筛选TCR的方法及其分离的TCR

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体地，本发明涉及一种筛选TCR的方法及其分离的TCR，更具体地，本发明涉及一种筛选TCR的方法、分离的TCR、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。

背景技术

SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)分别具有80％和50％同源性。

冠状病毒的T细胞免疫疗法是指将与冠状病毒抗原具有高亲合力的特异性TCR基因转移到T细胞中，得到TCR-T细胞，TCR-T细胞所表达的TCR可特异性结合期望的冠状病毒相关抗原，从而激活T 细胞，特异性杀伤冠状病毒。

因此，筛选能够特异性靶向结合冠状病毒的TCR，是冠状病毒的T细胞免疫疗法成功的关键所在，并且该TCR匹配的抗原或抗原表位肽也可用于冠状病毒疫苗的制备。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种筛选TCR的方法，基于此方法筛选出的TCR能够特异性识别和靶向结合新型冠状病毒。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的：

冠状病毒的基因组编码四种结构蛋白，包括刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋。 S蛋白含有受体结合结构域(RBD)，可介导病毒附着在宿主细胞表面受体上，以及随后病毒与宿主细胞膜之间的融合，以促进病毒进入宿主细胞。S蛋白具有较大的胞外域，在疫苗设计中最受关注；而N、 M和E蛋白的研究相对较少，但也具有研究价值。M和E蛋白比S蛋白更保守，N蛋白是一种丰富且具有高度免疫原性的抗原，据报道，COVID-19患者对来自SARS-CoV的N蛋白的抗原具有交叉反应性。目前，出现了众多SARS-CoV-2感兴趣的变体(VOI)和关注的变体(VOC)，例如Alpha(B.1.1.7)、 Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)引起了人们对接种疫苗或康复人群的免疫逃逸的深切关注。有研究表明，一些突变体可以逃避现有的SARS-CoV-2中和抗体，尤其是Omicron 变体，因为识别主要在S蛋白的RBD区域介导，该区域具有高突变率。有研究表明，T细胞反应对许多变体具有交叉反应性，包括Omicron变体。还有研究发现，与抗体相比，从COVID-19中恢复的个体中，特异性靶向SARS-CoV-2的T细胞可在一年内继续维持其功能，这表明特异性靶向SARS-CoV-2的 T细胞的持久性可能对长期免疫保护起到至关重要的作用。目前已鉴定出可介导SARS-CoV-2激活T细胞反应的表位，并且该表位可用作SARS-Cov-2疫苗以诱导SARS-CoV-2激活T细胞免疫。然而， SARS-CoV-2特异性TCR的序列以及其与SARS-CoV-2变体的交叉反应性并不清楚。

传统的鉴定SARS-CoV-2特异性TCR序列的方法主要是通过MHC呈递抗原预测算法对新冠病毒抗原表位进行预测后合成抗原表位肽，利用合成的抗原表位肽对新冠康复病人单个核细胞(PBMC)样本进行体外刺激，获得特异性T细胞。之后通过合成MHC四聚体来鉴定特定的TCR序列。但是这种方法依赖于抗原表位肽的合成，花费成本较高；另外，纯化MHC四聚体工作量大，劳动力密集。因此，该方法存在工作量大和成本高等缺点，无法实现TCR序列的高效鉴定。

基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种筛选TCR的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第一细胞与第二细胞进行共培养处理，所述第一细胞表达单个HLA等位基因和多个抗原表位肽，所述第二细胞选自T细胞或含有T细胞的细胞群；将共培养处理后获得的第二细胞进行分选处理，得到分选细胞，所述分选细胞表达有与所述抗原表位肽结合的TCR，所述TCR为目标TCR；其中，所述第一细胞是通过将表达载体导入受体细胞后获得的，所述表达载体携带串联小基因，所述串联小基因编码所述多个抗原表位肽。根据本发明实施例的筛选TCR的方法可获得特异性靶向抗原表位肽的TCR，该方法中的第一细胞中含有多个抗原表位肽，其可单次获得多个TCR，具有筛选效率高和筛选成本低等优点；并且，获得的TCR可特异性识别抗原表位肽，尤其是当多个抗原表位肽来源于同一病毒或病原细胞时，该方法得到的多个TCR均可特异性识别该病毒或病原细胞，具有筛选效率高等优点。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种分离的TCR。根据本发明的实施例，所述分离的TCR包括：TCRα链可变区和TCRβ链可变区；所述TCRα链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:63、SEQID NO:69、SEQ ID NO:75、 SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:111；或，所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:66、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQID NO:108和SEQ ID NO:114。根据本发明实施例的分离的TCR 均可特异性识别SARS-CoV-2，并且，该分离的TCR对具有相当激活水平的突变抗原具有交叉反应性，能够识别和结合SARS-CoV-2变体，杀伤更多SARS-CoV-2变体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的TCR。根据本发明的实施例，所述分离的TCR是通过前述的方法获得的。根据上述方法获得的TCR具有特异性识别抗原肽的功能，识别更加广谱的携带所述抗原肽的抗原生物。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的分离的TCR。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带前述的核酸分子。利用该表达载体可以有效地用于表达前述分离的TCR，尤其是在原核生物或者低等真核生物表达体系中可以有效地表达前述分离的TCR。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带前述的核酸分子或前述的构建体；或表达前述的分离的TCR。根据本发明实施例的重组细胞表达前述分离的 TCR，能够特异性识别预定抗原肽，对携带所述抗原肽的抗原生物的识别能够更强。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前述的分离的TCR、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞。发明人经过大量实验发现，上述药物组合物可有效地预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的相关疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的分离的TCR、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或前述的药物组合物在制备药物中用途，所述药物用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的相关疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗原表位肽。根据本发明的实施例，所述抗原表位肽包括具有SEQ ID NO:229～256所示的氨基酸序列中的至少之一。发明人经过实验得到上述在新型冠状病毒与其他冠状病毒(例如MERS-CoV、HKU1-CoV、OC43-CoV、NL63-CoV和h229E-CoV等)中保守存在的抗原表位肽；并且经过实验发现，采用表达上述的抗原表位肽的细胞体外刺激T细胞，以得到能特异性识别冠状病毒的TCR。该TCR具有交叉反应活性，可识别多种抗原表位肽及其突变体，能够快速应对冠状病毒突变株的变化。并且，采用该抗原表位肽还可以制备新冠疫苗，该新冠疫苗可诱导产生新冠病毒特异的T细胞免疫反应，表现出良好的免疫原性和免疫效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的抗原表位肽。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到表达载体上时，可以将核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于表达载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于表达载体本身。当然，核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的抗原表位肽。可以将表达载体导入到宿主细胞中，构建获得表达前述抗原表位肽的重组细胞，该重组细胞表达抗原表位肽。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗原。根据本发明的实施例，所述抗原包括前述的抗原表位多肽。采用表达上述的抗原的重组细胞体外刺激T细胞，以得到能特异性识别冠状病毒的TCR。该 TCR具有交叉反应活性，可识别多种抗原表位肽及其突变体，能够快速应对冠状病毒突变株的变化。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的抗原表位肽、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前述的抗原表位多肽。根据本发明的药物组合物可预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病，例如新冠疫苗，新冠疫苗可诱导产生新冠病毒特异的T细胞免疫反应，表现出良好的免疫原性和免疫效果。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的抗原表位肽、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在筛选特异性识别新型冠状病毒的TCR中的用途。采用表达上述的抗原表位肽的重组细胞体外刺激T细胞，以得到能特异性识别冠状病毒的TCR。该TCR具有交叉反应活性，可识别多种抗原表位肽及其突变体，能够快速应对冠状病毒突变株的变化。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为本发明实施例1中七种冠状病毒间保守的抗原表位肽分布图；

图2为本发明实施例1中两个样本的实验组和阴性对照组在不同体外刺激培养时间的的T细胞检测结果；

图3为本发明实施例1中单细胞聚类结果；

图4为本发明实施例3中K562细胞制备的示意图；

图5为本发明实施例3中TCR-T细胞对抗原表位肽的功能验证的检测示意图；

图6为本发明实施例3中获得的19个TCR对抗原表位肽的识别能力的检测结果；

图7为本发明实施例4中15个TCR对新冠抗原突变体的交叉反应活性的检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

在本文中，术语“41BB”、“CD137”和“4-1BB”可交换使用。

在本文中，术语“新型冠状病毒”、“新冠病毒”和“新冠”可交换使用。

在本文中，术语“亲和力”是指分子(例如HLA 等位基因编码的MHC)与分子(例如抗原或抗原表位肽) 之间全部非共价相互作用总和的强度。

在本文中，术语“抗原肽”和“抗原表位肽”和互换使用。

在本文中，“多核苷酸”或“核酸”可交换使用，其是指任何长度的核苷酸链，并且包括DNA或RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物、或者能够通过 DNA或RNA聚合酶掺入链的任何底物。

在本文中，术语“载体(vector)”、“表达载体”和“构建体”可交换使用，其能够将一种或多种所关注的基因或序列递送入宿主细胞，并且优选在宿主细胞中表达所述基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、质粒、粘粒或噬菌体载体。

在本文中，术语“宿主细胞”和“宿主细胞系”可互换使用，是指已经引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的子代。宿主细胞包括“转化子”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞以及由此来源的子代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上与亲代细胞可能不完全相同，但可能含有突变。本文包括与在初始转化的细胞中筛选或选择的细胞，该筛选或选择的细胞与初始转化的细胞具有相同功能或生物学活性的突变子代。

在本文中，“药物组合物”可指用于疾病的治疗，也可用于细胞的体外培养实验。用于疾病的治疗时，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的辅料相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体辅料、细碎固体辅料或这两者相结合，制备组合物。

在本文中，术语“药学上可接受的”是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。

在本文中，术语“药学上可接受的辅料”或者“药学上可接受的载体”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。

在本文中，术语“治疗”是指用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。

本发明提出了一种筛选TCR的方法、分离的TCR、抗原表位肽、抗原、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途，下面将分别对其进行详细描述。

筛选TCR的方法

本文中，术语“T细胞受体(简称TCR)”是一种可以在T细胞表面上找到的分子，其负责识别与 MHC分子结合的抗原。天然存在的TCR异二聚体由约95％的T细胞中的alpha(α)和beta(β)链组成，而约5％的T细胞具有由gamma(γ)和delta(δ)链组成的TCR。在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后被主要组织相容性复合物(MHC)分子携带到细胞表面，T细胞能够识别抗原呈递细胞表面上的此抗原肽-MHC复合物，TCR与抗原肽-MHC复合物的结合导致T淋巴细胞活化，在T淋巴细胞上通过由相关的酶、共受体和专门的辅助分子介导的一系列生化反应来表达TCR。

MHC分子可以是I类或II类MHC分子。该复合物可以在抗原呈递细胞，例如：树突状细胞、B细胞或任何其他细胞(如K562细胞)。人白细胞抗原系统(HLA)是编码人类主要组织相容性复合物(MHC) 的基因复合物的名称，并且包括HLA I类抗原(A、B和C)和HLA II类抗原(DP、DQ和DR)。HLA等位基因A、B和C呈递主要源自细胞内蛋白质，例如在细胞内表达的蛋白质的肽。

在体内T细胞发育过程中，某些T细胞及其表达的TCR仅识别由某些类型的MHC分子(即由特定HLA等位基因编码的MHC分子)呈递的肽，称之为HLA限制。例如，一种HLA等位基因是HLA*A-11:01，其在亚洲人群体中的大多数中表达，因此，结合由HLA*A-11:01细胞系编码的MHC呈递的抗原表位肽的TCR(即是HLA*A-11:01限制性)是有利的，因为利用此类TCR的免疫疗法将适合治疗大部分亚洲人群体。

基于此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种筛选TCR的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将第一细胞与第二细胞进行共培养处理，所述第一细胞表达单个HLA等位基因和多个抗原表位肽，所述第二细胞选自T细胞或含有T细胞的细胞群；将共培养处理后获得的第二细胞进行分选处理，得到分选细胞，所述分选细胞表达有与所述抗原表位肽结合的TCR，所述TCR为目标TCR；其中，所述第一细胞是通过将表达载体导入受体细胞后获得的，所述表达载体携带串联小基因，所述串联小基因编码所述多个抗原表位肽。

根据本发明实施例的筛选TCR的方法可获得特异性靶向抗原表位肽的TCR，尤其是第一细胞中含有多个抗原表位肽，其可单次获得多个TCR，具有筛选效率高和筛选成本低等优点；并且，获得的TCR 可特异性识别抗原表位肽，尤其是当多个抗原表位肽来源于同一病毒或病原细胞时，该方法得到的多个 TCR均可特异性识别该病毒或病原细胞，具有筛选效率高等优点。并且，该方法筛选的TCR对具有相当激活水平的突变抗原表位肽具有交叉反应性。

在本文中，术语“串联小基因(Tandem Minigenes，简称TMG)”是由多个抗原表位肽的编码序列连接得到。

根据本发明的实施例，所述串联小基因编码8～11个所述抗原表位肽。发明人经过实验发现，若选择的抗原表位肽过多，会影响慢病毒包装与转染过程。

根据本发明的实施例，所述抗原表位肽选自具有8～11氨基酸的肽段。

根据本发明的实施例，所述多个抗原表位肽预先通过MHC呈递抗原预测软件预测获得。由此，可预测抗原表位肽和MHC之间的亲和力。

需要说明的是，MHC呈递抗原预测软件是指能够预测抗原表位肽和MHC之间的亲和力的软件，在本发明中对软件的类型不做具体限定，只要可预测抗原表位肽和MHC之间的亲和力即可。示例性地，可选择NetMHC、Net MHC pan、SMM、SMMPMBEC、ARB、Pickpocket、Consensus、MHC flurry或 Comblib_Sidney2008。

根据本发明的实施例，所述多个抗原表位肽预先经过筛选处理获得。由此，通过预测结果，筛选出与MHC具有较强亲和力的抗原表位肽。

根据本发明的实施例，所述多个抗原表位肽与所述单个HLA等位基因所编码的MHC具有亲和力是所述多个抗原表位肽为目标抗原表位肽的指示。由此，得到的抗原表位肽与第一细胞表达的MHC可形成抗原表位肽-MHC复合物。

根据本发明的实施例，所述共培养处理包括：将所述第一细胞和所述第二细胞在不含IL-2的培养基中进行第一共培养处理；将经过所述第一共培养处理的细胞在含IL-2的培养基中进行第二共培养处理；将经过所述第二共培养处理的细胞在不含IL-2的培养基中进行第三共培养处理。

发明人经过大量的实验发现，先将第一细胞和第二细胞在不含IL-2的培养基中进行第一共培养处理，可防止细胞的非特异性扩增，以便得到能够特异性结合第一细胞上的抗原表位肽-MHC复合物的T 细胞(简称特异性T细胞)；在含有IL-2的培养基中进行第二共培养处理，可提高特异性T细胞的增长速度，从而提高细胞群体中特异性T细胞比例；然后在不含有IL-2的培养基中进行第三共培养处理，可降低第三共培养处理的共培养液中非特异性扩增的T细胞的比例，进一步提高共培养液中特异性T细胞的比例。

根据本发明的实施例，所述第一共培养处理中，所述第一细胞与所述第二细胞的起始细胞数比为1: (25～35)。根据本发明实施例的上述配比，有利于特异性T细胞的扩增。

需要说明的是，起始细胞数比是指开始加入时两种或多种细胞的细胞数比。

根据本发明的实施例，所述第一共培养处理中多次加入所述第一细胞。发明人经过实验发现，通过多次加入第一细胞可进一步提高第一细胞对第二细胞的刺激，有利于特异性T细胞的扩增。

需要说明的是，多次加入第一细胞后，第一共培养过程中的第一细胞与第二细胞的细胞数比大于其起始细胞数比。

根据本发明的实施例，所述第一共培养处理的处理时间为8-10d。进而进一步提高特异性T细胞的扩增效率。

根据本发明的实施例，所述第一共培养处理中，所述第一细胞的加入次数为两次，第一次加入所述第一细胞的时间为所述第一共培养处理的第4～6d，第二次加入所述第一细胞的时间为所述第一共培养处理的第6～8d。由此，可进一步提高特异性T细胞的扩增效率。

根据本发明的实施例，所述第二共培养处理中，所述第一细胞与所述第二细胞的细胞数比为1: (3～5)。根据本发明实施例的上述配比，有利于提高特异性T细胞的增长速度。

根据本发明的实施例，所述分选细胞是基于所述共培养处理活化的T细胞表达的活化标志物进行选择的。

根据本发明的实施例，所述第二细胞表达有41BB是分选细胞的指示。41BB又名CD137，是在活化的CD4+和CD8+T细胞上表达的诱导型共刺激受体。由此，可分选出被活化的T细胞，以便获得分选出的T细胞的TCR序列。

根据本发明的实施例，所述第二共培养处理中，所述IL-2在所述培养基中的添加量为20～100IU/mL。根据本发明实施例的上述配比，可进一步提高特异性T细胞的增长速度。

根据本发明的实施例，所述共培养处理中，所述培养基选自RPMI 1640培养基。

根据本发明的实施例，所述第三共培养处理中，所述第一细胞与所述第二细胞的细胞数比为1: (3～5)。根据本发明实施例的上述配比，有利于提高共培养液中特异性T细胞的比例。

根据本发明的实施例，所述分选处理中，分别筛选出表达41BB+CD4+、41BB+CD8+、41BB-CD8+ 和41BB-CD4+的分选细胞。其中，+为表达、-为不表达，例如“41BB-CD8+”是指分选的细胞表达CD8、但不表达41BB。

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述分选细胞的TCR进行测序处理，获得多个所述目标TCR序列。由此，可直接获得目标TCR的序列。

根据本发明的实施例，所述测序处理是通过10X Genomics单细胞测序技术进行的。

根据本发明的实施例，所述测序处理包括分别对混合的所述分选细胞和混合的所述阴性细胞进行测序。发明人经过实验意外地发现，阴性细胞中也存在表达有41BB的细胞，通过同时对阴性细胞进行测序分析，可去除得到的分选细胞中非特异性TCR序列。

根据本发明的实施例，所述测序处理之前，预先将不同所述分选细胞进行第一混合处理，以及将不同的阴性细胞进行第二混合处理，所述阴性细胞为经过不表达抗原表位肽的第一细胞刺激的第二细胞。所述第一混合处理和第二混合处理中，表达41BB+CD4+的分选细胞：表达41BB+CD8+的分选细胞：表达41BB-CD8+的分选细胞：表达41BB-CD4+的分选细胞的细胞数比为(8-12)：(75-85)：(8-12)： (1-3)。

根据本发明的实施例，所述抗原表位肽选自新型冠状病毒的抗原表位肽。由此，得到的TCR可特异性结合新型冠状病毒的抗原，从而可使表达TCR的免疫细胞激活，并特异性杀伤新型冠状病毒。

根据本发明的实施例，所述TCR与新型冠状病毒抗原结合。

根据本发明的实施例，所述第二细胞来源于经过新型冠状病毒感染的个体。由此，与未经新型冠状病毒感染的个体相比，经过新型冠状病毒感染的个体具有比较高的新型冠状病毒特异性TCR，体外刺激后可得到特异性TCR的T细胞。

需要说明的是，经过新型冠状病毒感染的个体包括经过新型冠状病毒感染且未痊愈的个体(或称新型冠状病毒正在感染的个体)和经过新型冠状病毒感染且已经痊愈的个体。

根据本发明的实施例，所述第二细胞选自外周血单个核细胞。外周血单个核细胞可从外周血中直接分离出来，且外周血单个核细胞中含有大量的T细胞，通过将第一细胞和外周血单个核细胞共培养，第一细胞的抗原表位肽-MHC复合物可刺激外周血单个核细胞中的T细胞，以便得到表达有特异性TCR 的T细胞。

需要说明的是，本申请中的外周血单个核细胞可直接从外周血中进行分离，分离方法不受具体限制。示例性地，可采用GE Ficoll-Paque分离液对外周血中的单个核细胞进行分离。

根据本发明的实施例，所述新型冠状病毒抗原包括选自具有SEQ ID NO:229～256任一项所示氨基酸序列的抗原表位肽中的至少之一。

HLMGWDYPK(SEQ ID NO:229)。

SSGDATTAY(SEQ ID NO:230)。

YQNNVFMSEAK(SEQ ID NO:231)。

FCSQHTMLVK(SEQ ID NO:232)。

SLAIDAYPLTK(SEQ ID NO:233)。

AAVDALCEK(SEQ ID NO:234)。

TVSALVYDNKLK(SEQ ID NO:235)。

RVIHFGAGSDK(SEQ ID NO:236)。

LALGGSVAIK(SEQ ID NO:237)。

ASMPTTIAK(SEQ ID NO:238)。

YIFFASFYY(SEQ ID NO:239)。

VTDTPKGPK(SEQ ID NO:240)。

FPPTSFGPL(SEQ ID NO:241)。

PLYYDSMSY(SEQ ID NO:242)。

ATVVIGTSK(SEQ ID NO:243)。

KLFAAETLK(SEQ ID NO:244)。

VVYRGTTTY(SEQ ID NO:245)。

SSNVANYQK(SEQ ID NO:246)。

GVAMPNLYK(SEQ ID NO:247)。

ATSRTLSYYK(SEQ ID NO:248)。

LSPRWYFYYL(SEQ ID NO:249)。

ATEGALNTPK(SEQ ID NO:250)。

SQASSRSSSR(SEQ ID NO:251)。

QQQQGQTVTK(SEQ ID NO:252)。

ASAFFGMSR(SEQ ID NO:253)。

AYKTFPPTEPKK(SEQ ID NO:254)。

AQALNTLVKQL(SEQ ID NO:255)。

CMTSCCSCLK(SEQ ID NO:256)。

分离的TCR

TCRα链和TCRβ链都是免疫球蛋白超家族的成员，并拥有一个N端免疫球蛋白(Ig)可变域(V)、一个Ig恒定域(C)、跨膜/细胞跨膜区和一个C端的短胞质尾部。其中，TCRα链和TCRβ链两者的可变域(V)均具有三个高变或互补决定区(CDR)。例如，TCRα链或β链包含氨基至羧基末端顺序的CDR1、CDR2 和CDR3。通常，TCR中与主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原肽主要结合的部分是互补决定区 3(CDR3)，CDR3是体细胞重排事件时产生的，在每个TCR链基因的重排基因座处插入/缺失的随机核苷酸大大增加了高度可变的CDR3序列的多样性。因此，T细胞受体的多样性集中在CDR3上。

因此，在本发明的另一方面，本发明提出了一种分离的TCR。根据本发明的实施例，所述分离的 TCR包括：TCRα链可变区和TCRβ链可变区；所述TCRα链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:105 和SEQ ID NO:111；或，所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30、SEQID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:66、SEQID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:114。根据本发明实施例的分离的TCR均可特异性识别SARS-CoV-2，并且，该分离的TCR对具有相当激活水平的突变抗原具有交叉反应性，能够识别和结合SARS-CoV-2变体，杀伤更多SARS-CoV-2变体。

根据本发明的实施例，所述TCRα链可变区进一步包括选自下列至少之一的CDR1序列：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61、SEQ IDNO:67、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ IDNO:103和SEQ ID NO:109。

根据本发明的实施例，所述TCRα链可变区进一步包括选自下列至少之一的CDR2序列：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:68、SEQ ID NO:74、 SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQID NO:104和SEQ ID NO:110。

根据本发明的实施例，所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR1序列：SEQID NO:4、 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQID NO:40、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70、SEQID NO:76、 SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:112。

根据本发明的实施例，所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR2序列：SEQID NO:5、 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:71、SEQID NO:77、 SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:113。

根据本发明的实施例，所述TCRα链可变区包括：分别如SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列所示的 CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:13-15的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQID NO:19-21 的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:31-33的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:37-39的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:43-45的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:49-51的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:55-57的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:61-63的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:67-69的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:73-75的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:79-81的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:85-87的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:91-93的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:97-99的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:103-105的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:109-111的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列。

根据本发明的实施例，所述TCRβ链可变区包括：分别如SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列所示的 CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQID NO:22-24 的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:28-30的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:34-36的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:40-42的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:46-48的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:52-54的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:58-60的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:64-66的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:70-72的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:76-78的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:82-84的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:88-90的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:94-96的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:100-102的氨基酸序列所示的CDR1、 CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:106-108的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:112-114的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列。

根据本发明的实施例，所述分离的TCR包括：分别如SEQ ID NO:1-3的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:4-6的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区 CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:7-9的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、 CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:10-12的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:13-15的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:16-18的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:19-21的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:22-24的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:28-30的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ IDNO:31-33的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:34-36的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:37-39的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、 CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:40-42的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、 CDR3序列；分别如SEQ ID NO:43-45的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:46-48的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如 SEQ ID NO:49-51的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:52-54的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:55-57的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:58-60的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:61-63的氨基酸序列所示的 TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:64-66的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:67-69的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、 CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:70-72的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、 CDR3序列；分别如SEQ ID NO:73-75的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQID NO:76-78的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如 SEQ ID NO:79-81的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:82-84的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:85-87的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:88-90的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:91-93的氨基酸序列所示的 TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:94-96的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:97-99的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、 CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:100-102的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、 CDR3序列；分别如SEQ ID NO:103-105的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3 序列，和分别如SEQ ID NO:106-108的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者，分别如SEQ ID NO:109-111的氨基酸序列所示的TCRα链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列，和分别如SEQ ID NO:112-114的氨基酸序列所示的TCRβ链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。

其中，TCRα链可变区和TCRβ链可变区的氨基酸序列如下所示：

YGGTVN(SEQ ID NO:1)；YFSGDPLV(SEQ ID NO:2)；CAVNEGDDKIIF(SEQ ID NO:3)。

MGHRA(SEQ ID NO:4)；YSYEKL(SEQ ID NO:5)；CASSSTAGGWNEQFF(SEQ ID NO:6)。

TSESDYY(SEQ ID NO:7)；QEAYKQQN(SEQ ID NO:8)；CAYRSVPLNRDDKIIF(SEQ IDNO: 9)。

LNHDA(SEQ ID NO:10)；SQIVND(SEQ ID NO:11)；CASSKSGTGYQPQHF(SEQ ID NO:12)。

NSMFDY(SEQ ID NO:13)；ISSIKDK(SEQ ID NO:14)；CAASAGNQFYF(SEQ ID NO:15)。

LGHDT(SEQ ID NO:16)；YNNKEL(SEQ ID NO:17)；CASSRYIPGAYNEQFF(SEQ ID NO:18)。

TRDTTYY(SEQ ID NO:19)；RNSFDEQN(SEQ ID NO:20)；CALSEAVDSNYQLIW(SEQ IDNO: 21)。

SEHNR(SEQ ID NO:22)；FQNEAQ(SEQ ID NO:23)；CASSLRQGPNYGYTF(SEQ ID NO:24)。

NSMFDY(SEQ ID NO:25)；ISSIKDK(SEQ ID NO:26)；CAASDENEKLTF(SEQ ID NO:27)。

MNHNY(SEQ ID NO:28)；SVGAGI(SEQ ID NO:29)；CASKGGGTSGYEQFF(SEQ ID NO:30)。

TRDTTYY(SEQ ID NO:31)；RNSFDEQN(SEQ ID NO:32)；CALSAMDSSYKLIF(SEQ IDNO: 33)。

MNHEY(SEQ ID NO:34)；SMNVEV(SEQ ID NO:35)；CASSLRRGPFNEQFF(SEQ ID NO:36)。

NSMFDY(SEQ ID NO:37)；ISSIKDK(SEQ ID NO:38)；CAARTGDDKIIF(SEQ ID NO:39)。

ENHRY(SEQ ID NO:40)；SYGVKD(SEQ ID NO:41)；CAINKQGFNQPQHF(SEQ ID NO:42)。

NSMFDY(SEQ ID NO:43)；ISSIKDK(SEQ ID NO:44)；CAAMSMNRDDKIIF(SEQ ID NO:45)。

MGHRA(SEQ ID NO:46)；YSYEKL(SEQ ID NO:47)；CASSRLPGLAGGTVVNEQFF(SEQ IDNO:48)。

DSASNY(SEQ ID NO:49)；IRSNVGE(SEQ ID NO:50)；CAAIQEYGNKLVF(SEQ ID NO:51)。

SGHKS(SEQ ID NO:52)；YYEKEE(SEQ ID NO:53)；CASSPRTLFTGELFF(SEQ ID NO:54)。

TRDTTYY(SEQ ID NO:55)；RNSFDEQN(SEQ ID NO:56)；CALSEALNTGNQFYF(SEQ IDNO: 57)。

LGHDT(SEQ ID NO:58)；YNNKEL(SEQ ID NO:59)；CASSQVAYSPLHF(SEQ ID NO:60)。

SSNFYA(SEQ ID NO:61)；MTLNGDE(SEQ ID NO:62)；CAPKGSTLTF(SEQ ID NO:63)。

LNHDA(SEQ ID NO:64)；SQIVND(SEQ ID NO:65)；CASSIGDSGISGKFF(SEQ ID NO:66)。

VSGNPY(SEQ ID NO:67)；YITGDNLV(SEQ ID NO:68)；CAVRRLMDSNYQLIW(SEQ IDNO: 69)。

SGHVS(SEQ ID NO:70)；FNYEAQ(SEQ ID NO:71)；CASSHGTSGSSHEQFF(SEQ ID NO:72)。

NYSPAY(SEQ ID NO:73)；IRENEKE(SEQ ID NO:74)；CALDGSGGGADGLTF(SEQ ID NO:75)。

SGHVS(SEQ ID NO:76)；FQNEAQ(SEQ ID NO:77)；CASSPGRSGNTIYF(SEQ ID NO:78)。

NSMFDY(SEQ ID NO:79)；ISSIKDK(SEQ ID NO:80)；CAASPEYNNNDMRF(SEQ ID NO:81)。

KGHSH(SEQ ID NO:82)；LQKENI(SEQ ID NO:83)；CASSRTLGTSGNTQYF(SEQ ID NO:84)。

NSMFDY(SEQ ID NO:85)；ISSIKDK(SEQ ID NO:86)；CAASEAGGNEKLTF(SEQ ID NO:87)。

LNHNV(SEQ ID NO:88)；YYDKDF(SEQ ID NO:89)；CATSREQAGQPQHF(SEQ ID NO:90)。

NYSPAY(SEQ ID NO:91)；IRENEKE(SEQ ID NO:92)；CALWDFNKFYF(SEQ ID NO:93)。

MNHEY(SEQ ID NO:94)；SMNVEV(SEQ ID NO:95)；CASSPYSGGQGETQYF(SEQ ID NO:96)。

VSGNPY(SEQ ID NO:97)；YITGDNLV(SEQ ID NO:98)；CAVKRDSNYQLIW(SEQ ID NO:99)。

MDHEN(SEQ ID NO:100)；SYDVKM(SEQ ID NO:101)；CASSLTQDMGNTIYF(SEQ ID NO:102)。

TSGFNG(SEQ ID NO:103)；NVLDGL(SEQ ID NO:104)；CAVRDAYSGAGSYQLTF(SEQ IDNO:105)。

DFQATT(SEQ ID NO:106)；SNEGSKA(SEQ ID NO:107)；CSARDTAGTGNGYTF(SEQ IDNO:108)。

TRDTTYY(SEQ ID NO:109)；RNSFDEQN(SEQ ID NO:110)；CALSEAYQGAQKLVF(SEQ IDNO:111)。

SGDLS(SEQ ID NO:112)；YYNGEE(SEQ ID NO:113)；CASSVGGTVQETQYF(SEQ ID NO:114)。

根据本发明的实施例，所述TCR具有如SEQ ID NO：115、117、119、121、123、125、127、129、 131、133、135、137、139、141、143、145、147、149和151任一项所示氨基酸序列的TCRα链可变区；或者，所述TCR具有如SEQ ID NO：116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、 140、142、144、146、148、150和152任一项所示氨基酸序列的TCRβ链可变区。

MLLLLIPVLGMIFALRDARAQSVSQHNHHVILSEAASLELGCNYSYGGTVNLFWYVQYPGQHLQ LLLKYFSGDPLVKGIKGFEAEFIKSKFSFNLRKPSVQWSDTAEYFCAVNEGDDKIIFGKGTRLHILP(SEQ ID NO:115)。

MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPP ELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSSTAGGWNEQFFGPGTRLTVL(SEQ ID NO:116)。

MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQM ILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRSVPLNRDDKIIFGKGTRLHILP(SEQ IDNO:117)。

MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSKSGTGYQPQHFGDGTRLSIL (SEQ ID NO:118)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASAGNQFYFGTGTSLTVIP(SEQ IDNO:119)。

MGCRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWYKQDSKKFLK IMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASSRYIPGAYNEQFFGPGTRLTVL(SEQ IDNO:120)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEAVDSNYQLIWGAGTKLIIKP(SEQ IDNO:121)。

MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEF LTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLRQGPNYGYTFGSGTRLTVV(SEQ IDNO:122)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASDENEKLTFGTGTRLTIIP(SEQ IDNO:123)。

MSISLLCCAAFPLLWAGPVNAGVTQTPKFRILKIGQSMTLQCTQDMNHNYMYWYRQDPGMGLK LIYYSVGAGITDKGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLELAAPSQTSVYFCASKGGGTSGYEQFFGPGTRLTVL(SEQ ID NO:124)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSAMDSSYKLIFGSGTRLLVRP(SEQ IDNO:125)。

MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLR QIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSLRRGPFNEQFFGPGTRLTVL(SEQ ID NO:126)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAARTGDDKIIFGKGTRLHILP(SEQ IDNO:127)。

MGTRLFFYVALCLLWTGHMDAGITQSPRHKVTETGTPVTLRCHQTENHRYMYWYRQDPGHGLR LIHYSYGVKDTDKGEVSDGYSVSRSKTEDFLLTLESATSSQTSVYFCAINKQGFNQPQHFGDGTRLSIL(SEQ ID NO:128)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAMSMNRDDKIIFGKGTRLHILP(SEQID NO:129)。

MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPP ELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSRLPGLAGGTVVNEQFFGPGTRLTVL(SEQID NO:130)。

MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAAIQEYGNKLVFGAGTILRVKS(SEQ ID NO:131)。

MGPGLLCWVLLCLLVAGPVDAGVTQSPTHLIKTRGQHVTLRCSPISGHKSVSWYQQVLGQGPQFI FQYYEKEERGRGNFPDRFSARQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSPRTLFTGELFFGEGSRLTVL(SEQ ID NO:132)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEALNTGNQFYFGTGTSLTVIP(SEQ IDNO:133)。

MGCRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWYKQDSKKFLKIMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASSQVAYSPLHFGNGTRLTVT (SEQ ID NO:134)。

MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSP EALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAPKGSTLTFGKGTMLLVSP(SEQ ID NO:135)。

MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLR LIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSIGDSGISGKFFGPGTRLTVL(SEQ ID NO:136)。

MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQ FLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRRLMDSNYQLIWGAGTKLIIKP(SEQ IDNO:137)。

MGTSLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPE FLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFSAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYRCASSHGTSGSSHEQFFGPGTRLTVL(SEQ IDNO:138)。

MAFWLRSLGLHFRPHLGRRMESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYT NYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYLCALDGSGGGADGLTFGKGTHLIIQP(SEQ ID NO:139)。

MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPE FLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSPGRSGNTIYFGEGSWLTVV(SEQ ID NO:140)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASPEYNNNDMRFGAGTRLTVKP(SEQID NO:141)。

MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLK FMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSRTLGTSGNTQYFGPGTRLTVL(SEQ IDNO:142)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASEAGGNEKLTFGTGTRLTIIP(SEQID NO:143)。

MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAP KLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSREQAGQPQHFGDGTRLSIL(SEQ ID NO:144)。

MAFWLRSLGLHFRPHLGRRMESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYT NYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYLCALWDFNKFYFGSGTKLNVKP(SEQ ID NO:145)。

MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLR QIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSPYSGGQGETQYFGPGTRLLVL(SEQ IDNO:146)。

MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQ FLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVKRDSNYQLIWGAGTKLIIKP(SEQ ID NO:147)。

MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRL IYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSLTQDMGNTIYFGEGSWLTVV(SEQ ID NO:148)。

MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLS YNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVRDAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIP(SEQ ID NO:149)。

MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDTAGTGNGYTFGSGTRLTVV(SEQ ID NO:150)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEAYQGAQKLVFGQGTRLTINP(SEQ IDNO:151)。

MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFL IQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVGGTVQETQYFGPGTRLLVL(SEQ ID NO:152)。

根据本发明的实施例，所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR 具有如SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:121所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:122所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:123所示氨基酸序列的 TCRα链可变区和如SEQ ID NO:124所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:125所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:126所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:127所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:128所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:129所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQID NO:130所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:131所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:132所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR 具有如SEQ ID NO:133所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:134所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:136所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ IDNO:137所示氨基酸序列的 TCRα链可变区和如SEQ ID NO:138所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:139所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ IDNO:140所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:142所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:145所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR 具有如SEQ ID NO:147所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:148所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:149所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:150所示氨基酸序列的TCRβ链可变区；或者，所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:151所示氨基酸序列的TCRα链可变区和如SEQ ID NO:152所示氨基酸序列的TCRβ链可变区。

根据本发明的实施例，所述述分离的TCR进一步包括：TCRα链恒定区和/或TCRβ链恒定区。所述TCRα链恒定区或TCRβ链恒定区选自鼠源化恒定区或人源化恒定区。

根据本发明的实施例，所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:153所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:154所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:155所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:156所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:157所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:158所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:159所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:160所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR 具有如SEQ ID NO:161所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:162所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:163所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:164所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:165所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:166 所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:167所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:168所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:169所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:170所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:171所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:172所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:173所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:174所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:175所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:176所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:177所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:178所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:179所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:180所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:181所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:182所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:183所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:184所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ ID NO:185所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQID NO:186所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR 具有如SEQ ID NO:187所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:188所示氨基酸序列的TCRβ链；所述分离的TCR具有如SEQ IDNO:189所示氨基酸序列的TCRα链和如SEQ ID NO:190所示氨基酸序列的TCRβ链。

MLLLLIPVLGMIFALRDARAQSVSQHNHHVILSEAASLELGCNYSYGGTVNLFWYVQYPGQHLQ LLLKYFSGDPLVKGIKGFEAEFIKSKFSFNLRKPSVQWSDTAEYFCAVNEGDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFA CANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:153)。

MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPP ELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSSTAGGWNEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPA LNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:154)。

MACPGFLWALVISTCLEFSMAQTVTQSQPEMSVQEAETVTLSCTYDTSESDYYLFWYKQPPSRQM ILVIRQEAYKQQNATENRFSVNFQKAAKSFSLKISDSQLGDAAMYFCAYRSVPLNRDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWS NKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLR LWSS(SEQ ID NO:155)。

MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLR LIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSKSGTGYQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL NDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:156)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASAGNQFYFGTGTSLTV IPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRL WSS(SEQ ID NO:157)。

MGCRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWYKQDSKKFLK IMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASSRYIPGAYNEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL NDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:158)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEAVDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNK SDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:159)。

MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPISEHNRLYWYRQTLGQGPEFLTYFQNEAQLEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYLCASSLRQGPNYGYTFGSGTRLTV VEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTS VSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:160)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASDENEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWS NKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:161)。

MSISLLCCAAFPLLWAGPVNAGVTQTPKFRILKIGQSMTLQCTQDMNHNYMYWYRQDPGMGLK LIYYSVGAGITDKGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLELAAPSQTSVYFCASKGGGTSGYEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPA LNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:162)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSAMDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNK SDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:163)。

MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLR QIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSLRRGPFNEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL NDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:164)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAARTGDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWS NKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:165)。

MGTRLFFYVALCLLWTGHMDAGITQSPRHKVTETGTPVTLRCHQTENHRYMYWYRQDPGHGLR LIHYSYGVKDTDKGEVSDGYSVSRSKTEDFLLTLESATSSQTSVYFCAINKQGFNQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALN DSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:166)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAAMSMNRDDKIIFGKGTRLHILPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAV AWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:167)。

MGCRLLCCAVLCLLGAVPIDTEVTQTPKHLVMGMTNKKSLKCEQHMGHRAMYWYKQKAKKPP ELMFVYSYEKLSINESVPSRFSPECPNSSLLNLHLHALQPEDSALYLCASSRLPGLAGGTVVNEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPL KEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:168)。

MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASNYFPWYKQELGKRPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYFCAAIQEYGNKLVFGAGTILRVKSYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACA NAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQID NO:169)。

MGPGLLCWVLLCLLVAGPVDAGVTQSPTHLIKTRGQHVTLRCSPISGHKSVSWYQQVLGQGPQFIFQYYEKEERGRGNFPDRFSARQFPNYSSELNVNALLLGDSALYLCASSPRTLFTGELFFGEGSRLTVLE DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVS YQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:170)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEALNTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNK SDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:171)。

MGCRLLCCVVFCLLQAGPLDTAVSQTPKYLVTQMGNDKSIKCEQNLGHDTMYWYKQDSKKFLK IMFSYNNKELIINETVPNRFSPKSPDKAHLNLHINSLELGDSAVYFCASSQVAYSPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALND SRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:172)。

MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSSNFYALHWYRWETAKSP EALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPEDSATYLCAPKGSTLTFGKGTMLLVSPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFA CANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:173)。

MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLR LIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSIGDSGISGKFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALN DSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:174)。

MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQ FLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRRLMDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:175)。

MGTSLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVTKRGQDVALRCDPISGHVSLYWYRQALGQGPE FLTYFNYEAQQDKSGLPNDRFSAERPEGSISTLTIQRTEQRDSAMYRCASSHGTSGSSHEQFFGPGTRLTVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP ALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:176)。

MAFWLRSLGLHFRPHLGRRMESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYT NYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYLCALDGSGGGADGLTFGKGTHLIIQPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVL DMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:177)。

MGTRLLCWVVLGFLGTDHTGAGVSQSPRYKVAKRGQDVALRCDPISGHVSLFWYQQALGQGPE FLTYFQNEAQLDKSGLPSDRFFAERPEGSVSTLKIQRTQQEDSAVYLCASSPGRSGNTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL NDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSV SYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:178)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASPEYNNNDMRFGAGTRLTVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVA WSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:179)。

MDTRVLCCAVICLLGAGLSNAGVMQNPRHLVRRRGQEARLRCSPMKGHSHVYWYRQLPEEGLK FMVYLQKENIIDESGMPKERFSAEFPKEGPSILRIQQVVRGDSAAYFCASSRTLGTSGNTQYFGPGTRLT VLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFT SVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:180)。

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYFCAASEAGGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVA WSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:181)。

MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNHNVMYWYQQKSSQAP KLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLGDAAMYLCATSREQAGQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP ALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFT SVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:182)。

MAFWLRSLGLHFRPHLGRRMESFLGGVLLILWLQVDWVKSQKIEQNSEALNIQEGKTATLTCNYT NYSPAYLQWYRQDPGRGPVFLLLIRENEKEKRKERLKVTFDTTLKQSLFHITASQPADSATYLCALWDF NKFYFGSGTKLNVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILL LKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQID NO:183)。

MGPQLLGYVVLCLLGAGPLEAQVTQNPRYLITVTGKKLTVTCSQNMNHEYMSWYRQDPGLGLR QIYYSMNVEVTDKGDVPEGYKVSRKEKRNFPLILESPSPNQTSLYFCASSPYSGGQGETQYFGPGTRLLVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQP ALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:184)。

MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQ FLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVKRDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKS DFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWS S(SEQ ID NO:185)。

MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRL IYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSLTQDMGNTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPAL NDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:186)。

MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNGLFWYQQHAGEAPTFLS YNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYLCAVRDAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKS DFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:187)。

MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSRVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFWYRQFPKKSLMLMATSN EGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFYICSARDTAGTGNGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALNDSR YCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQ GVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:188)。

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTTYYLFWYKQPPSGEL VFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSAVYFCALSEAYQGAQKLVFGQGTRLTINPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKCVLDMRSMDFKSNSAVAWSN KSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS(SEQ ID NO:189)。

MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFL IQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVGGTVQETQYFGPGTRLLVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVCTDPQPLKEQPALN DSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF(SEQ ID NO:190)。

根据本发明的实施例，所述分离的TCR是通过前述的方法获得的。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对筛选TCR的方法所描述的特征和优点，同样适用于该分离的TCR，在此不再赘述。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种上述分离的TCR的筛选方法。根据本发明的实施例，所述分离的TCR是通过前述的方法筛选获得的。根据本发明实施例的方法筛选得到的分离的TCR对具有相当激活水平的突变抗原具有交叉反应性，能够识别和结合SARS-CoV-2变体，杀伤更多SARS-CoV-2 变体。在本发明的又一方面，本发明提出了一种分离的TCR。根据本发明的实施例，所述分离的TCR 是通过前述的方法获得的。根据本发明实施例的分离的TCR对具有相当激活水平的突变抗原具有交叉反应性，能够识别和结合SARS-CoV-2变体，杀伤更多SARS-CoV-2变体。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对筛选TCR的方法所描述的特征和优点，同样适用于该分离的TCR，在此不再赘述。

核酸分子、表达载体、重组细胞

在制备或者获取上述分离的TCR的过程中，可以利用表达分离的TCR的核酸分子，与不同的载体连接，然后在宿主细胞中表达，以获得表达分离的TCR的重组细胞。

为此，在本发明的又一方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的分离的TCR。

根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。

根据本发明的实施例，所述核酸分子包括选自SEQ ID NO:191-228中的至少之一或者与其中任意一序列具有至少80％-99％同一性的核苷酸序列或者其中任意一序列的至少一部分或其中任一序列的密码子优化序列。

所述SEQ ID NO:191用于编码SEQ ID NO:153。

所述SEQ ID NO:192用于编码SEQ ID NO:154。

所述SEQ ID NO:193用于编码SEQ ID NO:155。

所述SEQ ID NO:194用于编码SEQ ID NO:156。

所述SEQ ID NO:195用于编码SEQ ID NO:157。

所述SEQ ID NO:196用于编码SEQ ID NO:158。

所述SEQ ID NO:197用于编码SEQ ID NO:159。

所述SEQ ID NO:198用于编码SEQ ID NO:160。

所述SEQ ID NO:199用于编码SEQ ID NO:161。

所述SEQ ID NO:200用于编码SEQ ID NO:162。

所述SEQ ID NO:201用于编码SEQ ID NO:163。

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所述SEQ ID NO:226用于编码SEQ ID NO:188。

所述SEQ ID NO:227用于编码SEQ ID NO:189。

所述SEQ ID NO:228用于编码SEQ ID NO:190。

ATGCTCCTGTTGCTCATACCAGTGCTGGGGATGATTTTTGCCCTGAGAGATGCCAGAGCCCAGT CTGTGAGCCAGCATAACCACCACGTAATTCTCTCTGAAGCAGCCTCACTGGAGTTGGGATGCAACTATTCCTATGGTGGAACTGTTAATCTCTTCTGGTATGTCCAGTACCCTGGTCAACACCTTCAGCTTCTC CTCAAGTACTTTTCAGGGGATCCACTGGTTAAAGGCATCAAGGGCTTTGAGGCTGAATTTATAAAGAGTAAATTCTCCTTTAATCTGAGGAAACCCTCTGTGCAGTGGAGTGACACAGCTGAGTACTTCTGT GCCGTGAATGAAGGAGATGACAAGATCATCTTTGGAAAAGGGACACGACTTCATATTCTCCCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGC CTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACT TTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCAT GACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQID NO:191)。

ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCTGTGCGGTTCTCTGTCTCCTGGGAGCAGTTCCCATAGACACT GAAGTTACCCAGACACCAAAACACCTGGTCATGGGAATGACAAATAAGAAGTCTTTGAAATGTGAACAACATATGGGGCACAGGGCTATGTATTGGTACAAGCAGAAAGCTAAGAAGCCACCGGAGCTCAT GTTTGTCTACAGCTATGAGAAACTCTCTATAAATGAAAGTGTGCCAAGTCGCTTCTCACCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTGCAGCCAGAAGACTCAGCCCTGTATCTC TGCGCCAGCAGCTCGACAGCGGGGGGGTGGAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCA CCGTGCTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGC CACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTA GAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGG TCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:192)。

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ATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACACCGTGGATGGT GGAATCACTCAGTCCCCGAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGAT CTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCT CTGTGCCAGTAGTAAATCCGGGACAGGGTATCAGCCCCAGCATTTTGGTGATGGGACTCGACTCTCCATCCTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAG AGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCC TCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAAT GACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGA GATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:194)。

ATGGCCATGCTCCTGGGGGCATCAGTGCTGATTCTGTGGCTTCAGCCAGACTGGGTAAACAGT CAACAGAAGAATGATGACCAGCAAGTTAAGCAAAATTCACCATCCCTGAGCGTCCAGGAAGGAAGAATTTCTATTCTGAACTGTGACTATACTAACAGCATGTTTGATTATTTCCTATGGTACAAAAAATACCC TGCTGAAGGTCCTACATTCCTGATATCTATAAGTTCCATTAAGGATAAAAATGAAGATGGAAGATTCACTGTTTTCTTAAACAAAAGTGCCAAGCACCTCTCTCTGCACATTGTGCCCTCCCAGCCTGGAGAC TCTGCAGTGTACTTCTGTGCAGCAAGCGCGGGTAACCAGTTCTATTTTGGGACAGGGACAAGTTTGACGGTCATTCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGA TACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQ ID NO:195)。

ATGGGCTGCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGTCTTCTGCCTCCTCCAAGCAGGTCCCTTGGACACA GCTGTTTCCCAGACTCCAAAATACCTGGTCACACAGATGGGAAACGACAAGTCCATTAAATGTGAACAAAATCTGGGCCATGATACTATGTATTGGTATAAACAGGACTCTAAGAAATTTCTGAAGATAATGTT TAGCTACAATAATAAGGAGCTCATTATAAATGAAACAGTTCCAAATCGCTTCTCACCTAAATCTCCA GACAAAGCTCACTTAAATCTTCACATCAATTCCCTGGAGCTTGGTGACTCTGCTGTGTATTTCTGTGCCAGCAGCCGCTACATCCCGGGAGCTTACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACC GTGCTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCT CAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATG ACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGA TCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:196)。

ATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAGGGCAGTCATAGCCTCCATCTGTGTTGTATCCAGCATGGCTC AGAAGGTAACTCAAGCGCAGACTGAAATTTCTGTGGTGGAGAAGGAGGATGTGACCTTGGACTGTGTGTATGAAACCCGTGATACTACTTATTACTTATTCTGGTACAAGCAACCACCAAGTGGAGAATTGG TTTTCCTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATAC TTCTGTGCTCTGAGTGAGGCGGTGGATAGCAACTATCAGTTAATCTGGGGCGCTGGGACCAAGCTAATTATAAAGCCAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTG ACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGA TACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQ ID NO:197)。

ATGGGCACCAGCCTCCTCTGCTGGATGGCCCTGTGTCTCCTGGGGGCAGATCACGCAGATACT GGAGTCTCCCAGGACCCCAGACACAAGATCACAAAGAGGGGACAGAATGTAACTTTCAGGTGTGATCCAATTTCTGAACACAACCGCCTTTATTGGTACCGACAGACCCTGGGGCAGGGCCCAGAGTTTCT GACTTACTTCCAGAATGAAGCTCAACTAGAAAAATCAAGGCTGCTCAGTGATCGGTTCTCTGCAGAGAGGCCTAAGGGATCTTTCTCCACCTTGGAGATCCAGCGCACAGAGCAGGGGGACTCGGCCATGTA TCTCTGTGCCAGCAGCTTGCGACAGGGACCTAACTATGGCTACACCTTCGGTTCGGGGACCAGGTTAACCGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAG CAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCAC GTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCG GCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAG AATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTAT GAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:198)。

ATGGCCATGCTCCTGGGGGCATCAGTGCTGATTCTGTGGCTTCAGCCAGACTGGGTAAACAGT CAACAGAAGAATGATGACCAGCAAGTTAAGCAAAATTCACCATCCCTGAGCGTCCAGGAAGGAAGAATTTCTATTCTGAACTGTGACTATACTAACAGCATGTTTGATTATTTCCTATGGTACAAAAAATACCC TGCTGAAGGTCCTACATTCCTGATATCTATAAGTTCCATTAAGGATAAAAATGAAGATGGAAGATTC ACTGTTTTCTTAAACAAAAGTGCCAAGCACCTCTCTCTGCACATTGTGCCCTCCCAGCCTGGAGAC TCTGCAGTGTACTTCTGTGCAGCAAGCGATGAAAATGAGAAATTAACCTTTGGGACTGGAACAAGACTCACCATCATACCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCA GTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCT GTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAAC AGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQ ID NO:199)。

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ATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAGGGCAGTCATAGCCTCCATCTGTGTTGTATCCAGCATGGCTC AGAAGGTAACTCAAGCGCAGACTGAAATTTCTGTGGTGGAGAAGGAGGATGTGACCTTGGACTGTGTGTATGAAACCCGTGATACTACTTATTACTTATTCTGGTACAAGCAACCACCAAGTGGAGAATTGG TTTTCCTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTCCAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATAC TTCTGTGCTCTGAGTGCGATGGATAGCAGCTATAAATTGATCTTCGGGAGTGGGACCAGACTGCTGGTCAGGCCTGATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTGACA AGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGT GTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACAC CTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTT TAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQ ID NO:201)。

ATGGGCCCCCAGCTCCTTGGCTATGTGGTCCTTTGCCTTCTAGGAGCAGGCCCCCTGGAAGCC CAAGTGACCCAGAACCCAAGATACCTCATCACAGTGACTGGAAAGAAGTTAACAGTGACTTGTTCTCAGAATATGAACCATGAGTATATGTCCTGGTATCGACAAGACCCAGGGCTGGGCTTAAGGCAGATC TACTATTCAATGAATGTTGAGGTGACTGATAAGGGAGATGTTCCTGAAGGGTACAAAGTCTCTCGAAAAGAGAAGAGGAATTTCCCCCTGATCCTGGAGTCGCCCAGCCCCAACCAGACCTCTCTGTACTTC TGTGCCAGCAGTTTAAGGAGGGGGCCATTCAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAG AGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCC TCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAAT GACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGA GATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:202)。

ATGGCCATGCTCCTGGGGGCATCAGTGCTGATTCTGTGGCTTCAGCCAGACTGGGTAAACAGT CAACAGAAGAATGATGACCAGCAAGTTAAGCAAAATTCACCATCCCTGAGCGTCCAGGAAGGAAGAATTTCTATTCTGAACTGTGACTATACTAACAGCATGTTTGATTATTTCCTATGGTACAAAAAATACCC TGCTGAAGGTCCTACATTCCTGATATCTATAAGTTCCATTAAGGATAAAAATGAAGATGGAAGATTCACTGTTTTCTTAAACAAAAGTGCCAAGCACCTCTCTCTGCACATTGTGCCCTCCCAGCCTGGAGACTCTGCAGTGTACTTCTGTGCAGCGAGGACCGGAGATGACAAGATCATCTTTGGAAAAGGGACACG ACTTCATATTCTCCCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTC TGATGTGTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAA GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGC CGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQ ID NO:203)。

ATGGGCACAAGGTTGTTCTTCTATGTGGCCCTTTGTCTCCTGTGGACAGGACACATGGATGCTG GAATCACCCAGAGCCCAAGACACAAGGTCACAGAGACAGGAACACCAGTGACTCTGAGATGTCATCAGACTGAGAACCACCGCTATATGTACTGGTATCGACAAGACCCGGGGCATGGGCTGAGGCTGATC CATTACTCATATGGTGTTAAAGATACTGACAAAGGAGAAGTCTCAGATGGCTATAGTGTCTCTAGATCAAAGACAGAGGATTTCCTCCTCACTCTGGAGTCCGCTACCAGCTCCCAGACATCTGTGTACTTCT GTGCCATCAACAAACAGGGGTTCAATCAGCCCCAGCATTTTGGTGATGGGACTCGACTCTCCATCC TAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCT GAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTC TGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAG ACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAG AAAGGATTTC(SEQ ID NO:204)。

ATGGCCATGCTCCTGGGGGCATCAGTGCTGATTCTGTGGCTTCAGCCAGACTGGGTAAACAGT CAACAGAAGAATGATGACCAGCAAGTTAAGCAAAATTCACCATCCCTGAGCGTCCAGGAAGGAAG AATTTCTATTCTGAACTGTGACTATACTAACAGCATGTTTGATTATTTCCTATGGTACAAAAAATACCCTGCTGAAGGTCCTACATTCCTGATATCTATAAGTTCCATTAAGGATAAAAATGAAGATGGAAGATTC ACTGTTTTCTTAAACAAAAGTGCCAAGCACCTCTCTCTGCACATTGTGCCCTCCCAGCCTGGAGACTCTGCAGTGTACTTCTGTGCAGCAATGAGTATGAACAGAGATGACAAGATCATCTTTGGAAAAGGG ACACGACTTCATATTCTCCCCAATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAA GGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATT CCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAA AGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQ ID NO:205)。

ATGGGCTGCAGGCTGCTCTGCTGTGCGGTTCTCTGTCTCCTGGGAGCAGTTCCCATAGACACT GAAGTTACCCAGACACCAAAACACCTGGTCATGGGAATGACAAATAAGAAGTCTTTGAAATGTGAACAACATATGGGGCACAGGGCTATGTATTGGTACAAGCAGAAAGCTAAGAAGCCACCGGAGCTCAT GTTTGTCTACAGCTATGAGAAACTCTCTATAAATGAAAGTGTGCCAAGTCGCTTCTCACCTGAATGCCCCAACAGCTCTCTCTTAAACCTTCACCTACACGCCCTGCAGCCAGAAGACTCAGCCCTGTATCTC TGCGCCAGCAGCCGTCTACCGGGACTAGCGGGGGGTACCGTAGTCAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCG AACCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTC TTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCC TGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCC ACCATCCTCTATGAGATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:206)。

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ATGGGAATCAGGCTCCTCTGTCGTGTGGCCTTTTGTTTCCTGGCTGTAGGCCTCGTAGATGTGA AAGTAACCCAGAGCTCGAGATATCTAGTCAAAAGGACGGGAGAGAAAGTTTTTCTGGAATGTGTCCAGGATATGGACCATGAAAATATGTTCTGGTATCGACAAGACCCAGGTCTGGGGCTACGGCTGATCTA TTTCTCATATGATGTTAAAATGAAAGAAAAAGGAGATATTCCTGAGGGGTACAGTGTCTCTAGAGAGAAGAAGGAGCGCTTCTCCCTGATTCTGGAGTCCGCCAGCACCAACCAGACATCTATGTACCTCTG TGCCAGCAGTCTGACACAGGATATGGGAAACACCATATATTTTGGAGAGGGAAGTTGGCTCACTGT TGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAG CTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCTCA AGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGAC GAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATC CTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:224)。

ATGTGGGGAGTTTTCCTTCTTTATGTTTCCATGAAGATGGGAGGCACTACAGGACAAAACATTG ACCAGCCCACTGAGATGACAGCTACGGAAGGTGCCATTGTCCAGATCAACTGCACGTACCAGACATCTGGGTTCAACGGGCTGTTCTGGTACCAGCAACATGCTGGCGAAGCACCTACATTTCTGTCTTACA ATGTTCTGGATGGTTTGGAGGAGAAAGGTCGTTTTTCTTCATTCCTTAGTCGGTCTAAAGGGTACAGTTACCTCCTTTTGAAGGAGCTCCAGATGAAAGACTCTGCCTCTTACCTCTGTGCTGTGAGGGACGC ATACTCTGGGGCTGGGAGTTACCAACTCACTTTCGGGAAGGGGACCAAACTCTCGGTCATACCAAA TATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGA CAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAG CCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCAT GACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQID NO:225)。

ATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCTGGGGCCAGGCTCCGGGCTTGGTGCTGTCGTCTCTCAACATC CGAGCAGGGTTATCTGTAAGAGTGGAACCTCTGTGAAGATCGAGTGCCGTTCCCTGGACTTTCAGGCCACAACTATGTTTTGGTATCGTCAGTTCCCGAAAAAGAGTCTCATGCTGATGGCAACTTCCAATGA GGGCTCCAAGGCCACATACGAGCAAGGCGTCGAGAAGGACAAGTTTCTCATCAACCATGCAAGCCTGACCTTGTCCACTCTGACAGTGACCAGTGCCCATCCTGAAGACAGCAGCTTCTACATCTGCAGTG CTAGAGACACCGCCGGGACAGGGAACGGCTACACCTTCGGTTCGGGGACCAGGTTAACCGTTGTAGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAGAGATCTC CCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGA GCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAATGACGAGT GGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGAGATCCTGC TAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:226)。

ATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAGGGCAGTCATAGCCTCCATCTGTGTTGTATCCAGCATGGCTC AGAAGGTAACTCAAGCGCAGACTGAAATTTCTGTGGTGGAGAAGGAGGATGTGACCTTGGACTGTGTGTATGAAACCCGTGATACTACTTATTACTTATTCTGGTACAAGCAACCACCAAGTGGAGAATTGGTTTTCCTTATTCGTCGGAACTCTTTTGATGAGCAAAATGAAATAAGTGGTCGGTATTCTTGGAACTTC CAGAAATCCACCAGTTCCTTCAACTTCACCATCACAGCCTCACAAGTCGTGGACTCAGCAGTATACTTCTGTGCTCTGAGTGAGGCCTATCAGGGAGCCCAGAAGCTGGTATTTGGCCAAGGAACCAGGCTG ACTATCAACCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCTGTCTATCAACTCCGGGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGA TGTGTATATCACAGACAAATGTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGA CACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCTGTGATGTCAAGCTGGTCGAGAAAAGCTTTGAAACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGG GTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGC(SEQ ID NO:227)。

ATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCTGTGTGGCCTTTTGTCTCCTGGGAGCAGGCCCAGTGGATTCT GGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCT CATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTC TGTGCCAGCAGCGTAGGAGGGACAGTCCAAGAGACCCAGTACTTCGGGCCAGGCACGCGGCTCCT GGTGCTCGAGGACCTGAACAAGGTGTTCCCACCCGAAGTGGCCGTCTTCGAACCATCAGAAGCAGAGATCTCCCACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGGCTTCTTCCCCGACCACGTG GAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCTGCACAGACCCGCAGCCCCTCAAGGAGCAGCCCGCCCTCAATGACTCCAGATACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCGGCC ACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGGCTCTCGGAGAAT GACGAGTGGACCCAGGATAGGGCCAAACCCGTCACCCAGATCGTCAGCGCCGAGGCCTGGGGTAGAGCAGACTGTGGCTTTACCTCGGTGTCCTACCAGCAAGGGGTCCTGTCTGCCACCATCCTCTATGA GATCCTGCTAGGGAAGGCCACCCTGTATGCTGTGCTGGTCAGCGCCCTTGTGTTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAGGATTTC(SEQ ID NO:228)。

在本发明的又一方面，本发明还提供了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带上述分离的核酸分子。在将上述核酸分子连接到表达载体上时，可以将核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于表达载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于表达载体本身。当然，核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。

本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得表达载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。

根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。

根据本发明的实施例，所述表达载体为慢病毒载体。

在本发明的又一方面，本发明还提供了一种重组细胞。根据本发明的实施例，该重组细胞携带前述的分离的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的分离的TCR。可以将表达载体导入到宿主细胞中，构建获得表达前述分离的TCR的重组细胞，该重组细胞能够特异性识别预定抗原肽，对携带所述抗原肽的抗原生物的识别能够更强。

根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前述述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。

根据本发明的实施例，所述宿主细胞包括淋巴细胞。

示例性地，宿主细胞包括但不限于T细胞、NK细胞。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对分离的TCR所描述的特征和优点，同样适用于该核酸分子、表达载体和重组细胞，在此不再赘述。

药物组合物

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前述的分离的TCR、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞。发明人经过大量实验发现，上述药物组合物可有效地预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病。

根据本发明的实施例，进一步包括药学上可接受的辅料。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对分离的TCR、核酸分子、表达载体和重组细胞所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。

用途

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的分离的TCR、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或前述的药物组合物在制备药物中用途，所述药物用于预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或预防和/或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对分离的TCR、核酸分子、表达载体、重组细胞和药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。

预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的相关疾病的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的相关疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：向受试者施用药学上可接受量的前述的药物组合物。根据本发明的实施例，该方法可有效预防和/或治疗新型冠状病毒感染和/或新型冠状病毒引起的相关疾病。

根据本发明的实施例，所述方法的给药途径采用静脉注射。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对药物组合物所描述的特征和优点，同样适用于该方法，在此不再赘述。

抗原表位肽

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗原表位肽。根据本发明的实施例，所述抗原表位肽包括具有SEQ ID NO:229～256所示的氨基酸序列中的至少之一。发明人经过实验得到上述在新型冠状病毒与其他冠状病毒(例如MERS-CoV、HKU1-CoV、OC43-CoV、NL63-CoV和h229E-CoV等)中保守存在的抗原表位肽；并且经过实验发现，采用表达上述的抗原表位肽的细胞体外刺激T细胞，以得到能特异性识别冠状病毒的TCR。该TCR具有交叉反应活性，可识别多种抗原表位肽及其突变体，能够快速应对冠状病毒突变株的变化。

根据本发明的实施例，所述抗原表位肽包括具有SEQ ID NO:250、SEQ ID NO:252和SEQ ID NO:254 所示的氨基酸序列中的至少之一。

核酸分子、表达载体和重组细胞

在本发明的又一方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码前述的抗原表位肽。

根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，携带前述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到表达载体上时，可以将核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于表达载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于表达载体本身。当然，核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。

本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得表达载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。

根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体。

根据本发明的实施例，所述表达载体为慢病毒载体。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，包括：携带前述的核酸分子或前述的表达载体；或，表达前述的抗原表位肽。可以将表达载体导入到宿主细胞中，构建获得表达前述抗原表位肽的重组细胞，该重组细胞表达抗原表位肽。

根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。

根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。

抗原

在本发明的又一方面，本发明提出了一种抗原。根据本发明的实施例，所述抗原包括前述的抗原表位多肽。采用表达上述的抗原的重组细胞体外刺激T细胞，以得到能特异性识别冠状病毒的TCR。该 TCR具有交叉反应活性，可识别多种抗原表位肽及其突变体，能够快速应对冠状病毒突变株的变化。

药物组合物

在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前述的抗原表位多肽。根据本发明的药物组合物可预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病，例如新冠疫苗，新冠疫苗可诱导产生新冠病毒特异的T细胞免疫反应，表现出良好的免疫原性和免疫效果。

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括载体，所述抗原表位多肽和载体相连。

根据本发明的实施例，所述药物组合物选自新冠疫苗。

根据本发明的实施例，所述新冠疫苗选自多肽疫苗。

用途

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的抗原表位肽、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在制备药物中的用途，所述药物用于预防新型冠状病毒感染或治疗新型冠状病毒引起的相关疾病。

根据本发明的实施例，所述药物选自新冠疫苗。

根据本发明的实施例，所述新冠疫苗选自多肽疫苗。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种前述的抗原表位肽、前述的核酸分子、前述的表达载体或前述的重组细胞在筛选特异性识别新型冠状病毒的TCR中的用途。采用表达上述的抗原表位肽的重组细胞体外刺激T细胞，以得到能特异性识别冠状病毒的TCR。该TCR具有交叉反应活性，可识别多种抗原表位肽及其突变体，能够快速应对冠状病毒突变株的变化。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：TCR的筛选

1、预测新冠抗原

预测SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HKU1-CoV、OC43-CoV、NL63-CoV和h229E-CoV 共七种冠状病毒间保守的抗原表位肽，结果如图1所示，其中，大部分的抗原表位肽是不保守的， SARS-COV-2的抗原表位是独有的。

首先从GISAID下载SARS-CoV-2WIV04等的蛋白质组，将具有8-11个氨基酸的所有可能的抗原表位肽列举为候选库。将成对的抗原表位肽和HLA等位基因输入到MHC呈递抗原预测软件中，以预测抗原表位肽呈递的概率，筛选出与HLA*A-11:01亲和力高，并且冠状病毒间保守的抗原表位肽，共 28个抗原表位肽(SEQ ID NO:229～256)。

2、构建表达TMG的K562细胞系

将上述筛选的抗原表位肽串联合成了编码8到11个表位的串联小基因，每个抗原表位肽在每侧包括一个5个氨基酸的侧翼序列，总共构建了三个HLA*A-11:01特异性串联小基因：TMG1(包含氨基酸序列如SEQ ID NO:229～237所示的抗原表位肽)、TMG2(包含氨基酸序列如SEQ ID NO:238～247所示的抗原表位肽)和TMG3(包含氨基酸序列如SEQ ID NO:248～256所示的抗原表位肽)。将串联小基因构建到具有嘌呤霉素选择标记的慢病毒质粒pHAGE骨架上，构建方式用本领域常规的Gibson克隆方法。发明人分别将上述构建的含有编码抗原表位肽的TMG1、TMG2和TMG3的慢病毒质粒pHAGE过表达至K562-HLA*A-11:01细胞系(简称K562细胞)，然后用嘌呤霉素药物筛选筛选阳性细胞7天。

采用上述方法制备不表达抗原表位肽、但表达相同HLA型(HLA*A-11:01)的K562细胞(简称第一阴性细胞)，区别仅在于，构建的串联小基因中不含有抗原表位肽。

其中，TMG1的核苷酸序列如下所示：

ATGGATGTAGAAAACCCTCACCTTATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGATAGAGCCATGAAAC CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGCCACAACTGCTTATGCTAATAGTGTTTTTAAGTCAGTTCTTTATTATCAAAACAATGTTTTTATGTCTGAAGCAAAATGTTGGACTGAGACTAAAGGACCTCATGAATTT TGCTCTCAACATACAATGCTAGTTAAACAGGGTGATGATTATATTGAACGGTTCGTGTCTTTAGCTAT AGATGCTTACCCACTTACTAAACATCCTAATCAGGAGACAGCTTGCTCTCATGCCGCTGTTGATGCACTATGTGAGAAGGCATTAAAATATTTGGCTGAAATTGTTGACACTGTGAGTGCTTTGGTTTATGATAA TAAGCTTAAAGCACATAAAGACAAAGTACCCTATAATATGAGAGTTATACATTTTGGTGCTGGTTCTGATAAAGGAGTTGCACCAGGTTTTATACAACAAAAGCTAGCTCTTGGAGGTTCCGTGGCTATAAAG ATAACAGAACATTCTACCGGTTATCCGTACGACGTGCCTGATTATGCCTGA(SEQ ID NO:257)。

TMG2的核苷酸序列如下所示：

ATGAATTCTAGAATTAAAGCATCTATGCCGACTACTATAGCAAAGAATACTGTTAAGAGTGCTAT GGTTAGAATGTACATCTTCTTTGCATCATTTTATTATGTATGGAAAAGTTATCCACCTTGTAGGTTTGT TACAGACACACCTAAAGGTCCTAAAGTGAAGTATTTATACTTATTCTCTACAGTGTTCCCACCTACAAGTTTTGGACCACTAGTGAGAAAAATATTTAAATGGGGTAAGGCTAGACTTTATTATGATTCAATGA GTTATGAGGATCAAGATGCAGCCGCCACTAGAGGAGCTACTGTAGTAATTGGAACAAGCAAATTCTATGGTGGTTGGTGTACTGAAAGACTCAAGCTTTTTGCAGCAGAAACGCTCAAAGCTACTGAGGAG ACAGACTATGGTGATGCTGTTGTTTACCGAGGTACAACAACTTACAAATTAAATGTTGGTATCTCAGATGAGTTTTCTAGCAATGTTGCAAATTATCAAAAGGTTGGTATGCAAAAGCAAGCGTGGCAACCGG GTGTTGCTATGCCTAATCTTTACAAAATGCAAAGAATGCTAACCGGTTATCCGTACGACGTGCCTGATTATGCCTGA(SEQ ID NO:258)。

TMG3的核苷酸序列如下所示：

ATGAAAGAAATCACTGTTGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTGGGAGCTTCGCAGG GTAAAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACCGGGAGCAGAGGCG GCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGCAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGT TCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACG CTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTACCGGTTATCCGTACGACGTGCCTGATTATGCCTGA(SEQ ID NO:259)。

3、分离PBMC

收集18个COVID-19康复供体的10ml血样，共18个样本进行后续实验。将收集的血样保存在乙二胺四乙酸(EDTA)管中，并在16小时内采用GE Ficoll-Paque分离液(简称Ficoil)分离出PBMC。将分离的PBMC冷冻保存并储存在液氮中，直到用于分析。

具体操作步骤：

1)将10ml外周血，转移到50ml离心管中，PBS缓冲液稀释至25ml(外周血：PBS的体积比＝1:1.5)；

2)取15ml Ficoil(GE,17-1440-02)置于50ml离心管中，将步骤1)得到的PBS缓冲液稀释的外周血缓慢铺在Ficoil上层(Ficoil:稀释外周血的体积比＝3:5)；

3)将步骤2)得到的混合液在室温break off模式下(离心机升降速调为0)800×g离心30min；

4)将步骤3)得到的离心产物去掉上层血浆，吸取单核细胞层(中间白膜层)，尽量避免吸取血小板；

5)在步骤4)的单核细胞层中补加PBS缓冲液至40ml，在4℃、600×g条件下离心5min，弃去上清；

6)用40ml PBS缓冲液再次洗涤步骤5)得到的产物，以降低单核细胞混合液中的血小板含量，得到外周血单个核细胞(简称PBMC细胞或PBMC)；

7)使用PBMC冻存液重悬细胞，液氮罐里保存。使用时进行细胞复苏使用。

4、共培养(体外刺激)

1)取出冻存的PBMC细胞，37℃水浴锅中复苏，用培养基(RPMI 1640培养基+10％灭活Gibco 血清，无IL2)重悬，计数，调整密度至1-2×10

2)使用步骤2制备得到的K562细胞作为T细胞刺激的抗原，将K562细胞用10μg/ml丝裂霉素C (大连美伦生物技术有限公司)在37℃细胞培养箱中预处理2h。

3)用PBS培养基洗涤3次后，将表达TMG1、TMG2、TMG3的三种K562以1:1:1的比例混合(以下简称为混合的K562细胞)，然后对步骤3中得到的PBMC进行体外刺激，该组为实验组。同时，为了更好地筛选新冠抗原特异性刺激出的T细胞，本刺激实验同时设立阴性对照组(简称阴性对照)，该阴性对照组的体外刺激步骤与实验组的体外刺激步骤相同，区别仅在于用步骤2制备得到的第一阴性细胞替代步骤2的K562细胞对PBMC细胞进行刺激。具体操作如下：

首先按照PBMC和混合的K562细胞的初始细胞数比为30:1的比例加入到不含IL-2的培养基(RPMI 1640培养基(Life，C11875500BT)+10％灭活Gibco血清)中，在第5天和第7天分别补充适当的预处理 K562细胞。第10天，将上述的细胞转移至含有50IU/mL IL-2的培养基(RPMI 1640培养基+10％灭活 Gibco血清)中进行培养，并按照PBMC:混合的K562细胞的细胞数比为4:1的比例添加混合的K562 细胞，并在37℃的培养箱中培养5天(第15天)，期间根据细胞增殖情况进行1/2换液1-2次。在第 15天，将上述的细胞转移至不含50IU/mLIL-2的PBMC培养基中进行培养，并按照PBMC:混合的K562 细胞的细胞数比为4：1添加混合的K562细胞，以刺激扩增PBMC，得到含有TCR-T细胞的培养液。然后采用流式细胞术分别对其中两个样本(V3和V17)体外刺激第10d、第15d和第16d的细胞培养液进行分析，结果如图2所示，结果表明，在体外刺激过程中，与10day和第15day的相比，进行16day 再次刺激后，可获得更多的新冠抗原特异性T细胞，并且，实验组与阴性对照组的比例差别更大，结果显示实验组中可获得更多的新冠抗原特异性T细胞。因此，选择16day的时间点进行分选，更有可能获得新冠抗原特异性T细胞。

5、分选表达有41BB+的细胞

在步骤4中刺激后的第16天收集50μL全部的K562细胞体外刺激PBMC得到的T细胞和第一阴性细胞体外刺激PBMC得到的第二阴性细胞，并用流式细胞术进行分析。发明人以1100rpm离心5分钟收集细胞，并用抗人CD3-PB抗体(1:200，Biolegend)、抗人CD8-APC(1:200，Biolegend)、抗人 CD4-FITC(1:200,Biolegend)和anit-CD137-PE(1:200,Biolegend)在室温下放置30分钟，用PBS+1％FBS 洗涤并用Aria SORP流式细胞仪进行分选，数据通过FlowJ软件进行分析，筛选获得表达41BB+CD4+ 的分选细胞：表达41BB+CD8+的分选细胞：表达41BB-CD8+的分选细胞：表达41BB-CD4+的分选细胞。

6、单细胞测序

将步骤5得到的每个细胞样品分别避光在冰上用抗CD8(Cat#)、抗CD4(Cat#)和抗4-1BB(Cat#) 抗体染色15分钟。在荧光激活细胞分选(FACS)之前添加DAPI。使用Aria III(BD)进行单细胞分离。对 DAPI-CD3+门内的不同T细胞群进行分类，包括CD8+4-1BB+、CD8+4-1BB-、CD8-4-1BB+、CD8- 4-1BB-、CD4+4-1BB+、CD4+4-1BB-、CD4-4-1BB+和CD4-4-1BB-种群。根据表1混合每个样本(共检测了八个样本，即为V7、V10、V13、V14、V15、V16、V17和V20)的所有群体。并根据制造商的说明加载到10x Chromium单细胞5'免疫分析试剂盒(10xGenomics，Pleasanton)的一个通道中。加载的细胞数量在10,000到14,000之间。所有后续步骤均按照标准制造商的协议执行。通过具有150bp双末端读数的Illumina novaseq 6000测序仪分析基因表达和T细胞受体文库。

表1：单细胞测序的每个样本的分选配比

其中，V7_M_Q2和V7_M_other为V7样本的实验组，V7_NC为V7样本的阴性对照组，V10_M、V13_M、V14_M、V15_M、V16_V17_M和V20_M分别为各样本的实验组，V16_V17_M为V16和V17 两组混合在一起进行检测，NC1为样本V10、V14和V16阴性对照组的混合液，NC2为样本V13、V15、 V17和V20阴性对照组的混合液。实验组的细胞来源于K562细胞体外刺激PBMC得到的T细胞，阴性对照组的细胞来源于第二阴性细胞。

7、单细胞测序分析

使用Cell Ranger(版本6.1.2，10x Genomics)对GRCh38参考基因组处理10xscRNA测序数据的 FASTQ文件(含有步骤6得到的T细胞受体文库)。合并不同批次，去除UMI计数小于400、基因小于200或线粒体基因计数大于10％的细胞。在少于10个细胞中检测到的基因被过滤掉。过滤后的表达矩阵通过每个细胞的UMI总数进行归一化，并进行log2转换。Harmony 47应用于主成分分析(PCA)组件，以消除批次效应，以用于随后的均匀流形逼近和投影(UMAP)以及使用Leiden算法进行聚类。过滤掉没有TCRβ链信息的T细胞。MAGIC 48用于估算基因表达并对计数矩阵进行去噪以进行表达分析，具体参见图3。

实施例2：TCR-T细胞的构建

根据实施例1的单细胞TCR测序的结果，挑选了在激活的CD8细胞群体中挑取克隆扩增并且克隆占比高的31个TCR序列，首先合成了TCRα和TCRβ的DNA序列(由北京擎科生物科技有限公司合成)。使用Golden Gate克隆策略将合成的DNA序列基因克隆到慢病毒pHAGE-IRES-RFP载体中，格式为TCRβ-Cβ-P2A-TCRa-Ca。根据2X无缝克隆试剂盒(BeyotimeBiotechnology)方案操作。使用常规方法(如热转法或电转法)将连接产物转化到大肠杆菌Stabl3(biomed，BC118-01)中，最终得到 pHAGE-TCR载体。使用sanger测序法验证所得载体序列，该序列是正确的。

使用pHAGE-TCR载体和慢病毒包装质粒(psPAX2(addgene#12260)和pMD2.G(addgene#12259))，以本领域常规方法(如CN 201811155550.5中所示方法)进行病毒包装。

通过离心感染的方法，使用包装好的病毒感染Jurkat细胞。具体为，在32℃下，1500rpm离心感染 90分钟。

病毒感染后，通过流式分选表达红色荧光的被感染的Jurkat细胞，由此得到表达特定TCR的Jurkat 细胞。

其中，31个TCR序列的部分TCR序列如下所示：

TCR-01-1的氨基酸序列为SEQ ID NO：153所示的α链和SEQ ID NO：154所示的β链；核酸序列为 SEQ ID NO：191所示的α链和SEQ ID NO：192所示的β链。

TCR-03的氨基酸序列为SEQ ID NO：155所示的α链和SEQ ID NO：156所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO：193所示的α链和SEQ ID NO：194所示的β链。

TCR-07的氨基酸序列为SEQ ID NO：157所示的α链和SEQ ID NO：158所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO：195所示的α链和SEQ ID NO：196所示的β链。

TCR-08的氨基酸序列为SEQ ID NO：159所示的α链和SEQ ID NO：160所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:197所示的α链和SEQ ID NO:198所示的β链。

TCR-10的氨基酸序列为SEQ ID NO:161所示的α链和SEQ ID NO:162所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:199所示的α链和SEQ ID NO:200所示的β链。

TCR-16的氨基酸序列为SEQ ID NO:163所示的α链和SEQ ID NO:164所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:201所示的α链和SEQ ID NO:202所示的β链。

TCR-17的氨基酸序列为SEQ ID NO:165所示的α链和SEQ ID NO:166所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:203所示的α链和SEQ ID NO:204所示的β链。

TCR-19的氨基酸序列为SEQ ID NO:167所示的α链和SEQ ID NO:168所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:205所示的α链和SEQ ID NO:206所示的β链。

TCR-20的氨基酸序列为SEQ ID NO:169所示的α链和SEQ ID NO:170所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:207所示的α链和SEQ ID NO:208所示的β链。

TCR-22的氨基酸序列为SEQ ID NO:171所示的α链和SEQ ID NO:172所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:209所示的α链和SEQ ID NO:210所示的β链。

TCR-26的氨基酸序列为SEQ ID NO:173所示的α链和SEQ ID NO:174所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:211所示的α链和SEQ ID NO:212所示的β链。

TCR-29-1的氨基酸序列为SEQ ID NO:175所示的α链和SEQ ID NO:176所示的β链；核酸序列为 SEQ ID NO:213所示的α链和SEQ ID NO:214所示的β链。

TCR-18的氨基酸序列为SEQ ID NO:177所示的α链和SEQ ID NO:178所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:215所示的α链和SEQ ID NO:216所示的β链。

TCR-09的氨基酸序列为SEQ ID NO:179所示的α链和SEQ ID NO:180所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:217所示的α链和SEQ ID NO:218所示的β链。

TCR-24的氨基酸序列为SEQ ID NO:181所示的α链和SEQ ID NO:182所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:219所示的α链和SEQ ID NO:220所示的β链。

TCR-23-2的氨基酸序列为SEQ ID NO:183所示的α链和SEQ ID NO:184所示的β链；核酸序列为 SEQ ID NO:221所示的α链和SEQ ID NO:222所示的β链。

TCR-02的氨基酸序列为SEQ ID NO:185所示的α链和SEQ ID NO:186所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:223所示的α链和SEQ ID NO:224所示的β链。

TCR-12的氨基酸序列为SEQ ID NO:187所示的α链和SEQ ID NO:188所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:225所示的α链和SEQ ID NO:226所示的β链。

TCR-28的氨基酸序列为SEQ ID NO:189所示的α链和SEQ ID NO:190所示的β链；核酸序列为SEQ ID NO:227所示的α链和SEQ ID NO:228所示的β链。

实施例3：TCR-T细胞的功能验证

为了验证实施例2鉴定出的31个TCR是否可以识别目标的新冠抗原，发明人制备了表达EGFP和抗原表位肽的融合蛋白的含有HLA-A*1101的抗原呈递细胞K562细胞(简称K562细胞)，具体制备方法同实施例1的步骤2，具体参见图4。然后将实施例2得到的2x10

其中，19个TCR中的TCR-01-1、TCR-03、TCR-07、TCR-08、TCR-10、TCR-16、TCR-17、TCR-19、 TCR-20、TCR-22、TCR-26、TCR-29-1、TCR-18、TCR-09和TCR-24可识别AYKTFPPTEPKK抗原表位肽；TCR-23-2可识别QQQQGQTVTK抗原表位肽；TCR-02、TCR-12和TCR-28可识别ATEGALNTPK 抗原表位肽。

此外，发明人在实验过程中发现，从不同康复者体内筛选到的不同TCR序列，大多数对 AYKTFPPTEPKK这个抗原序列有反应，这表明该抗原可作为一个理想的T细胞抗原疫苗候选，这也进一步表面本发明的方法可以快速鉴定出人群中共有的新冠抗原表位。

实施例4：测试15个TCR对新冠抗原突变体(即为突变肽)的交叉反应活性

新冠病毒突变速度很快，存在如奥密克戎等突变株，为了同步评估鉴定的TCR的交叉反应活性，发明人将氨基酸序列为AYKTFPPTEPKK的抗原表位肽的不同氨基酸序列进行突变(具体突变参见图 7)，得到突变肽，并将突变肽构建了一系列K562细胞系(即为突变体)，构建的方式如单抗原的K562 细胞系一致，具体参见实施例1步骤2中，区别仅在于，用AYKTFPPTEPKK抗原表位肽替换串联小基因。然后将实施例2构建的15种Jurkat细胞分别与突变体混合培养，共培养后分析CD69的表达，以检测TCR对不同突变肽的交叉反应活性，具体步骤参见实施例3，15种Jurkat细胞具体的TCR及其检测结果如图7所示。结果发现，本发明筛选得到的部分TCR能够识别多个突变肽，包括分别在Lambda 和Beta新冠病毒变体的T366I和T362I的已知突变体。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。