一种速率反应装置、方法及其在发色底物法上的应用

技术领域

本发明涉及医学、免疫、生化检验、药物活性和体外诊断速率反应技术领域，具体涉及一种速率反应单元，还涉及一种速率反应方法，以及速度反应单元和速度反应方法在发色底物法上的应用。

背景技术

速率反应是常见的检测方法。如在肝素及低分子肝素的抗凝血活性测定中广泛使用血浆凝固法和发色底物法，发色底物法以其较好的重现性和抗干扰性成为USP、EP、《中国药典》的指定方法。发色底物(chromogenic substrates)为化学合成的小肽，其一端为发色基团(pNA)。特定的酶(如凝血酶)可将pNA催化解离下来，游离pNA在405nm处有特征吸收，可通过分光光度计或酶标仪进行定量检测，从而确定相应凝血酶的活性。通过肝素的标准曲线法可确定待测样品的抗凝血活性。

基于发色底物法开发了许多类型的肝素抗凝血活性分析仪器和肝素效价测定试剂盒。肝素抗凝血活性分析仪器主要基于一步法试验原理，即将抗凝血活性测定反应相关的试剂一次性加入；肝素效价测定试剂盒主要基于速率反应原理，即将抗凝血活性测定反应相关的试剂按序逐步加入。一步法对反应条件的一致性要求极高，包括操作方法、检测过程中试剂量、混匀程度、反应时间等因素微小的变化，都将引起实验数据的差异，实验稳定性、可重复性上比速率反应法差。如果追求结果的稳定性，则更多的选择速率反应法。但速率反应法需要按序依次将相应的反应试剂精准加入，并准确控制反应时间，操作步骤较为复杂繁琐，目前基于该原理的试剂盒只能以手动操作为主，浪费了大量的人力和时间。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种速率反应装置、速率反应方法以及其在发色底物法上的应用，极大的提高了反应结果的稳定性、可重复性，减少了实验操作差异对结果的影响，自动化程度高，操作便捷，能够广泛的应用于医学、免疫、生化检验、药物活性和体外诊断等速率反应场合。尤其是在肝素的抗凝血酶的检测上，保证了检测的pNA基团含量与肝素的抗凝血效价成正比关系，解决目前活性测定试剂盒手动操作复杂、稳定性差的弊端；也将进一步解决临床抗凝血分析仪器一步法分析中，检测结果不稳定的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种速率反应装置，包括进样管、N个反应试剂注入系统、N-1个孵育反应管、泵液速度为V的匀速泵系统和定时反应管，所述反应试剂注入系统包括用于储存反应试剂的试剂存储单元、用于定量输出反应试剂的微量进药单元以及用于使样品和反应试剂充分混合的混匀单元，所述微量进药单元连通于所述试剂存储单元，所述混匀单元连通于所述微量进药单元，N-1个所述孵育反应管依次连通于N个所述混匀单元之间，所述进样管连通于第1个所述混匀单元，所述匀速泵系统和所述定时反应管依次连通于第N个所述混匀单元上；

其中，N-1个所述孵育反应管的长度l

l

l

…

l

其中，t

其中，所述定时反应管的长度L为：

L＝V·T

其中，T为反应试剂的反应时间。

作为优选的，所述定时反应管之后加装1个序号为N+1的所述反应试剂注入系统，在第N+1个所述反应试剂注入系统的混匀单元之后连通检测系统。

作为优选的，包括进样管、4个反应试剂注入系统、2个孵育反应管、泵液速度为V的匀速泵系统、定时反应管和检测器，所述反应试剂注入系统包括用于储存反应试剂的试剂存储单元、用于定量输出反应试剂的微量进药单元以及用于使样品和反应试剂充分混合的混匀单元，第1个至第4个所述试剂存储单元中的反应试剂分别为AT III、凝血酶、显色底物和终止液，所述微量进药单元连通于所述试剂存储单元，所述混匀单元连通于所述微量进药单元，2个所述孵育反应管依次连通于第1个至第3个所述混匀单元之间，所述进样管连通于第1个所述混匀单元，所述匀速泵系统和所述定时反应管依次连通于第3个所述混匀单元上，第4个所述反应试剂注入系统的所述混匀单元连通于所述定时反应管和所述检测器之间；

其中，2个所述孵育反应管的长度l

l

l

其中，t

其中，定时反应管5的长度L为：

L＝V·T

其中，T为反应试剂的反应时间。

作为优选的，所述孵育反应管和所述定时反应管的材质包括但不限于聚合物、金属或者玻璃，所述孵育反应管和所述定时反应管的表面涂覆惰性材质涂层。

作为优选的，所述试剂储存单元的材质包括但不限于塑料、金属或者玻璃，所述试剂储存单元的表面涂覆有用于表示分区或起到避光作用的涂层，所述试剂储存单元上设置有温度调节件。

作为优选的，所述检测器包括但不限于紫外分光检测器或者酶标仪。

一种速率反应方法，使用上述速率反应装置，包括以下步骤：

S1，吸取适量的待检测样品进入到第1个混匀单元中；

S2，同时，第1个反应试剂注入系统将定量的第1种反应试剂注入到第1个混匀单元中；

S3，待检测样品与第1种反应试剂混匀后，在第1个孵育反应管中经过时间t

S4，第2个反应试剂注入系统将定量的第2种反应试剂注入到第2个混匀单元中；

S5，待检测样品、第1种反应试剂及其生成物与第2种反应试剂混匀后，在第2个孵育反应管中经过时间t

S6，依次重复步骤S4-S5，直至待检测样品、第1种反应试剂、第2种反应试剂、…、第N种反应试剂及其生成物混匀后，在定时反应管中经过时间T后，完成反应。

一种速率反应方法，使用上述速率反应装置，包括以下步骤：

S1，吸取适量的待检测样品进入到第1个混匀单元中；

S2，同时，第1个反应试剂注入系统将定量的AT III注入到第1个混匀单元中；

S3，待检测样品与AT III混匀后，在第1个孵育反应管3中经过时间t

S4，第2个反应试剂注入系统将定量的凝血酶注入到第2个混匀单元中；

S5，待检测样品、AT III及其生成物与凝血酶混匀后，在第2个孵育反应管中经过时间t

S6，第3个反应试剂注入系统将定量的显色底物注入到第3个混匀单元中；

S7，待检测样品、AT III、凝血酶及其生成物与显色底物混匀后，在定时反应管中经过时间T后注入到第4个混匀单元中，时间T为过量游离的凝血酶酶解显色底物释放pNA显色基团的反应时间。

S8，第4个反应试剂注入系统2将定量的终止液注入到第4个混匀单元22中，与待检测样品、AT III、凝血酶和显色底物反应体系混合均匀，终止凝血酶对显色底物的酶解作用；

S9，将待检测样品、AT III、凝血酶、显色底物和终止液的混合体系注入到检测器中，读取405nm处的吸光度值，作为计算待检测样品抗凝血酶效价的标准数据。

作为优选的，所述待检测样品为肝素，所述凝血酶为Ⅹa，所述显色底物为S-2765，所述终止液为2％的柠檬酸钠溶液。

一种发色底物法，其特征在于，使用如权利要求8或9所述的速率反应方法，用于测定抗凝血酶的效价。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的速率反应装置和速率反应方法，通过匀速泵系统为待检测样品和反应试剂提供了线性的输液速度，结合孵育反应管和定时反应管的特定长度，实现了精确的控制孵育时间和反应时间的目的。相互独立的反应试剂注入系统，实现了每种反应试剂进行单独储存、进药，减少了反应试剂的粘附和浪费，可以单独针对每种反应试剂所需要的温度、湿度、是否密闭等条件进行调整，精准的控制了各反应试剂的加入量和顺序，一次进样，可自动按序加入反应试剂，按序发生竞争结合反应，充分保证各反就的完成度。整个速度反应装置，极大的提高了反应结果的稳定性、可重复性，减少了实验操作差异对结果的影响，自动化程度高，操作便捷，能够广泛的应用于医学、免疫、生化检验、药物活性和体外诊断等速率反应场合。尤其是在肝素抗Xa和抗Ⅱa的活性测定上，反应中保持了各实验步骤反应试剂加入量的一致性；且凝血酶对显色底物的酶解反应实验步骤，严格控制了反应时间，保证了检测的pNA基团含量与肝素的抗凝血效价成正比关系，解决目前活性测定试剂盒手动操作复杂、稳定性差的弊端；也将进一步解决临床抗凝血分析仪器一步法分析中，检测结果不稳定的问题

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例技术中的技术方案，下面将对实施例技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还能够根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明优选实施例中速率反应单元的结构示意图。

其中，1-进样管，2-反应试剂注入系统，20-试剂存储单元，21-微量进药单元，22-混匀单元，3-孵育反应管，4-匀速泵系统，5-定时反应管，6-检测系统。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

参照图1所示，本实施例中公开了一种速率反应装置，包括进样管1、N个反应试剂注入系统2、N-1个孵育反应管3、泵液速度为V的匀速泵系统4和定时反应管5。反应试剂注入系统2包括用于储存反应试剂的试剂存储单元20、用于定量输出反应试剂的微量进药单元21以及用于使样品和反应试剂充分混合的混匀单元22。微量进药单元21连通于试剂存储单元20。混匀单元22连通于微量进药单元21。N-1个孵育反应管3依次连通于N个混匀单元22之间。进样管1连通于第1个混匀单元22。匀速泵系统4和定时反应管5依次连通于第N个混匀单元22上。

其中，N-1个孵育反应管3的长度l

l

l

…

l

其中，t

其中，定时反应管5的长度L为：

L＝V·T

其中，T为反应试剂的反应时间。

以上优化的设计，匀速泵系统4为待检测样品和反应试剂提供了线性的输液速度，结合孵育反应管3和定时反应管5的特定长度，实现了精确的控制孵育时间和反应时间的目的。相互独立的反应试剂注入系统，实现了每种反应试剂进行单独储存、进药，减少了反应试剂的粘附和浪费，可以单独针对每种反应试剂所需要的温度、湿度、是否密闭等条件进行调整，精准的控制了各反应试剂的加入量和顺序，一次进样，可自动按序加入反应试剂，按序发生竞争结合反应，充分保证各反就的完成度。整个速度反应装置，极大的提高了反应结果的稳定性、可重复性，减少了实验操作差异对结果的影响，自动化程度高，操作便捷，能够广泛的应用于医学、免疫、生化检验、药物活性和体外诊断等速率反应场合。

上述匀速泵系统4在具体连通时，可以连通于第N个混匀单元22和定时反应管5之间。在一些反应中，反应的停止需要注入停止液，则可以在定时反应管5之后加装1个序号为N+1的反应试剂注入系统2。第N+1个混匀单元22连通于定时反应管5之后。

为了进一步提高自动化程度，减少操作时间，可以在第N+1个反应试剂注入系统2的混匀单元22之后连通检测系统6。终止反应后的混合物直接注入到检测系统6中进行检测。

上述孵育反应管3和定时反应管5的材质包括但不限于聚合物、金属或者玻璃。其能够减少待检测样品、反应试剂及其生成物的吸收。孵育反应管3和定时反应管5的表面可以涂覆惰性材质涂层，以进一步减少吸收。

上述试剂储存单元20的材质包括但不限于塑料、金属或者玻璃。试剂储存单元20的表面可以涂覆不同颜色的涂层，以表示分区或起到避光作用。试剂储存单元20的形状包括但不限于瓶状、罐状、六面体状等。试剂储存单元20上设置有温度调节件，以实现反应试剂的低温存储、常温存储、37℃恒温孵育存储等。

上述匀速泵系统4包括但不限于高压恒流泵、柱塞泵、注射泵或者双动往复泵。

上述检测器6包括但不限于紫外分光检测器或者酶标仪。

实施例2

本实施例公开了一种速率反应方法，使用实施例1中的速率反应装置，具体步骤如下：

S1，吸取适量的待检测样品进入到第1个混匀单元22中；

S2，同时，第1个反应试剂注入系统2将定量的第1种反应试剂注入到第1个混匀单元22中；

S3，待检测样品与第1种反应试剂混匀后，在第1个孵育反应管3中经过时间t

S4，第2个反应试剂注入系统2将定量的第2种反应试剂注入到第2个混匀单元22中；

S5，待检测样品、第1种反应试剂及其生成物与第2种反应试剂混匀后，在第2个孵育反应管中经过时间t

S6，依次重复步骤S4-S5，直至待检测样品、第1种反应试剂、第2种反应试剂、…、第N种反应试剂及其生成物混匀后，在定时反应管5中经过时间T后，完成反应。其中，T为所有反应试剂的反应时间。

实施例3

基于发色底物法的一步法，其原理主要依据反应试剂间的竞争拮抗反应，实验操作更简单、测试时间更短。加入凝血酶到待测血浆中与底物混合，立即同时有2个反应：底物被凝血酶水解和凝血酶被肝素-AT复合物抑制。一旦反应达到平衡，底物中释放出的pNA与待测血浆中肝素浓度成反比。在这个检测中，没有添加外源性的AT，完全依赖病人血浆中的AT数量。这就代表了病人真实的肝素功能反应。一步法广泛应用于临床抗凝血分析仪器中，肝素治疗方案的监测。

而基于发色底物法的速率反应法，其检测肝素抗凝血活性的原理，在本实施例中，主要分三个步骤进行，以低分子量肝素抗Xa效价测定为例：①待检测样品中的低分子量肝素(LMWH)与过量的抗凝血酶III(AT III)混合，形成LMWH-AT III复合物；②反应体系中添加过量的活化凝血十因子(FXa)，FXa与LMWH-AT III复合物进一步形成LMWH-AT III-Xa复合物，与LMWH-AT III复合物结合的凝血因子将失去凝血活性；③添加定量适量的FXa显色底物S-2765，游离的FXa特异性酶解显色底物S-2765，释放出pNA基团。严格控制FXa酶解显色底物的反应时间，根据释放的pNA量即可定量肝素拮抗凝血酶的效价。

参照图1所示，本实施例中公开了一种速率反应单元，包括进样管1、4个反应试剂注入系统2、2个孵育反应管3、泵液速度为V的匀速泵系统4、定时反应管5和检测器6。反应试剂注入系统2包括用于储存反应试剂的试剂存储单元20、用于定量输出反应试剂的微量进药单元21以及用于使样品和反应试剂充分混合的混匀单元22。第1个至第4个试剂存储单元20中的反应试剂分别为AT III、凝血酶、显色底物和终止液。微量进药单元21连通于试剂存储单元20。混匀单元22连通于微量进药单元21。2个孵育反应管3依次连通于第1个至第3个混匀单元22之间。进样管1连通于第1个混匀单元22。匀速泵系统4和定时反应管5依次连通于第3个混匀单元22上。第4个反应试剂注入系统2的混匀单元22连通于定时反应管5和检测器6之间。

其中，2个孵育反应管3的长度l

l

l

其中，t

其中，定时反应管5的长度L为：

L＝V·T

其中，T为反应试剂的反应时间。

以上优化的设计，匀速泵系统4为待检测样品(如肝素等)和反应试剂提供了线性的输液速度，结合孵育反应管3和定时反应管5的特定长度，实现了精确的控制孵育时间和反应时间的目的。相互独立的反应试剂注入系统，实现了每种反应试剂进行单独储存、进药，减少了反应试剂的粘附和浪费，可以单独针对每种反应试剂所需要的温度、湿度、是否密闭等条件进行调整，精准的控制了各反应试剂的加入量和顺序，一次进样，可自动按序加入反应试剂，按序发生竞争结合反应，充分保证各反就的完成度。整个速度反应装置，极大的提高了反应结果的稳定性、可重复性，减少了实验操作差异对结果的影响，自动化程度高，操作便捷。实现了肝素抗凝血效价的自动分析功能，具有操作简单、结果准确、数据稳定等优势，可用于肝素抗Xa和抗Ⅱa的活性测定，反应中保持了各实验步骤反应试剂加入量的一致性；且凝血酶对显色底物的酶解反应实验步骤，严格控制了反应时间，保证了检测的pNA基团含量与肝素的抗凝血效价成正比关系，解决目前活性测定试剂盒手动操作复杂、稳定性差的弊端；也将进一步解决临床抗凝血分析仪器一步法分析中，检测结果不稳定的问题。

上述匀速泵系统4在具体连通时，可以连通于第3个混匀单元22和定时反应管5之间。

上述孵育反应管3和定时反应管5的材质包括但不限于聚合物、金属或者玻璃。其能够减少待检测样品、反应试剂及其生成物的吸收。孵育反应管3和定时反应管5的表面可以涂覆惰性材质涂层，以进一步减少吸收。

上述试剂储存单元20的材质包括但不限于塑料、金属或者玻璃。试剂储存单元20的表面可以涂覆不同颜色的涂层，以表示分区或起到避光作用。试剂储存单元20的形状包括但不限于瓶状、罐状、六面体状等。试剂储存单元20上设置有温度调节件，以实现反应试剂的低温存储、常温存储、37℃恒温孵育存储等。

上述匀速泵系统4包括但不限于高压恒流泵、柱塞泵、注射泵或者双动往复泵。

上述检测器6包括但不限于紫外分光检测器或者酶标仪。

实施例4

本实施例公开了一种速率反应方法，使用实施例3中的速率反应装置，具体步骤如下：

S1，吸取适量的待检测样品进入到第1个混匀单元22中；

S2，同时，第1个反应试剂注入系统2将定量的AT III注入到第1个混匀单元22中；

S3，待检测样品与AT III混匀后，在第1个孵育反应管3中经过时间t

S4，第2个反应试剂注入系统2将定量的凝血酶注入到第2个混匀单元22中；

S5，待检测样品、AT III及其生成物与凝血酶混匀后，在第2个孵育反应管中经过时间t

S6，第3个反应试剂注入系统2将定量的显色底物注入到第3个混匀单元22中；

S7，待检测样品、AT III、凝血酶及其生成物与显色底物混匀后，在定时反应管5中经过时间T后注入到第4个混匀单元22中，时间T为过量游离的凝血酶酶解显色底物释放pNA显色基团的反应时间。

在一定时间内，凝血酶的酶解反应速率成线性，释放的pNA显色基团的含量与游离凝血酶的量成正比关系，据此计算肝素的抗凝血酶效价。

S8，第4个反应试剂注入系统2将定量的终止液注入到第4个混匀单元22中，与待检测样品、AT III、凝血酶和显色底物反应体系混合均匀，终止凝血酶对显色底物的酶解作用。

S9，将待检测样品、AT III、凝血酶、显色底物和终止液的混合体系注入到检测器6中，读取405nm处的吸光度值，作为计算待检测样品抗凝血酶效价的标准数据。

上述待检测样品为肝素。

上述凝血酶为Ⅹa。

上述显色底物为S-2765。

上述终止液为2％的柠檬酸钠溶液。

实施例5

本实施例公开了一种如实施例1和实施例3所述的速率反应装置、实施例2和实施例4所述的速率反应方法在发色底物法上的应用，用于测定抗凝血酶的效价。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理能够在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。