝线进行腹部缝合。

(2)电纺缓释补片植入：将补片裁剪至20×10mm大小，植入表皮与肌肉层之间，继续用3-0缝线进行腹部缝合。

(3)术后通过触摸的方式评估移植物的生存时间，分别在移植的第7天处死老鼠，取出移植物进行病理染色，免疫组化染色评估T淋巴细胞、巨噬细胞浸润，评估排斥反应程度(见图4)。

本发明电纺缓释补片可长效缓释他克莫司，有效抑制淋巴细胞活化与增殖，延长移植物生存时间。

本发明利用有机溶剂将他克莫司和高分子聚合物(聚-ε己内酯、聚乳酸或聚乳酸-羟基乙酸共聚物)溶解制备成为静电纺丝溶液，经过静电纺丝技术制备成电纺补片，经检测，实施例3长效缓释性能最佳，高于其他实施例。本发明实施例1-3均具有较好的缓释性能。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。