一种碱性磷酸酶在制备防治腹膜纤维化透析液中的应用

技术领域

本发明涉及腹膜透析技术领域，更具体的说是涉及一种碱性磷酸酶在制备防治腹透后腹膜纤维化透析液中的应用。

背景技术

腹膜透析是终末期肾脏病有效的肾替代治疗方法之一，目前，全球约有11％肾脏替代治疗患者选择腹膜透析方式。近十年来，我国接受腹透透析患者数量增长了4倍，是我国终末期肾病患者最重要的透析方式之一。

腹膜透析依赖于完整的腹膜结构和功能。然而，长期腹膜透析常常会引起腹膜形态和功能改变，一旦进展至严重腹膜纤维化，患者将出现透析不充分或超滤失败，导致腹透技术失败。含糖腹膜透析液的使用是促进腹膜纤维化的重要因素。目前，国内外的商品化腹膜透析液均为含糖透析液。因此，通过药物干预阻断腹膜透析相关腹膜纤维化疾病进展，对改善患者远期预后，提高腹膜透析质量，具有重要的临床意义。

炎症反应和腹膜间皮细胞上皮-间充质转化(EMT)是腹膜纤维化发生机制中最重要的两个环节。EMT主要表现为腹膜间皮细胞发生间充质样细胞形态学改变，迁移能力增强，细胞间连接受到破坏，细胞外基质明显增加。其中，转化生长因子β(TGF-β)是调控腹膜纤维化EMT过程的关键因子。炎症反应主要由腹腔巨噬细胞活化后介导。腹腔巨噬细胞主要分化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞。M2型巨噬细胞可分泌TGF-β1等诱导腹膜纤维化，而M1型巨噬细胞可通过激活TLR4信号通路直接诱导腹膜间皮细胞向成纤维细胞转化。腹膜透析时的含糖透析液可诱导以上炎症反应和EMT，导致腹膜纤维化的发生。

因此，如何开发一种理想的药物方案防治腹透后腹膜纤维化是本领域人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种碱性磷酸酶在制备防治腹透后腹膜纤维化透析液中的应用，以解决现有技术中的不足。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种碱性磷酸酶在制备防治腹透后腹膜纤维化透析液中的应用。

进一步，上述碱性磷酸酶为组织特异性碱性磷酸酶。

更进一步，上述组织特异性碱性磷酸酶为肠型碱性磷酸酶。

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠道、肾脏和胎盘等组织的单磷脂水解酶，由两个亚单位组成，包含四种同工酶，主要分为组织非特异性ALP和组织特异性ALP。组织非特异性ALP主要表达于肝脏、肾脏和骨组织；组织特异性ALP包括肠型碱性磷酸酶(IAP)、胎盘碱性磷酸酶和生殖细胞碱性磷酸酶。ALP能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。一方面，ALP能通过对脂多糖等病原体相关分子模式(PAMPs)去磷酸化，阻断TLR4路径的巨噬细胞激活而发挥抑炎作用；另一方面，在缺氧和炎症状态下，ALP能把ATP转换成终产物腺苷，后者与巨噬细胞等炎症细胞上的A2A腺苷受体结合，进而发挥抑制炎症和组织保护作用。

临床研究发现，静脉注射组织非特异性的ALP治疗脓毒血症相关急性肾损伤，患者的肾功得到改善，体内炎症水平也显著降低。给冠状动脉搭桥的患者静脉注射ALP，治疗组患者体内炎症细胞因子(IL-6、IL-8和TNF-α)水平明显低于对照组。此外，新近研究发现，在过表达IAP的转基因大鼠模型中，其肠道对LPS及脂质的吸收减少，进而改善动脉粥样硬化；另一项研究发现IAP可以修复衰老相关的肠道屏障功能减退，抑制血清中炎症因子IL-6、IL-1β和TNFα水平，改善年老小鼠代谢状态，提高生存率。

因此，基于碱性磷酸酶抑制巨噬细胞炎症反应的作用，把碱性磷酸酶应用于制备防治腹膜纤维化的透析液，可能为腹膜透析后腹膜纤维化的防治带来新的希望。

ALP目前已进入到II期临床试验用于治疗重症脓毒血症导致的急性肾损伤。ALP分子量为56KDa，由两个单体组成，每个单体由449个氨基酸构成，并分别具有一个活性中心，其活性中心区域由天冬氨酸(Asp)101-丝氨酸(Ser)102-丙氨酸(Ala)103三连体、精氨酸(Arg)166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。完整的ALP分子呈α/β拓扑结构。ALP大部分经肝脏从胆汁排出。

本发明首次创新性把碱性磷酸酶加入常规腹透液中，制备具有抗腹膜纤维化作用的透析液，通过动物实验证实这种新型透析液可显著减轻高糖腹透液诱导的小鼠腹膜巨噬细胞浸润及腹膜纤维化。这些证据表明，应用碱性磷酸酶制备的腹膜透析液可有效防治腹膜透析纤维化。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1、本发明首次证实应用碱性磷酸酶制备具有抗腹膜纤维化腹透液，可通过抑制腹膜巨噬细胞浸润，抑制巨噬细胞协同腹膜间皮细胞EMT过程，从而发挥防治腹膜纤维化的作用，有望应用于临床提高腹透患者的技术生存率。

2、碱性磷酸酶为内源性可合成物质，与成品腹透液和人体相容性好，副作用轻微。加入腹透液中腹腔局部用药，仅少量吸收入血，对全身影响小。

3、本发明含有碱性磷酸酶的腹透液制备相对简单，使用方便。使用前把配制好的碱性磷酸酶加入成品腹膜透析液中，在腹膜透析治疗时一起留腹即可，不需额外口服或注射。

附图说明

图1为含碱性磷酸酶腹膜透析液的碱性磷酸酶酶活性(A)及含碱性磷酸酶腹透液在小鼠腹腔灌注治疗时血清碱性磷酸酶酶活性(B)依时变化曲线。

图2为不同治疗组小鼠在药物腹腔治疗6h的血清碱性磷酸酶酶活性比较。其中，Control：阴性对照组；Model：高糖模型组；IAP ip：碱性磷酸酶腹腔灌注组；IAP ig：碱性磷酸酶灌胃治疗组。

图3为含碱性磷酸酶透析液腹腔灌注治疗组与其他组小鼠腹膜病理染色结果及纤维化指标对比。其中，Control，阴性对照组；Model，高糖模型组；IAP ip，碱性磷酸酶腹腔灌注组；IAP ig，碱性磷酸酶灌胃治疗组。

图4为含碱性磷酸酶腹透液治疗组与其他组小鼠腹膜巨噬细胞免疫荧光比较。其中，Control，阴性对照组；Model，高糖模型组；IAP ip，碱性磷酸酶腹腔灌注组；IAP ig，碱性磷酸酶灌胃治疗组。F4/80+CCR7+标记为M1巨噬细胞；F4/80+CD206+标记为M2巨噬细胞。

图5为体外实验碱性磷酸酶对M1巨噬细胞与间皮细胞共培养24h间皮细胞形态变化及纤维化指标的影响。其中，LPS，脂多糖；IAP，肠型碱性磷酸酶。

图6为碱性磷酸酶对LPS刺激下巨噬细胞炎症细胞因子IL-6(A)和TNF-α(B)分泌的抑制作用。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1通过动物实验证实碱性磷酸酶的抗腹膜纤维化作用和体外实验证实其抗纤维化机制

1、材料和方法

1)实验材料来源

表1实验材料来源

2)含碱性磷酸酶的抗腹膜纤维化透析液的制备

将肠型碱性磷酸酶溶于甘油水溶液后加入4.25％腹膜透析液中，配成浓度150U/mL的含碱性磷酸酶腹透液，动物实验时均在治疗前新鲜配备。

3)动物实验小鼠腹膜纤维化模型和实验分组

予SPF级C57BL/6小鼠腹腔注射4.25％浓度的高糖腹透液建立腹膜纤维化模型。所有动物实验均符合中山大学实验动物伦理要求。

①高糖模型组(n＝6)：腹腔注射100mL/kg的4.25％高糖腹透液，每天一次，持续28天。

②高糖+IAP腹腔灌注组(n＝6)：腹腔注射100mL/kg的4.25％高糖腹透液+300IUIAP，每天一次，持续28天。

③阴性对照组(n＝6)：腹腔注射等剂量的生理盐水，每天一次，持续28天。

4)体外实验细胞培养和处理

①人巨噬细胞诱导分化：THP-1人单核细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)、10U/mL青霉素和10μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，以1×10

②人巨噬细胞鉴定：

I.相差显微镜下观察：THP-1细胞分化为M0巨噬细胞后，细胞贴壁，同时细胞体积增大，伸出触足；M1巨噬细胞的细胞体积较M0巨噬细胞进一步增大，触足伸长。

II.表面标志物检测：流式细胞术检测M0巨噬细胞标志物CD11b和CD14；qPCR检测M1巨噬细胞标志物iNOS、CXCL10、IL-6和TNFα。

③人M1巨噬细胞与腹膜间皮细胞株(HMrSV5)共培养：M1巨噬细胞接种于六孔板中，HMrSV5细胞用无血清DMEM培养基洗涤一次，以每孔1×10

镜下观察腹膜间皮细胞在不同时间点的形态变化，并收集细胞上清及细胞进行检测。

5)腹膜形态及纤维化定性观察

Masson染色：将腹膜组织放入PLP液中固定4h，常规脱水及石蜡包埋处理，切片脱蜡至水，浸入Bouin氏固定液中室温过夜，流水冲洗去除玻片上的黄色染液，Weigert氏铁木素染5min，流水冲洗5min，Biebrich Scarlet酸性溶液染5min，蒸馏水洗涤，磷钼酸染5min，苯胺蓝溶液染20min，1％醋酸溶液处理2min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

HE染色：固定、脱水包埋及切片脱蜡至水同Masson染色，苏木素染色5min，1％盐酸酒精20s，自来水冲洗至细胞核变蓝而胞浆无蓝色，伊红染色1-2min至胞浆呈粉红色，自来水冲洗洗去多余的红色，过蒸馏水，梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

6)Western Blot

将腹膜组织从-80℃冰箱中取出绿豆大小组织，加入200μL蛋白裂解液，研磨机研磨，12000rpm×15min，4℃，取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度，加入2×loading buffer并100℃煮沸5-10min使蛋白变性。取8％-16％梯度胶，加样，电泳，电泳结束后湿法电转移至PVDF膜，100V×90min。转膜结束后取出PVDF膜，放入TBST液中洗涤，10min×2次，5％脱脂牛奶室温封闭1h。TBST液洗涤，10min×2次，加入一抗稀释液(1:1000)，4℃过夜孵育。TBST液洗涤，10min×2次，加入二抗稀释液(1:5000)，室温孵育1h，10min×3次。ChemiScope6200Touch发光成像系统曝光及灰度分析。

7)免疫荧光检测

固定、脱水包埋及脱蜡至水同Masson染色，放入抗原修复液中高压锅抗原修复8h，3％BSA液室温封闭1h。抗体用1％BSA配制，加入一抗稀释液(1：50)，湿盒中4℃过夜。PBS洗涤2次，加入荧光二抗稀释液(1:500)，室温1h。PBS洗涤3次，加入DAPI(1:500)染5min，PBS洗涤2次。抗荧光淬灭剂封片，通风橱中吹干，保存于-80℃，激光共聚焦显微镜拍照。

8)酶联免疫吸附检测

酶联免疫吸附(ELSIA)检测，按照制造商建议的流程和条件进行。

9)统计学分析

应用GraphPad Prism 7及SPSS 25进行统计学处理，使用单因素方差分析进行组间比较，P<0.05则认为具有统计学意义。

2、结果

1)本发明制备的抗腹膜纤维化透析液中的碱性磷酸酶活性变化及治疗时碱性磷酸酶活性体内代谢情况

本发明制备的含碱性磷酸酶透析液保持稳定的酶活性是发挥其抗腹膜纤维化作用的前提。实验前对本发明制备的抗腹膜纤维化透析液进行酶活性的监测，结果如图1中的A所示。由图1中的A可知，本发明制备的抗腹膜纤维化腹透液中碱性磷酸酶的活性可保持稳定长达6-8h，即使在24h时，其活性仍能保持60％以上。而临床上患者使用腹膜透析液治疗时，每次交换腹透液在腹腔中留腹时间为4-6h。由此可见，本发明制备的抗腹膜纤维化透析液的碱性磷酸酶的稳定活性可满足临床治疗时间上的需求。

本发明制备的抗腹膜纤维化腹透液在小鼠腹腔灌注治疗过程中时血清碱性磷酸酶酶活性的依时变化如图1中的B所示。由图1中的B可知，与腹膜透析液中酶活性的变化对比，血清中碱性磷酸酶酶活性在2h时达峰后迅速下落，6h时仅为腹透液中酶活性的2％。即使在2h峰值时，血清的酶活性也仅为腹透液中酶活性的15％。

本发明制备的抗腹膜纤维化腹透液腹腔治疗6h的血清碱性磷酸酶酶活性与其他对照组的比较如图2所示。由图2可知，本发明制备的腹透液中的碱性磷酸酶被吸收入血的量较小，并迅速代谢。可推测其主要作用在腹腔局部，对全身影响小，是较理想的腹腔局部治疗模式。

2)本发明制备的抗腹膜纤维化透析液抑制高糖腹透液诱导的小鼠腹膜纤维化进展

通过每天予小鼠腹腔注射4.25％高糖腹透液2mL，4周后成功建立C57BL/6小鼠腹膜纤维化模型，结果如图3所示。由图3可知，HE染色和Masson染色可见高糖模型组小鼠壁层腹膜下区域显著增厚，纤维组织增多，伴有大量炎症细胞浸润。与高糖模型组相比，使用本发明制备的抗腹膜纤维化透析液腹腔治疗组(IAP腹腔灌注组)小鼠的腹膜厚度、纤维化程度和炎症浸润均显著较轻。腹膜纤维化的指标TGF-β1和Collagen-I表达低于高糖模型组，而代表上皮完整性的E-cadherin明显高于高糖模型组。以上结果表明，使用本发明制备的含碱性磷酸酶腹透液腹腔灌注治疗，可有效抑制高糖腹透液诱导的小鼠腹膜间皮细胞EMT过程，发挥抗腹膜纤维化的作用。

3)IAP腹腔灌注抑制高糖腹透液诱导的小鼠腹膜巨噬细胞浸润

腹膜巨噬细胞浸润及其介导的炎症反应，是腹膜纤维化过程的重要环节。在上述动物模型中，进一步采用免疫荧光检测各组小鼠脏层腹膜中巨噬细胞的浸润情况，结果如图4所示。由图4可知，使用本发明制备的抗腹膜纤维化透析液腹腔治疗组(IAP腹腔灌注组)小鼠腹膜组织中的M1型(F4/80+CCR7+)巨噬细胞(图4中的A)和M2型(F4/80+CD206+)巨噬细胞(图4中的B)浸润均较高糖模型组显著减轻。以上结果表明IAP腹腔灌注能抑制小鼠腹膜巨噬细胞浸润。因此，本发明制备的透析液对腹膜巨噬细胞浸润的抑制作用，可从机制上说明本产品发挥抗腹膜纤维化的重要药理作用。

4)体外实验碱性磷酸酶抑制M1巨噬细胞诱导的腹膜间皮细胞EMT过程

既往研究发现，M1型巨噬细胞与腹膜间皮细胞共培养时，可诱导腹膜间皮细胞的EMT改变，及腹膜纤维化相关标记物表达上调。因此，本发明在体外细胞实验中进一步观察肠型碱性磷酸酶对人M1型巨噬细胞与人腹膜间皮细胞共培养的影响，结果如图5所示。由图5可知，共培养24h后，阴性对照组及LPS刺激组腹膜间皮细胞大部分呈现明显的成纤维样形态学改变，而使用碱性磷酸酶处理组腹膜间皮细胞改变不明显，腹膜纤维化的标记物(TGF-β1和Fibronectin)明显下调。这些结果说明碱性磷酸酶可抑制M1巨噬细胞协同腹膜间皮细胞EMT过程。

5)碱性磷酸酶抑制LPS刺激的巨噬细胞炎症细胞因子分泌

已有研究证实炎症细胞因子，特别是IL-6，对腹膜纤维化进展具有重要作用。本发明在体外细胞实验中发现，碱性磷酸酶处理组巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α炎症细胞因子显著低于LPS刺激(图6中的A和图6中的B)。该结果表明碱性磷酸酶可抑制巨噬细胞炎症细胞因子分泌，可能通过此机制进一步发挥抗腹膜纤维化作用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。