具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于杀菌技术领域，特别涉及具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐及其制备方法和应用。

背景技术

香蕉枯萎病其病原菌为尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporiumf.sp.cubense(简称FOC)，其生理小种分化较多，其中以4号小种(简称FOC4)的危害最大，分布最广，已经成为危害全世界香蕉种植产业的最大病害之一。该病原菌的腐生能力很强，可以休眠孢子的形式在土壤中长期存活，而香蕉枯萎病的发生与土壤中病原菌FOC4的数量呈正相关，因此，降低土壤中病原菌数量是防治香蕉枯萎病的重要方法。

现有技术中的化学防治主要有两类方法：一类是采用化学药剂抑制土壤中的病原菌数量。虽然目前一些基于室内毒力测定和盆栽试验筛选出的小分子药物，如咪鲜胺、丙环唑、甲基托布津和五氯硝基苯等，均对香蕉枯萎病有一定防治效果，但实践中的防治效果不佳。另一类则可称为“土壤消毒”，即采用物理、化学或生物的方法将土壤中的微生物全部杀灭，如土壤加热、土壤熏蒸等，其中，以棉隆(四氢化-3,5-二甲基-2H-1,3,5-噻二嗪-2-硫酮)、石灰氮(氰氨化钙)、二氧化氯等为代表的小分子化学药剂熏蒸是目前田间防治的主要方法；该法完全破坏土壤中的微生物群落结构，故需在处理后引入新的有机物恢复土壤，不利于土壤生态系统的稳定。生物防治及作物轮种等由于经济成本高及无法连续种植，受限于经济效益等也很难大规模有效实施。故而，目前还没有较为经济可行且可在尽可能保持土壤中微生物多样性的基础上来有效抑制土壤中FOC4的方法。

因此，亟需提供一种新的杀菌物质，该杀菌物质对土壤中的FOC4具有良好的杀灭作用，且不破坏土壤微生物生态系统，从而有利于对香蕉枯萎病的防治。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐及其制备方法和应用，本发明所述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐能够对土壤中FOC4孢子的活性具有很好的抑制作用，并降低对土壤微生物多样性的影响，有利于对香蕉枯萎病的防治。

本发明的第一方面提供具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐。

具体的，结构通式如式1所示的具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐：

其中，m和n都为正整数，且m:n＝(14-22)：(6-32)。

进一步优选的，所述m:n＝18：(6-30)。

优选的，所述m为14-22之间的正整数，n为6-32之间的正整数。

优选的，所述m为14-22之间的偶数，n为6-32之间的偶数。

优选的，所述m为18，所述n为6、12、18或30。

式1中的b表示m和n标记的重复单元为两嵌段结构。

优选的，所述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的分子量为5-20kDa，优选5-12kDa。

本发明的第二方面提供具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备方法。

具体的，具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备方法，包括以下步骤：

(1)将甲基丙烯酸三氟乙酯、溴代酯、催化剂、助剂、有机溶剂混合，在惰性气体氛围中第一次反应，再加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，第二次反应，制得中间产物；

(2)将步骤(1)制得的中间产物、氯化苄、有机溶剂混合，在惰性气体氛围中反应，制得所述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐。

优选的，步骤(1)中，所述催化剂为亚铜盐；进一步优选的，所述催化剂为卤素与亚铜形成的亚铜盐；更优选的，所述催化剂为CuBr。

优选的，步骤(1)中的溴代酯为2-溴异丁酸乙酯(简称EtBriB)。

优选的，步骤(1)中，所述助剂包括N,N,N',N”,N”-五甲基二乙烯基三胺(简称PMDETA)。

优选的，步骤(1)中，所述惰性气体包括氮气或稀有气体。

优选的，步骤(1)中，所述第二次反应进行一段时间后，暴露于空气中，则停止反应。制得的中间产物可分离提纯，呈淡黄色透明油状液体。

优选的，对中间产物的分离提纯过程如下：将反应后形成的混合物进行旋蒸处理，除去大部分有机溶剂，然后加入丙酮溶剂，再加入中性氧化铝搅拌直至溶液由绿色变为无色，然后过滤掉粉末，最后旋蒸出溶剂和未反应的物质(单体)，得到纯化后的中间产物；或通过旋蒸除去大部分有机溶剂，用丙酮溶解反应后的体系，隔膜泵抽滤使其通过中性氧化铝层析柱除去反应后的体系中的CuBr，将得到的洗脱液于70℃下旋蒸，除去未反应物质(单体或助剂)，得到中间产物。

优选的，步骤(1)中，所述有机溶剂为甲苯和/或乙醇。

优选的，步骤(1)中，所述有机溶剂的体积用量为甲基丙烯酸三氟乙酯、溴代酯总体积的1-10倍，优选2-8倍。

优选的，步骤(1)中，所述催化剂需进行预处理，用乙酸与甲醇各洗涤3-10次。

优选的，步骤(1)中，所述溴代酯、催化剂、助剂的摩尔比为1：(0.8-2)：(0.8-2)；优选1：1.5：1.5。

优选的，步骤(1)中，所述第一次反应的温度为45-55℃，反应的时间为1-10小时；优选的，所述反应的温度为48-50℃，反应的时间为2-3小时。

优选的，步骤(1)中，所述第二次反应的温度为45-55℃，反应的时间为4-8小时；优选的，所述反应的温度为48-50℃，反应的时间为4-8小时。

优选的，步骤(1)中，所述甲基丙烯酸三氟乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯的质量比为1-5：3。所述甲基丙烯酸三氟乙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯在使用前进行减压蒸馏，以除去阻聚剂杂质。

优选的，步骤(2)中，所述有机溶剂的质量为步骤(1)制得的中间产物质量的2-5倍，优选3-4倍。

优选的，步骤(2)中，所述反应的温度为45-55℃，反应的时间为20-50小时；优选的，所述反应的温度为48-50℃，反应的时间为24-48小时。

优选的，步骤(2)中，步骤(1)制得的中间产物、氯化苄的摩尔比为1:(3-8)；优选1：5。

优选的，步骤(2)中，反应结束后，对产物进行纯化，所述纯化的具体过程为：减压蒸馏出大部分溶剂，加入大量无水乙醚将具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐沉析出来，倒掉上层清液，重复2-5次，然后放入40-50℃真空烘箱中烘干，即得到纯化的具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐。

可通过控制各反应原料的用量来控制产物的分子量。

本发明的第三方面提供具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的应用。

本发明所述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐在防治香蕉枯萎病中的应用。

优选的，所述应用是对FOC4具有抑制作用。

一种抗菌剂，所述抗菌剂包括上述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所述具两嵌段规结构的含氟大分子季铵盐具有良好抑菌效果，特别是对土壤中FOC4孢子的抑制效果，并且降低对土壤微生物多样性的影响，有利于香蕉枯萎病的防治。本发明所述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐在土壤中可以有效吸附、不易迁移，从而可长期有效抑制土壤中的FOC4孢子。

(2)本发明所述制备方法过程简便，共两步，且反应过程中无副产物出现，可以高效便捷得到纯净产物，此外合成过程中采用原子转移活性自由基聚合，可通过各反应的投料顺序及投料比来控制产物结构及分子量，对制得的产物的可控性强。

附图说明

图1为本发明实施例1、对比例1制得的中间产物、产物的红外图谱；

图2为本发明实施例1制得的中间产物的核磁共振氢谱图；

图3为本发明实施例1制得的产物的核磁共振氢谱图；

图4为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的临界胶束浓度图；

图5为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的Zeta电位图；

图6为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的粒径分布示意图；

图7为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的抗菌效果图；

图8为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物在土壤中饱和吸附量图；

图9为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的土壤中的迁移能力图；

图10为本发明实施例1、对比例1制得的产物对土壤微生物多样性的影响结果。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

结构通式如式1所示的具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐：

其中，m为18，所述n为6、12、18或30。

式1中的b表示m和n标记的重复单元为两嵌段结构。

具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的分子量为5-20kDa

上述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备方法，包括以下步骤：

(1)将甲基丙烯酸三氟乙酯、溴代酯、催化剂、助剂、有机溶剂混合，在惰性气体(氮气)氛围中第一次反应，再加入甲基丙烯酸二甲氨基乙酯，第二次反应，制得中间产物；

(2)将步骤(1)制得的中间产物、氯化苄、有机溶剂混合，在惰性气体氛围中反应，制得所述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐。

步骤(1)中，催化剂为CuBr；溴代酯为2-溴异丁酸乙酯(简称EtBriB)；助剂包括N,N,N',N”,N”-五甲基二乙烯基三胺(简称PMDETA)；惰性气体为氮气；制得的中间产物可分离提纯，呈淡黄色透明油状液体。

步骤(1)中，第一次反应的温度为45-55℃，反应的时间为1-10小时；第二次反应的温度为45-55℃，反应的时间为4-8小时。

步骤(2)中，所述反应的温度为45-55℃，反应的时间为20-50小时。

上述反应的方程式如下所示：

对比例1：含氟季铵盐产物的制备

含氟季铵盐产物的制备，包括以下步骤：

(1)称取1.08g的CuBr于带有搅拌磁子的250mL茄形瓶中，加40g甲苯与40g乙醇混合有机溶剂，向反应体系中加入1.3g N,N,N',N”,N”-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)、0.975g2-溴异丁酸乙酯(EtBriB)，反应体系充吸氮气三次，置于50℃油浴锅下搅拌，然后加入15g甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(记为DMAEMA)，50℃反应5小时后，暴露于空气停止反应，旋蒸除去大部分有机溶剂，用100mL丙酮溶解反应后的体系，隔膜泵抽滤使其通过中性氧化铝层析柱除去反应后的体系中的CuBr，将得到的洗脱液于70℃下旋蒸，除去未反应物质(单体或助剂)，得到中间产物(记为PDMAEMA，简称为D

(2)将10g的步骤(1)制得的D

对比例1含氟季铵盐产物的反应方程式如下：

实施例1：具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备

结构式如式1所示的具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐：

其中，m为18，n为6。

上述具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取1.08g的CuBr于带有搅拌磁子的250mL茄形瓶中，加40g甲苯与40g乙醇混合有机溶剂，向反应体系中加入1.3g N,N,N',N”,N”-五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)、0.975g2-溴异丁酸乙酯(EtBriB)，反应体系充吸氮气三次，置于50℃油浴锅下搅拌，然后加入5g甲基丙烯酸三氟乙酯(记为DMAFMA)，50℃第一次反应2.5小时后，再加入15g甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(记为DMAEMA)，50℃第二次反应4小时后，暴露于空气停止反应，旋蒸除去大部分有机溶剂，用100mL丙酮溶解反应后的体系，隔膜泵抽滤使其通过中性氧化铝层析柱除去反应后的体系中的CuBr，将得到的洗脱液于70℃下旋蒸，除去未反应物质(单体或助剂)，得到中间产物(记为F

(2)将10g的步骤(1)制得的中间产物溶于40g甲苯/乙醇(质量比为1：1)混合有机溶剂中，装入带有搅拌磁子的150mL茄形瓶中，反应体系冲吸氮气三次，置于50℃油浴锅中，向反应体系中注射2.11g的氯化苄，保温反应24小时后，于70℃下旋蒸除去反应后的体系中大部分的甲苯与乙醇有机溶剂，旋蒸结束后再加入100mL乙醚，利用溶解度差异将最终产物从甲苯/乙醇有机溶剂中沉淀析出得到黄色絮状产物，将产物用乙醚反复洗涤三3次后，过滤、置于60℃真空烘箱中烘干48小时，得到具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐(记为PFDMS-PDMAEMA-BC，简称为F

图1为本发明实施例1、对比例1制得的中间产物、产物的红外图谱；图2为本发明实施例1制得的中间产物的核磁共振氢谱图(为了让图2显示更为清楚，将中间产物F

从图1-3显示的结果可以得知本实施例1制得的产物的结构式如式1所示。

实施例2：具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备

结构式如式1所示的具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐：

其中，m为18，n为12。

实施例2与实施例1的区别在于实施例2加入10g甲基丙烯酸三氟乙酯(记为DMAFMA)，第一次反应的时间为4小时，其余过程与实施例1相同。得到具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐(简称为F

实施例3：具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备

结构式如式1所示的具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐：

其中，m为18，n为18。

实施例3与实施例1的区别在于实施例3加入15g甲基丙烯酸三氟乙酯(记为DMAFMA)，第一次反应的时间为6小时，其余过程与实施例1相同。得到具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐(简称为F

实施例4：具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐的制备

结构式如式1所示的具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐：

其中，m为18，n为30。

实施例4与实施例1的区别在于实施例4加入25g甲基丙烯酸三氟乙酯(记为DMAFMA)，第一次反应的时间为10小时，其余过程与实施例1相同。得到具有两嵌段结构的含氟大分子季铵盐(简称为F

产品性能测试

1.实施例、对比例制得的产物的临界胶束浓度、Zeta电位(电动电位)、粒径分布、土壤中的迁移能力性能测试

图4为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的临界胶束浓度图；图5为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的Zeta电位图；图6为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的粒径分布示意图。

图4中实施例1-4制得的产物随着疏水性的增强，临界胶束浓度都呈现出逐渐降低的趋势。

图5的结果说明实施例1-4制得的产物的Zeta电位，随着含疏水性增强而不断增大，所形成的胶束Zeta电位不断增大，胶束的动力学稳定性不断提高。

图6实施例1-4制得的产物的粒径比对比例1制得的产物的粒径要大，且随疏水链段增多，分子量增大，实施例制得的产物的粒径不断增大。

2.抗菌效果测试

以十二烷基二甲基苄基氯化铵(苯扎氯铵，记为BC)为参照，以大肠杆菌(E.coli)为革兰氏阴性细菌代表、白葡萄球菌(S.albus)为革兰氏阳性细菌代表、白色念珠菌(C.albicans)为病原真菌代表，尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(FOC4)作为植物病原真菌的代表，评价实施例所制备的产物对上述四种细菌/真菌的抑制作用。抑菌实验简述如下：

将培养基中培养的细菌或真菌悬浮液稀释到10

图7为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物的抗菌效果图；从图7(图7中的纵坐标表示对应实施例1-4、对比例1对细菌或真菌的MIC或MFC(或MBC)数值)可以看出，本发明实施例1-4制得的产物(F

3.与土壤相互作用特性测试

吸附性能测试：分别将实施例1-4、对比例1制得的产物及BC(苯扎氯铵)与0.01mol/L的CaCl

图8为本发明实施例1-4、对比例1制得的产物在土壤中饱和吸附量图；从图8可以看出，本发明实施例实施例1-4制得的产物在土壤中易发生吸附，且在土壤中的饱和吸附量随着疏水性(含氟结构对应疏水性)增强，分子量增大，分子链增长呈现出不断增大的趋势。

迁移性能测试：分别将实施例1-4制得的产物及BC(苯扎氯铵)配置成为400mg/mL的溶液，分别取100mL以一定淋溶速度(1-2滴/秒，相当于实际中大暴雨级别)滴加到不同土柱厚度的淋溶装置中，溶液滴加完毕后继续以相同速率滴加去离子水，观察淋溶状况，收集土柱淋出液，每100mL收集一次直至收集到500mL停止，待淋出液收集结束后，各取其中1mL在5000r/min转速下离心5分钟，用紫外分光光度计测试吸光度，计算其溶液浓度，结果如图9所示。

图9中的纵坐标为“淋溶季铵盐百分含量”，实施例、对比例制得的产物为季铵盐，为了描述的简化，将纵坐标记为“淋溶季铵盐百分含量”，说明实施例1-4制得的产物在土壤中的迁移能力较差，不易被雨水淋溶流失。

4.对斑马鱼毒性测试

鱼类急性经口毒性测试：参照《GB/T 31270.12-2014化学农药环境安全评价实验准则——第12部：鱼类急性毒性试验》，采用半静态试验法进行斑马鱼实验，测试实施例1-4、对比例1制得的产物(可称为待测药物)、苯扎氯铵在水溶液中对斑马鱼的急毒性大小，其具体实验操作步骤：先通过预实验确定药物对斑马鱼大致毒性浓度范围，然后再将药物按照一定区间精确设置一系列梯度浓度，每组浓度梯度放入7尾斑马鱼，并且每日更换药液，其他实验条件与驯养环境相同，记录96h时斑马鱼生长情况，计算实施例1-4、对比例1制得的产物对斑马鱼的毒力水平(LC

含药物土壤的环境毒性测试：分别将10g新鲜实验土壤与实施例1-4、对比例1制得的产物(可称为待测药物)、苯扎氯铵配置成1000mL的含药物土壤悬浮液，同时设置一组不含药物的土壤悬浮液对照组，用玻璃棒搅拌，然后静置12h，待溶液上层清澈后，在每组土壤悬浮液中放入7尾斑马鱼，并且每日更换新的土壤悬浮液，其他实验条件与驯养环境相同，记录96h时斑马鱼生长情况，计算药物经过土壤吸附后对斑马鱼的毒力水平，结果如表1所示。

含药物土壤的淋溶液毒性测试：分别将实验用土与实施例1-4、对比例1制得的产物(可称为待测药物)、苯扎氯铵搅拌混合均匀后再填装进土柱，将去离子水按一定淋溶速度滴加到土柱淋溶装置中，冲洗土柱中药物以模拟现实中雨水对土壤中药物的冲刷情况，观察淋溶状况，收集土柱淋出液，得到100mg/L、50mg/L、20mg/L、10mg/L的淋溶药液然后进行斑马鱼毒性实验，模拟药物在实际生产应用中随雨水渗入地下水对斑马鱼毒性的影响，结果如表1所示。

表1

从表1可以看出，本发明实施例1-4制得的产物在与土壤发生相互作用后，呈现出低毒性特点。

4.对土壤微生物多样性的影响测试

称取1g新鲜土壤和计量实施例1、对比例1制得的产物、苯扎氯铵(BC)药物于无菌离心管中，补加一定量无菌水使土壤溶液体系水土质量比为1:1，并设置一组去离子水对照组(记为CK)，将配制好的土壤药液体系置于恒温震荡培养箱培养在28℃、200rpm的条件下震荡培养2天，培养完毕后取其上层溶液0.5mL置于1mL的离心管中在5000r/min的离心机中离心3分钟，然后对上层清液进行一系列稀释。用移液枪分别取稀释后培养液100μL涂布于制备好的孟加拉红培养基、牛肉膏蛋白胨培养基和改良高氏培养基分别用来培养土壤中真菌、细菌和放线菌，置于28℃恒温培养箱中培养一定天数后，对平板培养基中生长的真菌、细菌、放线菌菌落进行计数，并与不添加实施例1、对比例1制得的产物的土壤体系中菌落数进行对比，从而评价实施例1、对比例1制得的产物对土壤体系中微生物影响。

图10为本发明实施例1、对比例1制得的产物对土壤微生物多样性的影响结果；图10中的(a)、(b)、(c)分别代表实施例1、对比例1制得的产物及苯扎氯铵对细菌、放线菌以及真菌的数量影响。从图10可以看出，苯扎氯铵(BC)会几乎无差别地将土壤中的微生物完全抑杀，而本发明实施例1制得的产物对土壤中典型微生物群落丰富度的影响较小，其中，真菌群落的丰富度有所下降，细菌和放线菌群落的丰富度则有所上升，暗示施用了实施例1制得的产物的土壤更有利于香蕉植株的种植。

5.盆栽试验

盆栽试验过程中设置无菌无药、有菌无药、有菌有药、无菌有药实验组，每个浓度下重复5个重复组，其具体操作如下：将100份实验土样每份中加入10g基质土，取其中90份实验土样，与一定浓度对比例1、实施例1制得的产物(可称为药物)溶液混合搅拌均匀后填装于上口径为12cm，下口径为10cm，高度为10cm的实验花盆中，每个浓度组份10份(后续接种FOC4时每个浓度接种5盆)，另将剩余10组实验土样与150mL去离子水混合均匀设置为不含药物的对照组(记为CK)。选取根系、叶片长势一致的香蕉幼苗移栽至所制备盆栽土壤环境中，培养14天，待香蕉幼苗适应生长环境后，有菌无药组与有菌有药组每个浓度梯度下各取5盆接种2×10

表2

表2是对比例1、实施例1制得的产物对香蕉苗生长参数影响，EC