高产DHA裂殖壶菌突变株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及高产DHA裂殖壶菌突变株及其应用。

背景技术

DHA(docosahexaenoic acid,22:6n-3,二十二碳六烯酸)俗称“脑黄金”“聪明因子”是Omega-3系列多不饱和脂肪酸，具有促进婴幼儿大脑和视网膜发育，提高记忆力，调节血脂，降血压、抗癌、抗炎等多种生理功能。作为人体不能合成但又不可缺少的重要必须脂肪酸，广泛应用于婴幼儿食品、保健品以及医药行业。

相比于鱼油提取的DHA鱼腥味重，存在重金属污染以及受限于海洋捕捞的问题，由微生物培养微藻，通过发酵工艺获得的含有DHA的藻油是目前工业生产的主要方式。

裂殖壶菌又称裂壶藻，属于网粘菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类异养型海洋真菌，可以在胞内积累大量脂质，是目前工业生产DHA的理想菌种。

目前通过大量的技术研究，如复合碳源、温度控制，通气量(溶氧控制)等，已将裂殖壶菌的DHA产量提升到一个相对客观的数值，已满足工业生产的需求。但由于裂壶藻在发酵过程中同时会产生大量的其他长链脂肪酸副产物，如棕榈酸(十六烷酸)，十八烷酸，油酸(十八碳一烯酸)，亚油酸(十八碳二烯酸)，亚麻酸(十八碳三烯酸)，EPA(二十碳四烯酸)，DPA(二十二碳五烯酸)等。虽然部分的副产物脂肪酸也是重要的不饱和脂肪酸，也具有一定的附加值。但这些脂肪酸对后续的DHA分离纯化带来了较大的困难，尤其是DPA作为DHA合成的前体物质，占比高，分离及其困难。这一因素导致高纯度的DHA价格非常昂贵。因此，使用裂殖壶菌发酵生产DHA藻油的副产物控制也是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

由于目前DHA的分离纯化较为困难，大量的厂商直接使用含有DHA的藻油作为原料进行添加，所以大量的研究和技术专注于提高裂殖壶菌发酵的单位产量，从而减少藻油在商品中的添加量。但这样的行为对商品(特别使食品药品)的安全带来一定的风险，而且对于要求严格的母婴产品和医疗产品，这样的操作很难满足其要求。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高产DHA裂殖壶菌突变株及其应用。

本发明提供了保藏编号为CCTCC NO:M 20231363的裂殖壶菌AM-D1(Schizochytrium sp.AM-D1)。

本发明通过诱变获得裂殖壶菌AM-D1菌株，是诱变获得的菌株中副产物含量最低，生长最好、DHA产量及占比最高的菌株；副产物DPA和EPA为DHA的合成前体，现有菌株难以做到高产DHA的同时具有较低的DPA含量，因此，所述裂殖壶菌AM-D1与现有菌株相比较，DHA含量及占比高、副产物低，尤其是难以与DHA分离的副产物DPA，为后续的分离纯化步骤带来了较大的便利，更利于工业化生产。

本发明提供了菌剂，其包括本发明所述的裂殖壶菌AM-D1或本发明所述的菌群。

进一步的，本发明所述的菌剂，其剂型包括颗粒、液体和/或干粉中的至少一种。

本发明提供了DHA的制备方法，其为发酵如i)～iii)所示中的至少一种，获得含有DHA的产物:

i)、本发明所述的裂殖壶菌AM-D1；

ii)、本发明所述的菌群；

iii)、本发明所述的菌剂。

进一步的，本发明所述的制备方法中，

所述发酵的初始温度为25～30℃。

所述发酵的转速为200～800rpm；

所述发酵的溶氧量为10％～40％。

在本发明的一些具体实施例中，本发明所述的制备方法包括接种和发酵：

所述接种的接种量5％～15％(v/v)；

所述发酵的初始温度为25～30℃，待发酵至72～96h后温度降低至20～25℃；

所述发酵的搅拌速度200～800rpm；

所述发酵的溶解氧量为10％～40％；

所述发酵的pH为5.5～7.0；

所述发酵的初始通气量为2.5～4vvm，待发酵至72～96h后调整通气量为0.8～1.5vvm；

所述发酵的初始阶段流加残糖1，保持残糖1的浓度为10～25g/L，发酵至72～96h后流加残糖2，保持残糖2的浓度为5～10g/L；

所述残糖1为葡萄糖；

所述残糖2为葡萄糖和甘油的混合液，其中，葡萄糖和甘油的质量比为7：3。

所述的发酵的培养基包括培养基1和/或培养基2：

所述培养基1包括：葡萄糖，酵母粉，Na

所述培养基2包括：Na

在本发明的具体实施例中，所述培养基1用于本发明所述突变菌株的筛选，筛选获得DHA产量及占比高的突变菌株。

本发明的另一些具体的实施例中，所述培养基2用于对本发明的裂殖壶菌AM-D1进行发酵罐发酵，获得DHA。

本发明提供了如下I)～IV)所示中的至少一种在制备含有DHA的产品中的应用:

I)、本发明所述的裂殖壶菌AM-D1；

II)、本发明所述的菌群；

III)、本发明所述的菌剂；

IV)、本发明所述的制备方法制得的含有DHA的产物。

本发明提供了含有DHA的产品，其原料包括如下a)～d)所示中的至少一种：

a)、本发明所述的裂殖壶菌AM-D1；

b)、本发明所述的菌群；

c)、本发明所述的菌剂；

d)、本发明所述的制备方法制得的含有DHA的产物。

进一步的，本发明所述的产品包括食品、药品或饲料中的至少一种

本发明提供了所述的产品在医药、化工或食品中的应用。

本发明通过诱变获得裂殖壶菌AM-D1菌株，将其应用于DHA的生产，实验结果表明，本发明所述菌株发酵生物量可达140.32g/L，总脂质产量为80.13g/L，DHA产量占总脂质比例为60.7％，副产物DPA、棕榈酸和十八烷酸分别占总脂质比例为8.46％、23.43％和4.39％，未检测到EPA，油酸，亚油酸，亚麻酸等其他副产物，因此与现有其他菌株相比，本发明所述菌株能高产高纯度DHA藻油，减少了副产物脂肪酸的种类与占比，为后续的分离纯化步骤带来了较大的便利，更利于工业化生产。

附图说明

图1GC-MS检测图谱，A和B为标样，其中1为棕榈酸，2为十八烷酸，3为油酸，4为亚油酸，5为亚麻酸，6为二十碳四烯酸(ARA)，7为二十碳五烯酸(EPA)，8为二十二碳五烯酸(DPA)，9为二十二碳六烯酸(DHA)；C为突变菌株产DHA藻油检测。

生物保藏说明

裂殖壶菌属AM-D1(Schizochytrium sp.AM-D1)，于2023年7月24日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20231363。

具体实施方式

本发明提供了高产DHA裂殖壶菌突变株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明从深海样品中筛选高产DHA的裂殖壶菌菌株，通过常压室温等离子体(ARTP)诱变和筛选后获得了一株高产DHA，副产物较低的裂殖壶菌菌株(Schizochytriumsp.AM-D1)。

具体技术方案如下：

1、选取在种子培养基中培养至对数时期的裂殖壶菌，用无菌蒸馏水稀释制备菌悬液(OD

2、取含有适量菌数的菌悬液于ARTP仪中进行诱变处理；

3、取少量处理后的菌悬液均匀涂布于筛选平板放置培养箱中培养(26～30℃)；

4、挑选率先长出的单菌落至发酵培养基进行摇瓶发酵；

5、检测DHA的产量和其他脂肪酸的含量，选取高产DHA和副产物较少的菌株重复诱变直至获得具有优良性状并稳定遗传的菌种。

然后使用上述步骤获得的突变株进行发酵工艺优化制备富含DHA的藻油

具体的发酵方法如下：

将本发明所述的菌株接种至种子培养基中培养，制得种子液；将种子液培养24～48h后按接种量5％～15％接种至发酵罐中发酵。

发酵温度为25～30℃，搅拌速度200～800rpm，控制发酵液中溶解氧在10％～40％，以氨水和柠檬酸控制发酵液pH在5.5～7.0之间。初始通气量为2.5～4vvm，通过流加补料80％的葡萄糖控制发酵液中残糖在10～25g/L之间。待发酵至72～96h后调整通气量为0.8～1.5vvm，发酵温度降低至20～25℃，流加80％的葡萄糖，控制发酵液中残糖在5～10g/L之间。

本发明所述菌株Schizochytrium sp.AM-D1的18s rRNA序列如下所示:tgtagtcatatgcttgtctcaaagactaagccatgcatgtgtaagtataagcgaattatactgtgaaactgcgaacgg ctcattatatcagttataatcccttcggtagttcctttatacggatacctgcagtaattctggaattaatacgtgctgtacgggcccgactttcggggagggccgcacttattaggtctaagccaactctcttggtgagtcatgataattgagcagatcgcttttcggagcgatgaatcgtttgagtttctgccccatcagttgtcgacggtagggtattggcctacggtgactataacgggtgacggggagttagggctcgactccggagagggagcctgagagacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgtaaattacccaatgtggactccacga。

本发明采用的试剂耗材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1裂殖壶菌突变株(Schizochytrium sp.AM-D1)的诱变筛选

一、培养基成分配比

种子培养基：30g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，50mL/L组分1，2mL/L组分2，比例称取或量取各组分后，混合于烧杯中，加入所需量的蒸馏水进行定容，调节pH为6.5。

筛选培养基：30g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，20mmol/L丙二酸，15g/L琼脂粉，50mL/L组分1，2mL/L组分2的比例称取或量取各组分后，混合于烧杯中，加入所需量的蒸馏水进行定容配置。

发酵培养基：100g/L葡萄糖，10g/L酵母粉，50mL/L组分1，2mL/L组分2，比例称取或量取各组分后，混合于烧杯中，加入所需量的蒸馏水进行定容，调节pH为6.5。

上文所述的组分1，组分2，配方如下：

组分1：Na

组分2：CaCl

二、实验步骤

本专利涉及裂殖壶菌突变株(Schizochytriumsp.AM-D1)是通过ARPT诱变结合筛选平板获得，具体过程如下：

(1)菌悬液的制备：取适量野生型菌株接种至种子培养基中，于28℃培养2～4天后，取适量菌液稀释至OD

(2)ARPT诱变：取制备的菌悬液10μL，滴加至灭菌的载片，用无菌镊子将载片放置于ARPT仪的槽内，下方放置装有1mL无菌蒸馏水EP管，调节载片与等离子体口间距约为2～4mm，设定气量9～14SLM，功率设置100～150W，时间控制在50～120s。将处理完毕的载片放入盛有1mL无菌生理盐水的离心管中振荡洗脱，取50μL洗脱液稀释涂布于筛选培养基中28℃培养3～5天。

(3)高产菌株的筛选：挑选率先长出的较大的单菌落接种至发酵培养基中进行摇瓶发酵培养4～6天，破碎菌体，提取油脂，利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测总脂质、DHA含量和其他副产物含量。挑选出DHA产量高，比例高的菌株，以同样的方法进入下一轮诱变筛选，重复2～4次后，获得突变株(Schizochytrium sp.AM-D1)。

上述破碎菌体，提取油脂的步骤如下：

在摇瓶发酵培养4～6天发酵完成后的发酵液中加入氢氧化钠调节pH至9～12，加入3.5‰～5‰的溶菌酶，在55～70℃下孵育3～5h。在酶解液中加入乙醇(95％以上)，正己烷(使发酵液与两种溶剂的体积比为1∶1∶1)输送至三相碟式离心机进行离心提油，转速为5000～7000rpm。油脂回收率大于90％。

实施例2野生型与突变株(Schizochytrium sp.AM-D1)的性能比较

将野生型与获得的突变株分别接入种子培养基中，28℃、200rpm活化24～48h后，以10％比例接入发酵培养基，28℃、200rpm旋转振荡培养4～6天；

按发酵液：盐酸＝1:1.5的比例在发酵液中加入盐酸，70℃水浴1h。加入正己烷并震荡，静置分层取上清液(分层不明可适当低速离心)，重复2次。将上清液烘干(旋蒸)至恒重，称取脂质重量。种子培养基、发酵培养基参考实施例1。

按照《GB5009.168-2016食品中脂肪酸的测定》和《GBT38095-2019 DHA,EPA含量测定气相色谱法》，取约60mg油样加入4mL异辛烷(正己烷)和200μL 2mol/L氢氧化钾甲醇溶液，猛烈振摇60s，静置至澄清，加入1g硫酸氢钠,猛烈振摇。待盐沉淀后,取上层溶液，稀释适当倍数后气相色谱测定各菌株的脂肪酸组成与各组分产量，如表1所示。

表1.野生型与突变株的脂肪酸组成与组分占比

比对各突变株的脂肪酸组成与各组分比例，选择突变株D1作为目的菌株并命名为Schizochytrium sp.AM-D1

实施例3突变株(Schizochytrium sp.AM-D1)发酵制备富含DHA的藻油

(1)突变株发酵制备富含DHA的藻油

发酵罐培养基：

Na

发酵步骤：

将菌种按接种量5％～15％(v/v)接种至发酵罐培养基中，于5～50L发酵罐中发酵培养，转速为200～800rpm，溶氧为10％～40％，培养温度为25～30℃，以氨水和柠檬酸控制发酵液pH在5.5～7.0之间。初始通气量为2.5～4.0vvm，通过流加80％的葡萄糖调控发酵液中的残糖在10～25g/L之间；待发酵至72～96h后调整通气量为0.8～1.5vvm，发酵温度降低至20～25℃，流加7:3(w/w)的葡萄糖/甘油混合液，控制发酵液中残糖在5～10g/L之间。总发酵时长128小时。本发明发酵生物量最高为140.32g/L，总脂质产量为80.13g/L，占生物量比例57.1％，DHA产量为48.62g/L，占总油脂比例为60.7％。副产物DPA占总油脂比例为8.46％，棕榈酸占总油脂比例为23.43％，十八烷酸占总油脂为4.39％，未检测到EPA，油酸，亚油酸，亚麻酸等其他副产物。

破碎菌体，提取油脂参考实施例1

二、与其他相比较

表2.突变株(Schizochytrium sp.AM-D1)与其他论文的产量比较

表3.突变株(Schizochytrium sp.AM-D1)与其他论文的副产物脂肪酸组成比较

其中：

[1]为文献“张明亮,et al."高密度流加放大培养Schizochytrium sp.FJU-512生产DHA."药物生物技术1(2013):34～38.”

[2]为文献“Yin,Feng-Wei,et al."Efficient docosahexaenoic acidproduction by Schizochytrium sp.via a two-phase pH control strategy usingammonia and citric acid as pH regulators."Process Biochemistry 77(2019):1～7.”

[3]为文献“Guo,Dong-Sheng,et al."Development of a scale-up strategyfor fermentative production of docosahexaenoic acid by Schizochytrium sp."Chemical Engineering Science 176(2018):600～608.”

[4]为文献“Chi,Guoxiang,et al."Production of polyunsaturated fattyacids by Schizochytrium(Aurantiochytrium)spp."Biotechnology Advances 55(2022):107897.”

[5]为文献“Lee Chang,Kim Jye,et al."High cell density cultivation of anovel Aurantiochytrium sp.strain TC 20in a fed-batch system using glycerol toproduce feedstock for biodiesel and omega-3oils."Applied Microbiology andBiotechnology97(2013):6907～6918.”

[6]为文献“Ju,Jung-Hyun,et al."Boosting productivity of heterotrophicmicroalgae by efficient control of the oxygen transfer coefficient using amicrobubble sparger."Algal research 41(2019):101474.”

[7]为文献“Guo,Dong-Sheng,et al."Improving docosahexaenoic acidproduction by Schizochytrium sp.using a newly designed high-oxygen-supplybioreactor."AIChE Journal 63.10(2017):4278～4286.”

副产物DPA和EPA为DHA的合成前体，现有菌株难以做到高产DHA的同时具有较低的DPA含量，如表2和表3所示。上述结果表明，本发明的菌株与发酵方式与其他相比具有优势，更适于工业化生产。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。