一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法

技术领域

本发明属于植保实验技术领域，具体涉及一种几丁质强化木霉防控玉米轮 枝镰刀菌的评价分析方法。

背景技术

玉米作为世界范围内主要的经济作物，在玉米上发生的病害主要是由镰刀 菌引起的苗枯病，它能使玉米的根部以及茎部等多处感染，从而造成作物减产 和品质下降。目前，木霉作为土壤习居菌，对改善土壤质地以及促进作物生长 和防治微生物病害具有显著的效果。为实现农业的可持续发展，以木霉为首的 生物菌剂的使用已经得到行业专家的青睐，并且利用木霉拮抗防治病害早在国 内外已有报道同时在一些作物立枯病等病害的防治已经取得了良好的效果。几 丁质(Chitin)是一种聚合多糖，是自然界中广泛存在的生物多聚物，其储存 量非常丰富。几丁质作为自然界中广泛存在的生命第六大元素，能够抑制病原 菌的生长并且能够诱导宿主产生几丁质酶从而分解真菌的细胞壁。早在1962年 就有人研究发现将几丁质添加到土壤中能够促使拮抗菌分解病菌胞壁，1971年 Senh等人发现几丁质添加到土壤中对立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)具有 抑制作用。木霉在不受外界刺激时细胞中存在少量的几丁质酶，有研究报道， 当木霉在拮抗病原菌时，能够产生大量的几丁质酶等一系列水解酶来水解病原 菌的细胞壁。施加外源诱导物几丁质，可以激发木霉产生更多几丁质酶从而水 解病原菌细胞壁，达到抑制病原菌生长的效果。

发明内容

本发明的目的是要提供一种操作简易，分析全面准确，具有很好实用性的 几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其包括以下步 骤：

无菌条件下轮枝镰刀菌的样本接种处理；

无菌条件下木霉和轮枝镰刀菌和自然条件下木霉和镰刀菌样本的接种处理；

真菌数量的定量分析；

玉米幼苗的土培；

真菌孢子的接种处理；

土壤酶活测定分析，获得评价分析结果。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (1)所述的无菌条件下轮枝镰刀菌的样本接种处理包括以下步骤：将土与蛭石 体积比为1:1均匀混合，121℃，20min灭菌，65℃烘箱过夜干燥，干燥完成 后加入灭菌处理的去离子水，保持水分含量在60％，分成若干个样本组，其中一 个样本组加入2％几丁质，同时加入轮枝镰刀菌的孢子液混匀使浓度为107个/g， 25℃避光培养，培养7d。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (2)中的木霉采用哈茨木霉，采用的木霉培养基包括0.2g MgSO4·7H2O，0.9 g K2HPO4，1gNH4NO3，0.15g KCl，3g葡萄糖，10mL 1/300孟加拉红，20g 琼脂，蒸馏水补足至1000mL，115℃高压灭菌30min；待培养基冷却至50℃， 添加25mL 1％氯霉素，3mL 3％链霉素，0.2g五氯硝基苯，1mL曲拉通，1.2 mL霜霉威，150ppm潮霉素。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (2)所述的无菌条件下木霉和轮枝镰刀菌样本的接种处理包括：将土与蛭石体 积比为1:1均匀混合，115℃，30min灭菌，65℃烘箱过夜干燥，干燥完成后 加入灭好菌的去离子水，保持水分含量在60％，分成若干样本组，其中一个样本 组加入2％几丁质同时加入哈茨木霉使浓度为107个/g，并在加入哈茨木霉3d 后加入相同浓度的轮枝镰刀菌，25℃避光培养7d。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (2)所述的自然条件下木霉和镰刀菌样本的接种处理包括：将土与蛭石体积比 为1:1均匀混合，65℃烘箱过夜干燥，干燥完成后加入去离子水，保持水分含 量在60％，分成若干样本组，其中一个样本组加入2％几丁质，同时加入哈茨木 霉，并在加入哈茨木霉107个/g，3d后加入同样浓度的轮枝镰刀菌，25℃避 光培养。分别在7d以及14d时取样，同时留样保存。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤(3)所述的真菌数量的定量分析包括菌落涂布计数，真菌母液悬浮液的制备包 括：称取固体样品10g，加入带玻璃珠的100mL的无菌水，静置20min，在 旋转式摇床上200r/min充分震荡30min，即成母液悬浮液。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (3)所述的真菌数量的定量分析包括qPCR定量计数。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (4)所述玉米幼苗土培的土壤处理包括：将自然土壤与蛭石按照体积比1:1混 合均匀，加入水润湿后，保持水分在60％左右，装入1L的组培瓶中，每瓶350 g，处理组加入2％的几丁质，空白对照组不加入几丁质，施加与几丁质相同质量 的自然土壤与蛭石混合物，备用；将蛭石与石英砂按照1:1的体积比混合均匀， 加入适量的水润湿后装入1L容量的组培瓶中，每瓶350g，用高压蒸汽灭菌锅， 在121℃、20min条件下灭菌三次，备用。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (5)所述真菌孢子接种处理包括：28℃恒温培养7d的木霉或轮枝镰刀菌PDA 平板，产孢后肉眼可见孢子层，用无菌ddH2O轻轻冲洗平板菌丝表面，冲洗液 经过四层无菌纱布过滤，制得木霉孢子悬液或轮枝镰刀菌孢子悬液。

上述的一种几丁质强化木霉防控玉米轮枝镰刀菌的评价分析方法，其步骤 (6)所述土壤酶活测定分析包括土壤过氧化氢酶活力测定、土壤纤维素酶活力 测定、土壤脲酶活力测定、土壤蔗糖酶活力测定中的一种或多种。

有益效果：

本发明提供了通过外源添加几丁质和哈茨木霉探索对玉米轮枝镰刀菌的防 控方法，通过该方法研究几丁质和木霉对促进玉米生长，改善玉米生长指标， 抑制轮枝镰刀菌的影响，对实际推广应用几丁质和木霉防控玉米病菌具有重要 的指导意义。其操作简易，分析全面准确，具有很好实用性。

具体实施方式

下面对发明内容作详细的解释。

实施例

本实施例中，选用如下材料

菌株：哈茨木霉(Trichoderma guizhouense NJAU 4742)和荧光标记的轮 枝镰刀菌突变株NJAU 1013由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验 室保藏。

玉米(Zea.mays)，郑单958商品化种子(审定编号：冀审玉200002)。

木霉涂布培养基：0.2g MgSO4·7H2O，0.9g K2HPO4，1g NH4NO3，0.15 g KCl，3g葡萄糖，10mL 1/300孟加拉红，20g琼脂，蒸馏水补足至1000mL， 115℃高压灭菌30min。待培养基冷却至50℃，添加25mL 1％氯霉素，3mL 3％ 链霉素，0.2g五氯硝基苯，1mL曲拉通，1.2mL霜霉威(农药)，150ppm潮 霉素。

试剂盒：

DNA提取试剂盒：DNeasy Plant Mini Kit,QIAGEN；

荧光定量试剂盒：SYBR Premix EX Taq kit,Takara,Japan；

土壤过氧化氢酶：土壤过氧化氢酶(S-CAT)活性检测试剂盒，Solarbio；

土壤纤维素酶：土壤纤维素酶(S-CL)活性检测试剂盒，Solarbio；

土壤脲酶：土壤脲酶(S-UE)活性检测试剂盒，Solarbio；

土壤蔗糖酶：土壤蔗糖酶(S-SC)活性检测试剂盒，Solarbio。

仪器：

荧光定量PCR仪：Applied Biosystems 7500，Thermo Scientific，USA

96孔板：96-well Fast Thermal Cycling plate，Thermo Fisher，USA

核酸定量仪：NanoDrop 2000

叶绿素检测仪：日本Osaka Konica Minolta SPAD-502

本发明的评价分析方法如下：

1.无菌条件下轮枝镰刀菌接种处理

将土与蛭石体积比为1:1均匀混合，121℃，20min灭菌，65℃烘箱过夜干 燥，干燥完成后加入灭好菌的去离子水，保持水分含量在60％，其中一组处理加 入2％几丁质，同时加入轮枝镰刀菌NJAU 1013的孢子液混匀使浓度为107个/g。 25℃避光培养，培养7d,取样保存同时留样保存。

2.无菌条件下木霉和轮枝镰刀菌接种处理

将土与蛭石体积比为1:1均匀混合，115℃，30min灭菌，65℃烘箱过夜 干燥，干燥完成后加入灭好菌的去离子水，保持水分含量在60％，其中一组处理 加入2％几丁质同时加入哈茨木霉使浓度为107个/g，并在加入哈茨木霉3d后加 入相同浓度的轮枝镰刀菌，25℃避光培养。培养7d,取样保存。

3.自然条件下木霉和镰刀菌接种处理

将土与蛭石体积比为1:1均匀混合，65℃烘箱过夜干燥，干燥完成后加入 去离子水，保持水分含量在60％，其中一组处理加入2％几丁质，同时加入哈茨木 霉，并在加入哈茨木霉107个/g，3d后加入同样浓度的轮枝镰刀菌，25℃避光 培养。分别在7d以及14d时取样，同时留样保存。

4.真菌数量的定量分析

4.1菌落涂布计数

称取固体样品10g(精确到0.1g)，加入带玻璃珠的100mL的无菌水，静 置20min，在旋转式摇床上200r/min充分震荡30min，即成母液悬浮液。

用5mL无菌移液管分别吸取5mL上述母液菌悬液加入45mL无菌水中，按1:10 进行系列稀释，分别得到1:101，1:102，1:103，1:104，1:105，等不同梯度稀 释菌悬液。

每个样品取3个连续适宜的稀释度，取0.1mL加至事先制备好的选择性固体 培养基上。将玻璃涂布棒浸没在盛放有酒精的烧杯中，在酒精灯外焰处将占有 少量酒精的玻璃涂布棒无死角燃烧1min，冷却10s，用涂布棒均匀的将菌液涂 布于培养基表面。同时以无菌水作为空白对照，每一稀释度重复3次，于25℃ 培养基36h。

以出现10-150个菌落数的稀释度的平板计数标准，分别统计有效活菌和杂 菌数目。

计算公式为：nm＝x×k×v1×10-8/(m0×v2),式中nm，质量有效活菌数，单 位为亿每克；x，有效菌落平均数，单位为个；k，稀释倍数；v1，母液体积， 单位为毫升；v2，菌悬液加入量，单位为毫升；m0，样品量，单位为g。

4.2qPCR定量计数

待分析的组织DNA样品用NanoDrop 2000测定其含量，并按照荧光定量试剂 盒(SYBR Premix EX Taq kit，Takara，Japan)的说明书要求，将DNA溶液适 当稀释，作为荧光定量PCR的模板工作液。根据试剂盒要求配制荧光定量PCR的 反应试剂，并在AppliedBiosystems 7500Real-Time PCR System(Thermo Scientific，USA)上设置相应的反应程序。

荧光定量PCR在96孔板中进行(96-well Fast Thermal Cycling plate， ThermoFisher，USA)，反应体系为20μL体积：

其中，定量PCR所用扩增引物的序列及其参考信息见表4-1

荧光定量PCR按如下反应程序进行：

扩增阶段

溶解曲线阶段

95℃ 15s

60℃ 1min

95℃ 15s

反应结束后，对定量PCR的结果进行计算和比较分析。

表4-1基因定量PCR引物序列及参考信息

绝对定量计算公式：

拷贝数＝6.02*1023ng/uL*10-9

DNA长度*660

5.玉米幼苗的土培

将自然土壤与蛭石按照体积比1:1混合均匀，加入水润湿后，保持水分在60％ 左右，装入1L的组培瓶中，每瓶350g，处理组加入2％的几丁质，空白对照组 不加入几丁质，施加与几丁质相同质量的自然土壤与蛭石混合物，备用。将蛭 石与石英砂按照1:1的体积比混合均匀，加入适量的水润湿后装入1L容量的组培 瓶中，每瓶350g。用高压蒸汽灭菌锅，在121℃、20min条件下灭菌三次，备 用。

对玉米种子进行表面消毒及催芽处理。提前将滤纸铺于直径15cm的大玻 璃培养皿中并加入5mL ddH

待玉米种子胚芽萌发后，在超净工作台将长势接近或相同的幼苗用无菌ddH2O进行冲洗，种子表面灭菌后用已消毒的镊子将其从烧杯中轻轻取出，转移 至盛有无菌蛭石的组培瓶中，每瓶可容纳8颗玉米种子。视蛭石的湿润情况，向 摆好玉米种子的组培瓶中分别加入无菌水，将组培瓶置于人工气候室中培养5d， 温度为25℃，湿度60％，光周期为16h光照/8h黑暗。

待玉米无菌幼苗的叶鞘尖部靠近组培瓶盖子时，准备移栽至土培基质中， 并选取长势接近或相同的幼苗进行移栽。移栽后的玉米幼苗在人工气候室中继 续培养至两叶一心期，选取长势接近或相同的玉米幼苗，进行真菌孢子的接种 处理。

6.真菌孢子接种处理

木霉以及镰刀菌孢子悬液制备

28℃恒温培养7d的木霉PDA平板，产孢后肉眼可见绿色或墨绿色孢子层， 用无菌ddH2O轻轻冲洗平板菌丝表面，冲洗液经过四层无菌纱布过滤，得到新鲜 的木霉孢子悬液。木霉孢子悬液在每次接种前制备现制现用涡旋振荡均匀后再 取样进行血球计数板计数，用无菌水调节孢子浓度。

镰刀菌孢子悬液制备方法与木霉相同。

土培条件木霉孢子的接种处理：

向玉米幼苗土培基质中均匀施入木霉孢子悬液，使处理组接种木霉孢子的 终浓度为107个/g，空白对照组不接种木霉孢子液，施加与孢子液相同体积的 无菌水。施入木霉孢子后7d采用同样的办法施加轮枝镰刀菌，使孢子液终浓度 与木霉孢子液终浓度一致，处理组与对照组各设置10个生物重复。玉米幼苗在 人工气候室中继续培养两周，测量并记录玉米苗的生长指标，且取土样一部分 保存到-80℃冰箱用于提DNA，一部分存于4℃冰箱用于涂布和测酶活。

7.土壤酶活测定分析

采用土壤过氧化氢酶试剂盒(土壤过氧化氢酶(S-CAT)活性检测试剂盒，Solarbio)进行土壤过氧化氢酶活力测定。其测定原理及方法：S-CAT在H2O2 清除系统中具有重要作用，是土壤微生物代谢的重要酶类。H2O2在240nm下有 特征吸收峰，通过测定与土壤反应后溶液在此波长下吸光度的变化，即可反应 S-CAT活性的高低。测定时，取新鲜风干土过30～50目筛，酶标仪调节波长至240 nm。根据试剂盒说明书，稀释标准液并配置反应工作液。震荡培养完成后取上 清240nm测定吸光度，根据样品管以及对照管浓度计算样品过氧化氢酶活力。

采用土壤纤维素酶试剂盒(土壤纤维素酶(S-CL)活性检测试剂盒， Solarbio)进行土壤纤维素酶活力测定。其测定原理及方法：S-CL主要来源于 土壤微生物，S-CL催化农作物秸秆产生的葡萄糖是作物主要的碳源。本产品采 用3.5－二硝基水杨酸法测定S-CL催化纤维素降解产生的还原糖。测定时，取新 鲜风干土过30～50目筛，酶标仪调节波长至540nm。根据试剂盒说明书，稀释标 准液并配置反应工作液，振荡混匀，将样品盖紧40℃水浴糖化1h后，煮沸15min, 得糖化液后再次加入其余试剂，混匀，煮沸后显色15min，540nm测定吸光度， 根据样品吸光度结合标准品浓度计算待测样品蔗糖酶活力。

采用土壤脲酶试剂盒(土壤脲酶(S-UE)活性检测试剂盒，Solarbio)进 行土壤脲酶活力测定。其测定原理及方法：S-UE能够水解尿素，产生氨和碳酸。 土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质等含量呈正相关。土壤脲酶活性 反应了土壤的氮素状况。本法以尿素为基质，利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解 尿素产生的NH3-N，生成的蓝色靛酚和氨的浓度成正比。测定时，取新鲜风干 土过30～50目筛，酶标仪调节波长至630nm，。根据试剂盒说明书，稀释标准液 并配置反应工作液。将反应液放入37℃水浴培养24h后，10000g常温离心10min， 取上清液，并稀释10倍。再次加入其余试剂混匀后630nm测定吸光度，根据样 品吸光度结合标准品浓度计算待测样品脲酶活力。

采用土壤蔗糖酶试剂盒(土壤蔗糖酶(S-SC)活性检测试剂盒，Solarbio) 进行土壤蔗糖酶活力测定。其测定原理及方法：S-SC能够水解蔗糖变成相应的 单糖而被机体吸收，其酶促作用产物与土壤中有机质含量，微生物数量及土壤 呼吸强度有关，是评价土壤肥力的重要指标。S-SC催化蔗糖降解产生还原糖， 进一步与3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在540nm有特征 光吸收峰。测定时，取新鲜风干土过30～50目筛，酶标仪调节波长至540nm。根 据试剂盒说明书，稀释标准品并将土样与试剂混匀，放入37℃水浴培养24小时， 10000g，4℃，离心5min，取上清液，将培养结束的上清液稀释10倍，再次 加入其余试剂，充分混匀，盖紧，放入沸水浴中煮沸5min，流水冷却后充分混 匀，在540nm测定吸光度，根据样品吸光度结合标准品浓度计算待测样品蔗糖 酶活力。

本发明通过分别将轮枝镰刀菌添加于含有几丁质的无菌基质与自然基质 中，证明添加几丁质能够促进木霉生长，同时也能够抑制轮枝镰刀菌的生长； 进一步通过土培方法，将玉米幼苗种植与含有几丁质的基质中，证明添加几丁 质能够在促进玉米生长的同时，抑制土培中轮枝镰刀菌的生长，外源添加几丁 质对木霉防控轮枝镰刀菌具有显著的促进效应。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。