一种改良型胚胎培养液

技术领域

本发明属于生殖生物学领域，特别涉及一种改良型胚胎培养液。

背景技术

在体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)技术周期中，胚胎质量是患者能否成功妊娠的关键因素。但是，胚胎发育潜能及利用率低的问题，一直困扰着辅助生殖技术临床。例如，体外受精后可以用于移植或冷冻的胚胎约占胚胎总数的55％左右，而其中移植后能够种植的胚胎仅为25％左右，这些皆与胚胎发育潜能低下有关。特别是高龄生育女性，由于卵巢储备功能下降，常伴有获卵少、卵母细胞质量不佳且卵子利用率低，经多个促排卵周期仍无或仅获少数可用囊胚。这种由于种植前胚胎发育潜能低下，造成了胚胎资源的严重浪费，高龄女性不孕症的发病率显著增加，同时也增加了患者的经济负担和心理创伤。

胚胎发育潜能除与配子(卵母细胞和精子)的质量密切相关，也受体外培养条件的显著影响。IVF胚胎培养液的质量是IVF胚胎质量的重要的决定性因素之一。

在体外培养的过程中，胚胎细胞表面常会伴有大量的自由基的产生，可能对胚胎细胞膜和细胞器膜等造成不可逆的毒性损伤，最终导致胚胎发育阻滞和胚胎退化。此外，高龄患者常伴随卵母细胞氧化应激水平升高、线粒体功能障碍、胚胎发育潜能降低。因此，如何通过优化IVF培养基，改良胚胎的体外发育环境，从而提高胚胎发育潜能，对改善高龄妇女的生育结局具有重要的临床意义，但目前仍无有效策略，是辅助生殖技术的临床难题，亟待解决。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种改良型胚胎培养液，该培养液用于着床前胚胎的体外培养，有效的提高了胚胎可利用率，能提高胚胎发育潜能，改善高龄患者的生育问题。

本发明提供了一种改良型胚胎培养液，在常规胚胎培养液中加入脂肪脱细胞活性蛋白CEFFE。

优选的，所述CEFFE在培养液中的浓度为2％-5％。

所述常规胚胎培养液包括受精液、卵裂期胚胎培养液或囊胚期胚胎培养液。

例如，所述常规胚胎培养液为Vitrolife营养液。

所述胚胎培养液用于着床前胚胎的体外培养。

脂肪脱细胞活性蛋白(Cell-free Fat Extract,CEFFE)是一种从脂肪组织中提取，含有上千种活性蛋白的无细胞复合物，具有促进组织再生修复的生物学功能，且无成瘤风险、来源丰富。质谱结果提示CEFFE中含有丰富的转化生长因子(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞因子(bFGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等多种细胞活性因子，而VEGF、HGF、IGF已被证实与细胞抗凋亡功能密切相关。同时，研究发现CEFFE具有调节炎症、促细胞增殖、抑制活性氧产生、抗细胞凋亡等多种生物学功能。

有益效果

(1)本发明的培养液用于着床前胚胎的体外培养，有效的提高了胚胎可利用率，能提高胚胎发育潜能，改善高龄患者的生育问题。

(2)培养液中引入的脂肪脱细胞活性蛋白可以通过患者自体脂肪提取。人体脂肪组织来源丰富，且脂肪组织内含有大量生物活性物质，而脂肪脱细胞活性蛋白去除了细胞成分，仅收集其中活性因子部分，其属于天然活性物质，对人体及动物等没有毒副作用，安全性好。

附图说明

图1为不同胚胎培养液对于提高高龄小鼠胚胎可利用率的效果评价；*表示差异显著(p<0.5)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.自体脂肪脱细胞活性蛋白(CEFFE)的制备、无菌检测、浓度测定

经抽脂手术收集患者的脂肪组织，生理盐水反复冲洗以去除组织中混杂的血液物质等，随后1200g转速离心3分钟分出3层：油层、脂肪层、液体层。收集中间脂肪层依次进行机械乳化、冻融破坏脂肪组织。随后1200g离心5min分出4层：油层、未破碎脂肪层、水层、组织碎片。收集第三层水层——“脂肪脱细胞活性蛋白层”，即CEFFE。CEFFE经0.22um滤器过滤以过滤细菌及碎片、BCA法测定蛋白浓度、无菌培养实验明确无菌安全性、病原体测试等。不同批次CEFFE使用之前先进行BCA蛋白浓度测定及浓度标定，以减少不同患者来源的CEFFE浓度的批间差异。最后，分装密封保持于-80℃冰箱。

或者所述脂肪脱细胞活性蛋白(CEFFE)可直接购自于上海萨美细胞技术有限公司。

2.改良型胚胎序贯培养液的配制

本实施例中常规胚胎培养液采用品牌为Vitrolife营养液。Vitrolife为国外的一个培养液品牌厂商，实验组实施例采用该品牌培养液添加2％自体脂肪脱细胞活性蛋白后制备的胚胎培养液。

3.CEFFE对于提高高龄小鼠胚胎可利用率的效果评价

选择8周龄、8月龄C57BL/6N雌性小鼠(高龄模型小鼠)为实验对象，所有动物实验均按照动物伦理委员会(P2022002)的指导方针进行。

促排卵实验获取高龄鼠卵母细胞：第一天05：00PM腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10IU，48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10IU，注射HCG后14小时，解剖小鼠并从输卵管壶腹部获卵。取8w野生型雄鼠附睾精子，行常规体外受精。每只高龄小鼠的卵母细胞随机分为2组：高龄对照组(Aged)、高龄治疗组(Aged+CEFFE)，给予不同体外培养方案，具体方案如下：

1.Ctrl：常规序贯培养液。

2.Aged组：常规序贯培养液。

3.Aged+CEFFE组：添加CEFFE的序贯培养液。

分析两组的2细胞率、4-8细胞率、桑葚胚形成率、囊胚形成率、囊胚质量等。

结果如图1所示，与常规培养液相比，添加CEFFE的培养液可提高高龄小鼠各阶段胚胎发育比例：更高的4-8细胞胚胎、囊胚、孵出囊胚的发育比例，提示CEFFE有利于高龄小鼠胚胎发育过程。

4.CEFFE对于改善高龄患者胚胎可利用率的效果评价

为了评估该改良型胚胎培养液对高龄患者胚胎发育潜能及胚胎结局的影响，开展了一项同胞卵子的随机对照实验。共计27例患者入组参加，从取卵到受精后D6天这个时间段内，同胞卵子各分一半随机到两组胚胎培养液(基础胚胎培养液、添加CEFFE的改良型胚胎培养液)中培养。于体外培养的第三天择优冷冻1-2枚D3可利用胚胎，余继续培养于第5、6天冷冻可利用囊胚，并统计卵裂率、D3可利用胚胎率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率、优质囊胚率、胚胎总可用率等。

在本发明实施例中，胚胎均行微滴培养。3.5cm培养皿中制备多个30-50μl的培养液滴并覆盖矿物油，置37.0℃、6％ CO

结果如表1所示，针对27例患者的同胞卵对照实验发现，本发明提供的改良型培养液与其他培养液相比：D3可利用胚胎率无明显差异，但本发明的改良型培养液显著提高了D3优质胚胎率、D3不可用养囊出囊率，提示其可提高卵裂期胚胎质量并可促进低质量卵裂期胚胎发育为囊胚。

表1

*表示差异显著(p＜0.5)。