TIMP1基因剪接异常TIMP1-S及其应用

技术领域

本发明涉及生物、医学领域，具体地，本发明涉及一种TIMP1基因剪接异常的mRNA：TIMP1-S或TIMP1-L，以及它们的应用。

背景技术

结直肠癌是严重影响人类健康的恶性肿瘤之一。中国是结直肠癌的m高发地区，每年新增结直肠癌病例数约占全球发病总数的30%。最新统计结果显示，2020年我国结直肠癌新增病例超过55.6万，致死约32万例，严重危害国民健康。目前，我国结直肠癌早期诊断率不到20%，大多数患者诊断时已经处于进展期，有的甚至发生了远端转移, 其5年生存率仅为14%。尽管经历了长期的研究，但是结直肠癌的发生发展机制仍未完全明确，以至于结直肠癌患者的临床治疗仍然面临巨大挑战。因此，发现和鉴定结直肠癌癌发生和进展的分子，研究其与结直肠癌发生、临床转归和预后等之间的关系，不仅有助于阐明结直肠癌形成的病理机制，而且对于结直肠癌新的防、诊、治措施的研发有着极为重要的意义。

可变剪接（Alternative Splicing, AS）是指pre-mRNA在剪接因子与剪接体的共同作用下，去除内含子，生成成熟mRNA的过程。据报道，90%以上的基因pre-mRNA存在着可变剪接，大大扩大了蛋白质多样性。生物体能够通过RNA的可变剪接对不同剪接转录本的表达进行实时调控，从而进一步对内环境以及外环境作出时间空间上的特异性应答。在肿瘤发生发展过程中往往存在着异常的可变剪接，从而导致促癌异构体的表达增加，同时减少抑癌异构体的表达。可变剪接可以通过多种生物学途径，包括血管生成，侵袭及迁移，免疫逃逸以及能量代谢等调控肿瘤的生物学行为。

新型基因编辑工具Cas13蛋白（VI 型）在其指导RNA（guide RNA）的辅助下，靶向结合特异序列单链RNA，可特异性地编辑或降解细胞内的RNA。与DNA编辑技术相比，RNA编辑不改变编码基因本身（DNA碱基改变后不能逆转），在时间上、空间上和效率上更加可控。同时，RNA编辑可以同时修改多个基因、同时靶向多拷贝基因的所有转录产物，所以更加高效。在对疾病的基因治疗领域，利用RNA编辑技术靶向基因pre-mRNA，调节或改变该其剪接模式，诱导产生新的功能性蛋白质异构体，具有重要的应用价值。

TIMP1 作为一种内源性金属蛋白酶抑制因子，在肿瘤微环境的重塑，上皮间质转化，细胞运动及衰老等方面发挥重要的作用。TIMP1在乳腺癌、胰腺癌、胃癌、结直肠癌等多种肿瘤中表达量异常升高，而其详细的机制尚不明确。同时，相关报道显示血液中TIMP1的水平可作为包括结直肠癌、乳腺癌及胶质母细胞瘤等多种肿瘤的诊断及预后标志物。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种TIMP1基因剪接异常的mRNA，以及它们在医药或生物方面的用途。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种mRNA，它为TIMP1-S或TIMP1-L，其中所述TIMP1-S具有如SEQ ID NO. 5所示的碱基序列， 所述TIMP1- L具有如SEQ ID NO. 6所示的核苷酸碱基序列。

本发明提供了一种TIMP1-S或TIMP1-L在制备治疗或预防癌症的药物方面的用途。

本发明中所指的癌症优选为结直肠癌。

本发明提供了一种含有TIMP1-S或TIMP1-L基因序列的重组表达载体。相关重组表达载体优选为质粒、慢病毒或干细胞。

本发明提供的含有TIMP1-S或TIMP1-L基因序列的重组表达载体可用于过表达TIMP1-S或者抑制表达TIMP1-L。

本发明提供了一种特异性促进TIMP1基因可变剪接的sgRNA，它用以提高TIMP1-S的表达水平或者降低TIMP1-L的表达水平，其核苷酸碱基序列包括SEQ ID NO.1-4所示的核苷酸碱基序列的任意一种或几种。

本发明提供了一种用于检测TIMP1-S或TIMP1-L表达量的试剂，它用以检测TIMP1-S或TIMP1-L的表达量，或者用以将TIMP1-L和TIMP1-S的表达量比值作为生物标志物。

本发明提供了一种本发明提供了一种用于检测TIMP1-S或TIMP1-L表达量的试剂盒，它用以检测TIMP1-S或TIMP1-L的表达量，或者用以将TIMP1-L和TIMP1-S的表达量比值作为生物标志物。

本发明提供了一种用于过表达TIMP1-S或者抑制表达TIMP1-L的药物或试剂，该药物或试剂具有治疗或预防癌症的潜在应用价值。

本发明提供了一种用于促进TIMP1基因的剪接的试剂，该试剂具有制备药物的用途，特别是用于治疗或预防结直肠癌的药物。

本发明可以包括一种药物，它用于下列的至少之一：促进癌细胞的抑癌亚型TIMP1-S基因表达升高，抑制结直肠癌细胞的生长，抑制癌细胞的迁移和侵袭。

我们进行了全转录组水平的可变剪接分析，通过多种算法和分析软件系统的分析结直肠癌组织中差异表达的剪接事件，进一步在独立结直肠癌样本队列中利用荧光定量PCR，发现了在结直肠癌样本中特异性剪接的基因TIMP1。

我们发现，TIMP1基因有两个亚型，分别为TIMP1-L和TIMP1-S。其中TIMP1-L是正常剪接的亚型，含有6个外显子；TIMP1-S是发生异常剪接的亚型，含有4个外显子。我们将外显子不发生跳跃的亚型定义为TIMP1 -L，发生外显子跳跃的亚型定义为TIMP1-S。发明人在研究中发现，TIMP1-S具有抑制癌细胞生长的作用，而TIMP1-L具有促进癌细胞生长的作用。TIMP1基因的可变剪接可将TIMP1-L变为TIMP1-S。因此，通过促进TIMP1基因的剪接，可以促进TIMP1-L型向TIMP1-S型转变，从而抑制癌细胞生长，起到治疗或预防癌症的目的。

本发明中的促进TIMP1的可变剪接是通过CRISPR-dCas13实现的。

本发明还提供了特异性促进TIMP1基因可变剪接的sgRNA，其中sgRNA的序列包括SEQ ID NO.1-4所示的序列的任意一种或几种(如表1)。

表1 2条靶向TIMP1可变剪接的sgRNA序列

本发明提出了TIMP1基因剪接异常作为癌细胞生物标志物的用途。发明人发现，肿瘤细胞中TIMP1-L表达明显高于癌旁正常组织，而TIMP1-S表达明显低于癌旁正常组织，TIMP1-L和TIMP1-S的比值可作为区分正常细胞和癌细胞的生物标志物。

本发明提出了检测TIMP1-L和TIMP1-S表达量的试剂在制备试剂盒中的用途，特别是提出了用于检测权利要求1所述的TIMP1-S或TIMP1-L表达量的试剂或试剂盒。根据本发明的实施例，相关试剂或试剂盒可用于判断样本来源于正常细胞或癌细胞。癌细胞中TIMP1促癌亚型TIMP1-L表达水平显著高于正常细胞，而抑癌亚型TIMP1-S表达水平显著低于正常细胞。抑制TIMP1抑癌亚型TIMP1-L，促进促癌亚型TIMP1-S表达可抑制癌细胞的生长。由此，通过采用检测TIMP1-L和TIMP1-S表达量的试剂对样本进行检测，可以有效地区分出样本来源于正常细胞或是来源于癌细胞。

本发明中的试剂可以为本领域常用规定PCR检测试剂。

发明人发现，结直肠癌细胞中的TIMP1促癌亚型TIMP1-L表达水平显著高于正常细胞，而抑癌亚型TIMP1-S表达水平显著低于正常细胞，因此TIMP1剪接作为结直肠癌细胞的生物标志物可信度更高。

本发明提出了试剂在制备药物中的用途、TIMP1基因剪接异常作为结直肠癌生物标志物的用途以及筛选药物的方法，包括但不限于试剂用于促进TIMP1基因的可变剪接，以及药物用于治疗或预防结直肠癌。通过促进TIMP1基因的剪接，可以抑制结直肠癌细胞生长，起到治疗或预防结直肠癌的目的。

本发明所提供的mRNA TIMP1-S/L，在制备治疗或预防癌症的药物方面，以及在作为生物标志物的检测方面，具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是TIMP1剪接事件特征的结果图；

图2是根据本发明实施例的TIMP1抑癌亚型TIMP1-S在结直肠癌中低表达且与结直肠癌的良好预后显著相关，而促癌亚型TIMP1-L在结直肠癌中高表达且与结直肠癌的不良预后显著相关的结果图；

图3是根据本发明实施例的稳定细胞株中TIMP1-S或TIMP1-L的表达鉴定结果图；

图4是根据本发明实施例的体外实验证明过表达TIMP1-S抑制结直肠癌细胞系的生长，而过表达TIMP1-L促进结直肠癌细胞系的生长的结果图；

图5是根据本发明实施例的体内裸鼠皮下成瘤实验证明过表达TIMP1-S抑制结直肠癌细胞系的生长的结果图；

图6是根据本发明实施例的体外实验证明过表达TIMP1-S抑制结直肠癌细胞系迁移和侵袭，而过表达TIMP1-L促进结直肠癌细胞系迁移和侵袭的结果图；

图7是根据本发明实施例的促进TIMP1剪接的特异性sgRNA能够抑制结直肠癌细胞系生长、迁移和侵袭的结果图；

图8是根据本发明实施例的体内裸鼠皮下成瘤实验证明促进TIMP1剪接的特异性sgRNA能够抑制结直肠癌癌细胞系的生长的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

为探讨可变剪接在结直肠癌发生及其进展过程中功能，发明人在实施例2中首先运用长读长纳米孔测序技术对来自江苏苏州的70名结直肠癌患者的癌组织和10例癌旁组织进行长度长纳米孔测序，并通过多种算法分析软件和对上述样本进行了系统的可变剪接事件分析，发现了1472个在两组样本间有显著频率差异的剪接事件。利用实时定量PCR技术和Sanger测序技术在进一步在独立样本中验证，最终发现结直肠癌中TIMP1剪接差异显著，且与结直肠癌患者的生存预后显著相关。

TIMP1作为一种内源性金属蛋白酶抑制因子，在肿瘤微环境的重塑，上皮-间质转化，细胞运动及衰老等方面发挥重要的作用。目前还没有与TIMP1可变剪接相关的研究报道。在下列实施例中，发明人将从临床相关性、体外及体内功能研究三方面来证明TIMP1可变剪接在结直肠癌发生中的重要作用及在在结直肠癌发生发展中的生物学行为。

实施例1、TIMP1剪接事件特征

发明人通过生物信息学分析发现，TIMP1 mRNA含有6个外显子，编码207个氨基酸(如图1a)。在结直肠癌样本中TIMP1经过可变剪接，发生4和5号外显子同时跳跃的现象。发明人将外显子不发生跳跃的亚型定义为TIMP1 -L，发生外显子跳跃的亚型定义为TIMP1-S。发明人通过实时荧光定量PCR检测发掘队列样本的mRNA并结合Sanger测序，检测到TIMP1-S主要在癌旁样本中表达，TIMP1 -L主要在结直肠癌样本中表达(如图1b和1c)。

实施例2 、结直肠癌中TIMP1剪接异常，且与其不良预后相关

为了探究TIMP1在结直肠癌发生中的作用，发明人分别分析了TIMP1的两个亚型L和S的mRNA表达水平，发现TIMP1-S在结直肠癌中表达显著低于其对应的癌旁组织(P<0.0001，如图2)，而TIMP1-L在结直肠癌中表达显著高于其对应的癌旁组织(P<0.0001，如图2)。

进一步地，对结直肠癌样本的临床资料进一步分析发现， TIMP1-S表达水平高的患者总体生存率较高(Log-rank P<0.05)，而TIMP1-L表达水平高的患者总体生存率较低(Log-rank P<0.05，如图2 )。以上结果说明，结直肠癌中TIMP1剪接异常，且与其不良预后相关，提示其可能在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用。

实施例3、稳定过表达TIMP1-L/S细胞株的建立

为了研究TIMP1剪接事件在结直肠癌中的生物学行为及其相应的分子机制，发明人将TIMP1-L/S分别构建到了稳定过表达的慢病毒载体pCMV上，包装慢病毒后感染结直肠癌细胞系SW480和HCT-8，用Puro进行筛选后得到稳定过表达TIMP1-L/S的细胞株，针对TIMP1的两个亚型L和S分别设计了qRT-PCR引物序列(如表2)，检测各亚型的表达(如图3)。

表2 引物序列

实施例4、TIMP1-S抑制结直肠癌细胞生长，而TIMP1-L促进结直肠癌细胞生长

发明人探究TIMP1异常可变剪接对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的影响。

通过克隆形成实验，发明人发现过表达TIMP1-L后能够促进细胞的生长；而过表达TIMP1-S后则能够抑制细胞的生长(如图4a)。进一步MTT实验同样证实TIMP1-S抑制结直肠癌细胞生长，而TIMP1-L促进结直肠癌细胞生长(如图4b)。

实施例5 、TIMP1-S抑制结直肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力

为了进一步证实TIMP1-S抑制结直肠癌细胞生长的功能，发明人进行了体内裸鼠皮下成瘤实验，将5×10

结果发现过表达TIMP1-S后SW480细胞的裸鼠皮下成瘤能力显著低于对照组细胞(P<0.01，如图5)。取出部分瘤块组织，病理H&E分析发现裸鼠皮下形成的肿瘤确实是结直肠癌(如图5)。同时ki67的IHC实验显示， TIMP1-S过表达组的瘤块中ki67的比例显著低于对照组(如图5)。通过体内裸鼠皮下成瘤实验，发明人进一步证实了TIMP1-S能够抑制结直肠癌细胞的生长。

实施例6、TIMP1-S抑制结直肠癌细胞迁移和侵袭，而TIMP1-L促进结直肠癌细胞迁移和侵袭

肿瘤细胞具有高迁移，高侵袭性，使得肿瘤容易转移，极大的加大了治疗的难度。为了探索TIMP1剪接异常在结直肠癌细胞迁移侵袭中的作用，发明人通过Transwell小室模拟体内肿瘤细胞转移的环境。

利用无基质胶和有基质胶两种Transwell方式检测TIMP1长短异构体对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响：按照 OE-Vector，OE-TIMP1-S, OE-TIMP1-L的分组，在TIMP1敲除的SW480和HCT-8细胞中进行转染。48 h 后，收取细胞，进行 Transwell 实验。其中无基质胶和有基质胶的方式分别用以检测该复合体TIMP1长短异构体对细胞迁移和侵袭的影响。

利用CCK8、克隆形成检测TIMP1长短异构体对结直肠癌增殖和干性的影响：按照以上转染方式，48 h 后，收取细胞，进行CCK8、克隆形成，以检测TIMP1长短异构体对细胞增殖和干性的影响。

检测发现，过表达TIMP1-L后促进了SW480和HCT-8细胞的迁移，而过表达 TIMP1-S后抑制SW480和HCT-8细胞的迁移(如图6)。另外，发明人借助Invasion小室模拟体内肿瘤细胞侵袭的环境，过表达TIMP1-L后促进了SW480和HCT-8细胞侵袭，而过表达 TIMP1-S后抑制SW480和HCT-8细胞的侵袭(如图7b)。这一系列的实验证明 TIMP1-S可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭，而TIMP1-L则促进了结直肠癌细胞迁移和侵袭。

在以上实施例中，首先分析了TIMP1剪接在结直肠癌临床样本中的相关性，发现TIMP1-S在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织，而TIMP1-L在结直肠癌组织中的的表达显著高于癌旁组织。其次，发明人通过体外MTT实验和裸鼠皮下成瘤实验均证明了TIMP1-S能够抑制结直肠癌细胞的生长。最后，发明人分别通过Transwell实验发现，TIMP1-S能够抑制结直肠癌癌细胞的转移。通过以上三方面的实验，发明人证实TIMP1-S是一个结直肠癌相关的抑癌基因。

实施例7、促进TIMP1剪接的特异sgRNA序列能够抑制结直肠癌细胞生长、迁移和侵袭

发明人已经证明了TIMP1-S能够抑制癌细胞的生长、迁移和侵袭，发挥抑癌作用，而TIMP1-L能够促进癌细胞的生长、迁移和侵袭，发挥促癌作用。以下判断诱导TIMP1剪接、位点，使得抑癌亚型TIMP1-S能够正常转录的sgRNA序列是否发挥抑癌作用。

发明人针对TIMP1的4号外显子和5号外显子的剪接位点分别设计了sgRNA (如表1)。

发明人首先通过实时荧光定量PCR检测sgRNA对结直肠癌细胞系SW480和HCT-8内TIMP1-S及TIMP1-L亚型mRNA表达的影响，结果显示sgRNA能够提高TIMP1-S的表达水平，降低TIMP1-L表达水平(如图7)。

接下来，发明人通过MTT、Transwell、Invasion实验发现特异sgRNA能够抑制结直肠癌细胞的生长、增殖和侵袭(如图7)。

实施例8、促进TIMP1剪接的特异sgRNA序列能够抑制结直肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力

为了进一步证实反义核酸序列抑制肝癌细胞生长的功能，发明人进行了体内裸鼠皮下成瘤实验，将5×10

发明人发现特异sgRNA序列能够抑制SW480细胞的裸鼠皮下成瘤能力(P<0.05，如图8)。病理H&E分析发现裸鼠皮下形成的肿瘤确实是结直肠癌，同时ki67的IHC实验显示，在注射含特异sgRNA质粒的瘤块中ki67的比例显著低于对照组(如图8)。通过体内裸鼠皮下成瘤实验，发明人进一步证实了特异sgRNA序列能够抑制结直肠癌细胞的生长。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、 “一些实施例”、 “示例”、 “具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。