特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原、多克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原、还涉及可特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的多克隆抗体及应用。

背景技术

PRA1蛋白属锌离子结合蛋白，真菌属白色念珠菌表达PRA1蛋白摄取环境中的锌离子供自己生长。白色念珠菌是临床上常见的致病性真菌，它可以造成局部和系统性的威胁生命的感染。PRA1主要位于白色念珠菌的表面，同时它也可以被分泌到胞外。PRA1的表达收到pH的调控，它通常在中性pH条件下表达，当pH低于6.0时，一般不表达。

在念珠菌感染期间PRA1是参与宿主-寄生虫相互作用的细胞表面蛋白。与MP65一起，代表生物膜基质的主要成分。从宿主组织中隔离锌并介导白细胞粘附和迁移。作为表面蛋白，结合两种人补体调节剂CFH和CFHR1以及纤溶酶原PLG，介导补体逃避和细胞外基质相互作用和/或降解。作为一种释放的蛋白质，增强了酵母附近的补体控制，从而产生一个额外的保护层，控制宿主补体攻击，帮助真菌逃脱宿主的监视。与宿主液相C3结合并阻断C3到C3a和C3b的裂解，导致补体活化受到抑制。还通过与另一种人补体抑制剂C4BPA结合以及通过与宿主整合素α-M/β-2结合来介导人补体控制和补体逃避。减少补体介导的粘附，以及人巨噬细胞对白色念珠菌的摄取。

甲基化作为一种增加所修饰残基特征的生物化学策略，通常被细胞用于识别和调控。提及蛋白质甲基化，本领域较为熟知的是赖氨酸或精氨酸甲基化；事实上，蛋白质组氨酸也可以发生甲基化。我们发现白色念珠菌源PRA1(Swiss-Prot：P87202)蛋白上第292位组氨酸被鉴定有甲基化修饰，并且可以由组氨酸N1位甲基化转移酶METTL9介导，由于METTL9修饰底物偏好一定的基序XHXH，第二个H是被METTL9甲基化的位点；而PRA1上就有这样的基序，通过反应，METTL9就能把甲基供体SAM上的甲基转移到白色念珠菌源PRA1上292位组氨酸的第一位的N原子上，从而达到甲基化修饰PRA1蛋白的目的。

但针对上述特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的具体功能还没有被研究，针对其特定组氨酸甲基化修饰位点的特异性抗体也没有。而目前鉴定PRA1上组氨酸甲基化的手段只能通过质谱的方式，但质谱技术要求的平台比较复杂，一般实验室不具备这样的条件；另外，质谱手段整个流程对样品的处理时间长，得出的结果也不能直观地呈现出来。

发明内容

有鉴于此，本发明有必要提供一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原，该免疫原可通过免疫动物获得一种多克隆抗体，该多克隆抗体可特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白，从而实现PRA1蛋白上特定组氨酸甲基化的鉴定，可极大地简化整个检测过程，缩短检测时间，并直观地呈现检测结果，从而推动研究特定组氨酸甲基化PRA1蛋白的功能影响以及白色念珠菌感染及抗白色念珠菌过程中PRA1特定组氨酸甲基化动态变化的发展。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明首先提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原，包括氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽。

进一步方案，所述特定组氨酸甲基化修饰的PRA1免疫原还包括载体蛋白，所述载体蛋白与所述多肽偶联；

优选地，所述载体蛋白选自血蓝蛋白。

本发明进一步提供了一种特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的多克隆抗体，采用如前所述的特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原免疫动物得到；

优选地，所述免疫采用的动物为新西兰大白兔。

本发明进一步提供了一种特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的多克隆抗体的制备方法，包括下列步骤：

提供氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽；

将所述多肽与载体蛋白偶联，获得免疫原；

采用所述免疫原免疫动物，采集血清，纯化获得多克隆抗体；

优选地，所述载体蛋白选自血蓝蛋白。

进一步方案，所述免疫动物为新西兰大白兔，所述新西兰大白兔每次免疫的时间、剂量及弗氏佐剂种类具体为：

进一步方案，所述纯化采用亲和层析纯化。

本发明进一步提供了如前所述的多克隆抗体或者所述的制备方法制得的多克隆抗体在识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白中的应用。

本发明进一步提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的检测试剂，包括如前所述的多克隆抗体或者所述的制备方法制得的多克隆抗体。

本发明进一步提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的检测试纸，包括如前所述的检测试剂。

本发明进一步提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的检测试剂盒，包括如前所述的检测试剂或包括如前所述的检测试纸。

本发明的有益效果为：

通过本发明中提供的特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原可制备得到多克隆抗体，该多克隆抗体能够高度特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白且不会识别非甲基化修饰的PRA1蛋白，从而实现快速简易地检测生物样品中PRA1特定组氨酸甲基化的变化，对研究特定组氨酸甲基化PRA1蛋白的功能影响以及白色念珠菌感染以及抗白色念珠菌过程中PRA1特定组氨酸甲基化动态变化起到巨大的推动作用。

附图说明

图1为实施例4中利用纯化多克隆抗体对第292位组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白识别的检测结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明第一方面提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原，该特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原用于制备可特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的多克隆抗体。

具体的，该特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原包括氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的多肽。

本文中所述的PRA1蛋白是指白色念珠菌源PRA1蛋白(Swiss-Prot：P87202)，所述的特定组氨酸是指白色念珠菌源PRA1蛋白中第292位组氨酸。本文中将包含了这个第292位组氨酸的白色念珠菌源PRA1蛋白的非甲基化肽段，命名为多肽1，其氨基酸序列为：ANSHCHT

在该实施例方式中，PRA1蛋白第292位组氨酸甲基化修饰均是由组氨酸N1位甲基化转移酶METTL9介导获得的，具体方法可参见申请人研究论文METTL9 mediated N1-histidine methylation of zinc transporters is required for tumor growth.M Lvet.Protein&Cell.2021。

利用包括上述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽2的特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白免疫原免疫免疫动物后得到的多克隆抗体，能够特异性地识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白并不会识别非甲基化修饰的PRA1蛋白，可实现特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的快速鉴定。

进一步的，本文中特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白还包括载体蛋白，该载体蛋白与多肽2偶联，从而有利于刺激辅助性T细胞，进一步诱导B细胞免疫反应。具体的，所述的载体蛋白可以选自本领域中常规采用的载体蛋白，优选的，载体蛋白选自血蓝蛋白(KLH)或牛血清蛋白(BSA)，更优选地，所述载体蛋白选自血蓝蛋白。

本发明第二方面提供了一种特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的多克隆抗体，采用如前所述的特定组氨酸甲基化修饰的PRA1免疫原免疫动物得到，其中，免疫采用的动物可以是兔或鼠，优选的，动物采用兔，在本发明的一个或多个实施例中，采用的免疫动物为新西兰大白兔。

本发明第三方面提供了一种特异性识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的多克隆抗体的制备方法，该制备方法包括步骤S101-步骤S105。

步骤S101、提供PRA1蛋白特定组氨酸甲基化修饰的多肽。

具体的，人工合成多肽2，得到特定组氨酸甲基化修饰的多肽，其氨基酸序列为ANSHCHT

步骤S102、将特定组氨酸甲基化修饰的多肽与载体蛋白偶联，获得免疫原。

具体的，通过蛋白偶联技术，将步骤S101中的多肽2与载体蛋白偶联，更具体的，首先将载体蛋白进行活化，然后将活化后的载体蛋白与多肽2混合反应，并透析过夜，获得免疫原；优选地，载体蛋白的选择与本发明第一方面所述的类似，这里不再具体阐述。

步骤S103、采用所述免疫原免疫动物。

具体的，在其中一个实施例中，免疫采用的动物为新西兰大白兔，用步骤S102中获得的免疫原多次免疫新西兰大白兔，新西兰大白兔的选择要求体重在2.5kg左右青壮年，毛色光泽且活动自如的健康动物，挑选好的动物预养2周左右，从而淘汰不合格的动物，保证后续实验的顺利进行；在其中一个实施例中，免疫原是通过将其与佐剂混合后注射入动物体内，从而增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型，佐剂的种类有很多，在本发明的一个实施例中，采用目前动物试验中最常用的弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，作为优选，在其中一个实施例中，佐剂与免疫原的体积比为1：1，每次免疫的时间、剂量及弗氏佐剂种类具体为：

采用多点皮下免疫的方式，可以理解的是，免疫的部位包括但不限于背部皮下、腹部皮下、腋窝皮下或四肢皮下。

步骤S104、从免疫后的动物中采集血清测定抗体效价。

具体的，在免疫结束后首先采血进行Elisa检测测定血清中是否含有相应抗体和抗体的效价是否达到标准，其中，血清的采集采用本领域中的常规方法即可。

步骤S105、检测效价达到标准后，取血进行抗体纯化。

具体的，在其中一个实施例中，本发明中的抗体纯化优选为亲和层析纯化，首先采用含有对应特定组氨酸甲基化修饰的肽段(多肽2)进行初步纯化，随后用对应的包含非甲基化修饰的相同肽段(多肽1)进行二次纯化去除识别包含非甲基化修饰的肽段的抗体；纯化后的抗体进行Elisa检测鉴定。

在一些具体的实施方式中，所述纯化具体步骤为：对亲和层析柱进行预处理，然后将含有多克隆抗体的血清加入预处理的亲和层析柱中上样，洗脱液洗脱。

在一些具体的实施方式中，Elisa检测具体包括如下步骤：

①特定组氨酸甲基化修饰的多肽包被酶联板，洗板；

②封闭经包被的酶联板，温育，弃封闭液；

③加纯化得到的多克隆抗体，温育，弃封闭液，洗板；

④加酶标二抗，温育，弃封闭液，洗板；

⑤加底物液显色，终止反应后读板。

待测多克隆抗体样品按照一定的比例稀释，在本发明的一个或多个实施例中，按照1:250到1:1024000比例进行稀释。

实验结果显示，本发明所述制备方法制备得到的多克隆抗体，在1：250稀释的情况下抗体效价在1以上，Elisa检测值2.4左右，高于1的阳性标准。

本发明第四方面提供了本发明中第二方面所述的多克隆抗体或本发明第三方面所述的制备方法制得的多克隆抗体在识别特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白中的应用，具体的说，本发明中获得的多克隆抗体可应用于Westernblot，亦或免疫荧光、免疫组化、流式检测、ELISA试剂盒等用于检测特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白，从而实现快速简易地检测生物样品中PRA1特定组氨酸甲基化的变化，对研究特定组氨酸甲基化PRA1蛋白的功能影响以及特定生命活动或白色念珠菌侵染定植过程中PRA1特定组氨酸甲基化动态变化起到巨大的推动作用。

本发明第五方面提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的检测试剂，包括如本发明第二方面所述的多克隆抗体或者第三方面所述的制备方法制得的多克隆抗体。

本发明第六方面提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的检测试纸，包括如本发明第五方面所述的检测试剂。

本发明第七方面提供了一种特定组氨酸甲基化修饰的PRA1蛋白的检测试剂盒，包括如本发明第五方面所述的检测试剂或包括如本发明第六方面所述的检测试纸。

可以理解的是，具体的检测试剂盒中还可以包括本领域常规的稀释液、转化液、缓冲液、洗涤液、洗脱液和纯化液等试剂，这里不再具体阐述。

下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。

实施例1多肽的制备

委托杭州华安生物技术有限公司合成以下多肽：

氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽，命名为多肽1；

氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的多肽，命名为多肽2。

实施例2第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1蛋白免疫原的制备

通过蛋白偶联技术，将实施例1中多肽2与血蓝蛋白(KLH)偶联，得到第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1免疫原，具体步骤如下：

1、多肽2偶联KLH

(1)将20mg KLH溶于2mL，5mM的EDTA水溶液中；

(2)称取8mg Sulfo-SMCC完全溶于50μL DMSO中，之后加入150μL 1×PBS，混合均匀；

(3)将Sulfo-SMCC溶液逐滴加入到KLH溶液中，边加边轻轻摇晃，室温放置1h；

(4)将上述活化好的KLH溶液放入透析袋中，透析夹夹好，于2L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析1h；

(5)更换新的1×PBS透析2h，重复一次；将活化透析好的KLH置于15mL进口离心管中，并在管上标记上试剂名称、时间和浓度，4℃冰箱保存；

(6)称取4mg多肽2，溶于50μLDMSO中，再加入200μL的1×PBS，快速混匀，随后按照多肽：KLH＝1mg：680μg的比例立即加入KLH，4℃冰箱过夜或者室温下反应2h；

(7)将上述交联好的KLH-peptide交联复合物放入透析袋中，透析夹夹好，于4L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析过夜；

(8)将透析好的KLH-peptide取出到干净的1.5mL离心管中，按照免疫剂量进行分装，-20℃冰箱保存。

2、多肽2偶联载体蛋白BSA(将多肽2偶联BSA，用于后期纯化抗体和抗体检测)

(1)将20mg BSA溶于2mL 5mM的EDTA水溶液中；

(2)称取5mg Sulfo-SMCC完全溶于50μL DMSO中，之后加入150μL 1×PBS，混合均匀；

(3)将Sulfo-SMCC溶液逐滴加入到BSA溶液中，边加边轻轻摇晃，室温放置1h；

(4)将上述活化好的BSA溶液放入透析袋中，透析夹夹好，于2L的1×PBS中，4℃冰箱磁力搅拌下透析1h；

(5)更换新的1×PBS透析2h，重复一次。将活化透析好的BSA置于15mL进口离心管中，并在管上标记上试剂名称、时间和浓度，4℃冰箱保存；

(6)称取1mg多肽2，溶于50μL的DMSO中，再加150μL的1×PBS，快速混匀，随后加入100μL上述活化好的BSA溶液，4℃冰箱过夜或室温下反应2h；

(7)将上述交联好的BSA-Peptide交联复合物于1.5mL离心管中，加1×PBS至1mL，标记好项目号、浓度和日期，交于检测组。

实施例3特异性识别第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1蛋白的多克隆抗体的制备

动物免疫：

将实施例2中的第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1免疫原从-20℃冰箱中拿出，常温溶解，避免反复冻融，并将注射器做好标记；根据表1中的配置，按照佐剂和第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1免疫原的体积比为1：1抽取佐剂，充分乳化，乳化标准为：乳化好的免疫原滴入37℃水中不分散为合格。

初次免疫前，将所有新西兰大白兔进行编号，首免抗原浓度为1mg/mL，兔子为0.5mL/只，二免-四免抗原量减半，按照表1中所述的具体时间和剂量进行免疫，免疫时采用多点皮下注射，每点为0.2mL；兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。

表1免疫次数、时间和剂量

抗体效价检测：

在进行过三次免疫后对血清中是否含有相应抗体和抗体的效价是否达标进行Elisa检测，具体步骤如下：

(1)包板：用包被缓冲液(coating buffer:Na

(2)封闭：每孔加150μL的1％ BSA(PBST配制)进行封闭，置37℃孵育1小时，之后弃封闭液；

(3)加样：把待检样品按照一定的比例(稀释比例见表2)进行稀释，取稀释后的按抗体50μL于上述已封闭的反应孔，同时设置好阴性对照孔(PBS)，置37℃孵育1小时，之后弃封闭液，用1xPBST洗涤缓冲液以每孔150μl洗3次；

(4)加酶标抗体：将新鲜稀释的二抗-HRP(1:5K，用1％BSA进行稀释)，以50μL/孔加入酶标板孔中，置37℃孵育45min，之后弃封闭液，用1xPBST缓冲液以每孔150μl洗3次；

(5)加底物液显色，读板：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液50μl，置37℃反应5min，于各反应孔中加入1M硫酸50μL终止反应，将酶标板置于预热过的酶标仪中(450nm)进行读数，结果见表2。

表2血清抗体效价检测结果

注：表2中1#、2#为编号为RB2666的兔子平行测试，3#、4#为编号RB2665的兔子平行测试。

抗体纯化：

抗体的效价符合标准后，7天后加免，加免完7天后可采集全血，进行抗体纯化，具体步骤如下：

(1)将亲和层析柱依次用20mL纯水和1×PBS(pH7.4)，流速70mL/h充分清洗；

(2)取待纯化的血清10mL于50mL离心管中，用孔径0.45μm，直径25mm微孔滤膜抽滤；

(3)将抽滤过的血清样品以40mL/h流速上样，重复一次；

(4)用20mL 1×PBS(pH7.4)以70mL/h的流速清洗柱子，10min后连接蛋白检测仪，清洗过程中调节仪器透光率(T档)示数为100；

(5)调节蛋白检测仪吸光率(1A档)示数为0，此时打开电脑桌面的HD-A电脑采集器，并将满屏量程调到5，用甘氨酸溶液(pH 2.7，0.2M)以40mL/h的速度洗脱抗体，此时按下绿色的洗脱记录按钮开始洗脱，当仪器的示数开始升高时开始收集抗体；

(6)在抗体收集过程中以1M的碳酸氢钠及时调节抗体的pH值至7左右，并记录洗脱峰的最高峰值；

(7)抗体收集完后，调节pH值至7左右，并记录洗脱的抗体体积，之后用纯净水冲洗连接收集器的橡胶管；

(8)依次用20mL 1×PBS和纯水以70mL/h的速度清洗亲和层析柱，之后加入20％乙醇，封口，4℃冰箱保存；

(9)纯化后的抗体根据不同要求送检，甲基化抗体在纯化的时候，血清先过甲基化柱子，洗脱下来的抗体再过非甲基化柱子，以得到特异性的甲基化抗体，其它修饰类型的抗体纯化类似，并进行Elisa检测，结果见表3。

表3纯化抗体效价检测结果

注：表3中1#、2#为编号为RB2666的兔子平行测试，3#、4#为编号RB2665的兔子平行测试。

成品抗体浓度检测：

(1)待纯化够交货的抗体量之后，并且半成品检测效价合格，将所有抗体混合，用超滤浓缩管进行浓缩，达到一定的浓度和体积；

(2)将浓缩好的抗体置于1L 0.01M PBS(pH7.4)中室温透析，每隔3h换液一次，共计换液3次(过夜透析则放在2-8℃冰箱中)；

(4)将透析好的抗体取出至干净的离心管，在超净工作台中将抗体用0.22um的一次性低吸附滤头过滤，取小样送检，另取5ul检测浓度；

(5)在超微量分光光度计(denovix DS-11)的Protein A280应用上检测浓度。

经过检测，体积分别为0.5mL(RB2666)、0.15mL(RB2665)的抗体，其抗体浓度分别为0.33mg/mL(RB2666)、3.24mg/mL(RB2665)。

实施例4第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1蛋白的鉴定

采用GST标签体外纯化白色念珠菌源PRA1蛋白，获得未甲基化的GST-PRA1融合蛋白；

利用组氨酸N1位甲基化转移酶METTL9，在体外反应得到第292位组氨酸甲基化修饰的GST-PRA1融合蛋白，即H292位被甲基化修饰的蛋白GST-PRA1 H292me；

采用实施例3中制备的纯化多克隆抗体进行Western blotting检测，检测结果如图1中所示的，其中，GST和GST-PRA1分别代表GST和PRA1的水平，h代表human，hMETTL9和hMETTL9 mutant分别代表组氨酸N1甲基化转移酶METTL9有酶活和酶活缺失的蛋白水平。H292me代表PRA1第292位组氨酸甲基化水平(RB2665号兔子纯化的抗体进行检测)。根据图1中的检测结果可以看出，实施例3中制备的多克隆抗体可以识别第292位组氨酸甲基化修饰的PRA1而不能识别非甲基化修饰的PRA1。

由此可知，本发明中提供的免疫原能够制备得到高度特异性识别第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1蛋白的多克隆抗体，且该多克隆抗体不会识别非甲基化修饰的PRA1蛋白，可广泛用于免疫组化、Westernblot、免疫银光、流式检测、体外免疫分析等，实现快速简易地检测生物样品中PRA1特定组氨酸甲基化的变化，推动研究特定组氨酸甲基化PRA1蛋白的功能影响以白色念珠菌感染及抗白色念珠菌过程中PRA1特定组氨酸甲基化动态变化的发展。

且本发明中的多克隆抗体的制备方法操作简单，可用于特异性识别第292位组氨酸甲基化修饰的白色念珠菌源PRA1蛋白的抗体大量制备。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。