一种牙周炎模型的快速建立方法及治疗药物

技术领域

本发明涉及三七天然产物的应用领域，具体地说是一种牙周炎模型的快速建立方法及治疗药物。

背景技术

牙周炎是一种常见的慢性感染性疾病，在口腔疾病中十分常见和流行，其特点是结缔组织附着以及牙槽骨丧失，常伴有牙齿松动和牙龈出血等症状，是成人牙齿脱落的主要原因，现今，许多研究已经证实牙周炎疾病始动因子是牙菌斑生物膜在牙龈周围积累，继而引发由一系列炎症细胞因子介导的宿主免疫应答。在整个牙周炎病理过程中，IL-1β水平均较高，其可促进破骨细胞的增殖活化，参与牙周炎组织结构破坏和牙齿松动及脱落。大鼠是建立牙周炎模型的常用动物，具有经济高效的优点，牙周炎模型建立常用方法有涂菌法、LSP法、结扎法、结扎配合长期高糖饮食法等。相较于钢丝结扎，其他方法具有步骤繁琐、丝线需要重新固定等缺点。有研究者用正畸2-0钢丝结扎配合20％高糖饮食诱导模型四周，成功得到大鼠牙周炎模型，但长期高糖饮食可诱发机体代谢性疾病，还可能破环机体免疫系统，不利于对单纯性牙周炎模型的研究。

三七(Panax notoginseng是中国传统名贵中药材，应用广泛，含有多种活性物质。截至目前，关于三七的研究主要集中在三七皂苷，而对三七多糖的研究较少，三七多糖是三七主要药效活性物质之一，研究证实其具有体外免疫刺激活性、调节免疫和抗肿瘤活性、保护神经功能、较强的清除自由基活性能力以及抗炎和修复骨损伤作用。ZL 2017 1 0459344中已阐述了三七中性多糖的提取纯化方法及具有促进人牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞体外增殖的作用，但目前关于中性三七多糖对大鼠牙周炎的治疗作用还未见报道。因此需要一种牙周炎模型的快速建立方法及治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单易行、效果理想的牙周炎模型建立方法，并将中性三七多糖应用于该模型的牙周炎模型的快速建立方法及治疗药物。

一种牙周炎模型的建立方法，用2-0正畸钢丝结扎大鼠上颌双侧第二磨牙并配合5天高糖饮食成功得到大鼠牙周炎模型。

一种牙周炎模型的治疗药物，包含85％左右的中性三七多糖。

进一步地，将含量85％左右的中性三七多糖通过灌胃的方式用于该模型，给药剂量分别为200、400、800mg/kg,每天给药一次，持续给药28天。

运用本方法成功得到牙周炎模型，将中性三七多糖应用于该模型后，牙周炎症状大大缓解：血清IL-1β水平下降；牙釉本质界到牙槽嵴顶的距离显著降低；根分叉区骨吸收面积百分比显著减少；牙龈出血情况显著改善；磨牙松动情况得到缓解。

本发明的有益效果在于：

本发明建立大鼠牙周炎模型后，将中性三七多糖应用于本模型，为三七资源的综合利用提供参考依据，给予中性三七多糖治疗后，大鼠炎症得到缓解，显著抑制了牙槽骨丢失，极大的保护了牙龈出血，此外，磨牙松动情况得到改善，本发明增加了中性三七多糖用于牙周炎治疗的新用途，为中性三七多糖治疗牙周炎的生物研究。

附图说明

图1是实施例1中性三七多糖对大鼠牙周炎模型血清中IL-1β水平影响的实验结果图。

图2是实施例1中性三七多糖对大鼠牙周炎模型牙釉本质界到牙槽嵴顶距离(CEJ-ABC)影响的实验结果图。

图3是实施例1中性三七多糖对大鼠牙周炎模型第二磨牙根分叉区病理切片影响的实验结果图。

图4是实施例1中性三七多糖对大鼠牙周炎模型第二磨牙根分叉区骨吸收百分比影响的实验结果图。

具体实施方式

为了进一步了解本发明的技术特征，下面结合具体实施例对本发明进行详细地阐述。实施例只对本发明具有示例性的作用，而不具有任何限制性的作用，本领域的技术人员在本发明的基础上做出的任何非实质性的修改，都应属于本发明的保护范围。

一种牙周炎模型的建立方法，用2-0正畸钢丝结扎大鼠上颌双侧第二磨牙并配合5天高糖饮食成功得到大鼠牙周炎模型。

实施例1

大鼠牙周炎模型的建立和中性三七多糖对该模型的应用

(1)模型建立与分组：取30只SPF级SD大鼠，雄性，5周龄，体重100-140g，适应性常规喂养2周后，体重在200g左右。随机选取25只作为造模组对其进性牙周炎造模，剩下5只作为正常组(N)，不作处理。牙周炎造模方法如下：用戊巴比妥钠溶液对大鼠进性腹腔注射麻醉(40mg/kg)，仰卧固定，选取上颌双侧第二磨牙，剥离牙龈，用3.0医用正畸钢丝结扎，尽量使结扎头位于龈沟内，结扎完成后，将造模组随机分为模型组、盐酸米诺环素阳性对照组、中性三七多糖低(200mg/kg)、中(400mg/kg)、高(800mg/kg)剂量治疗组(n＝5)。自结扎之日起，造模组大鼠饲以10％高糖水和10％高糖水浸泡的软食，连续饲养5天，第6天起，则进行常规饲养。正常组在整个实验过程均采取常规饲养方式。自结扎后的第二天开始，按表1对各组大鼠进行灌胃，连续灌胃28天。

表1实验分组

如图1所示，与正常组大鼠相比，本方法显著增加模型组大鼠血清IL-1β水平(P<0.01)，形态学结果表明模型组牙槽骨吸收距离显著高于正常组(P<0.01，见图2)，上述实验结果表明，应用本方法可成功得到大鼠牙周炎模型。

一种牙周炎模型的治疗药物，包含85％左右的中性三七多糖。

(2)试药配制及给药：准确称取中性三七多糖，溶于无菌蒸馏水，按200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg剂量分别配制20mg/mL、40mg/mL、80mg/mL三种浓度的中性三七多糖试药，每100g体重大鼠灌胃1mL多糖体积给药；称取适量盐酸米诺环素溶于无菌蒸馏水，使其浓度为2mg/mL，每100g体重大鼠灌胃1mL盐酸米诺环素试药；模型组灌胃相应体积的无菌蒸馏水。

给药周期结束后对各项指标进行检查

(1)细胞因子检查：末次给药后，各组大鼠禁食不禁水12h，用戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉大鼠，真空采血管收集腹主动脉血约4mL，室温静置20min，4℃下3000rpm/min离心15min，小心分离得血清，-20℃分装保存备用，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清炎症因子IL-1β水平，按照试剂盒说明书严格操作。

(2)形态学观察：脱颈处死各组大鼠，小心分离双侧上颌骨，将左侧上颌骨剥离牙龈及骨膜等组织，煮沸5min以更好的祛除组织后，清洗浸泡于0.2moL/L的NaOH溶液中5min，去除残余软组织碎屑，取出后再次清洗，晾干后1％亚甲蓝染色5min以确定釉牙本质界(CEJ)。用手机相机拍摄后利用图像分析软件ImageJ测量颊、颚侧各3个点釉牙本质界到牙槽嵴顶的距离。

(3)牙龈指数测定：末次给药后，各组大鼠禁食不禁水12h，用戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉大鼠，用探针对大鼠双侧牙龈指数进行评分，评分标准如下：

0分-针无出血，色泽正常；

1分-轻度炎症，轻度水肿，颜色轻微变化以及探测时无出血；

2分-中度发炎，浮肿，牙龈光亮发红，探针出血；

3分-严重炎症，明显的红肿，浮肿，溃疡和自发性出血倾向；

(4)磨牙松动度测定：末次给药后，各组大鼠禁食不禁水12h，用戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉大鼠，用探针对大鼠双侧磨牙松动度进行评分，评分标准如下：

0分-磨牙无松动

1分-磨牙仅颊舌方向松动

2分-磨牙向颊舌方向及近远中方向松动

3分-磨牙向颊舌方向、近远中方向以及垂直(上下)方向松动

(5)组织病理学分析：末次给药后，禁食不禁水12h，脱颈处死各组大鼠，取右侧上颌骨，放入4％多聚甲醛，4℃下固定24h，然后在4℃条件下，用10％EDTA脱钙40天，系列浓度酒精脱水，石蜡包埋，组织切片，切片厚度为5μm，行HE染色，在40×电子显微镜下观察牙根分叉区骨吸收情况及牙龈组织病理变化，用ImageJ软件计算骨吸收窝占根分叉骨面积比例。

中性三七多糖对大鼠牙周炎模型的影响

将含量85％左右的中性三七多糖通过灌胃的方式用于该模型，给药剂量分别为200、400、800mg/kg,每天给药一次，持续给药28天。

(1)中性三七多糖可轻微降低牙周炎大鼠血清IL-1β含量：如图1所示，与正常组相比，模型组组IL-1β含量显著升高，具有统计学差异(P<0.01)。与模型组相比，盐酸米诺环素组和中性三七多糖-400mg/kg组的IL-1β含量降低，说明中性三七多糖具有抑制牙周炎大鼠炎症的作用。

(2)中性三七多糖可显著抑制牙周炎大鼠牙釉本质界到牙槽嵴顶的吸收距离：形态学结果如图2、3所示，与正常组组相比，模型组牙槽骨吸收距离达到了848.86mm，具有显著性差异(P<0.01)，说明大鼠牙周炎模型成功。与模型组组相比，各组大鼠牙槽骨吸收程度均得到缓解，其中中性三七多糖-400mg/kg组牙槽骨吸收降低至683.12mm，具有显著性差异(P<0.01)，盐酸米诺环素组和中性三七-200mg/kg组则分别显著降低至717.46mm和733.1mm(P<0.05)。

(3)中性三七多糖可显著改善牙周炎大鼠牙龈出血情况：中性三七多糖对牙周炎大鼠牙龈指数影响结果见图4和表2，与N组相比，各组大鼠牙龈指数均显著性增加(P<0.01)，与PD组相比，中性三七多糖各剂量组牙龈指数均减低，其中中性三七多糖-400mg/kg组和中性三七多糖-200mg/kg具有统计学差异(P<0.01,P<0.5)。

表2.牙龈出血指数

注:与正常组相比,*P<0.05,**P<0.01；与模型组相比,#P<0.05.##P<0.01.

(4)中性三七多糖可轻微抑制牙周炎大鼠磨牙松动：如表3所示，与正常组组相比，各组大鼠磨牙松动均增加，与模型组相比，盐酸米诺环素和中性三七多糖各剂量组磨牙指数均降低，且中性三七多糖-400mg/kg组表现出最好的效果，但均没有统计学差异。

表3.中性三七多糖对磨牙松动影响

(5)中性三七多糖可显著抑制磨牙根分叉区骨吸收窝进一步发展：HE染色结果如图3和4所示：正常组中大鼠上颌第二磨牙与第一磨牙间牙龈乳头结构完整，牙龈组织充满间隙，未见结缔组织向根方迁移，第二磨牙根分叉区偶见骨吸收窝，形态正常。其余各组牙龈组织结构均不完整，牙龈乳头消失，发生不同程度的溃疡坏死，结缔组织均有不同程度向根方迁移。其中，模型组磨牙根分叉区可见大量骨吸收窝，骨吸收面积达18.7％，显著大于正常组骨吸收窝面积(P＝0.005)，盐酸米诺环素和中性三七多糖-400mg/kg组骨吸收面积分别为9.3％和9.8％，均显著低于模型组(P＝.019,P＝0.022)。

中性三七多糖治疗牙周炎的作用机理与临床上治疗牙周炎的常用药物盐酸米诺环素截然不同。盐酸米诺环素主要抑制牙周细菌感染，进而抑制宿主免疫应答。本发明中，中性三七多糖对牙周炎大鼠牙槽骨的吸收有明显的抑制作用，这可能是由于其降低了大鼠血清中的IL-1β水平，进而在一定程度上抑制IL-1β对破骨细胞产生激活及活化效应，最终抑制了骨的吸收。

运用本方法成功得到牙周炎模型，将中性三七多糖应用于该模型后，牙周炎症状大大缓解：血清IL-1β水平下降；牙釉本质界到牙槽嵴顶的距离显著降低；根分叉区骨吸收面积百分比显著减少；牙龈出血情况显著改善；磨牙松动情况得到缓解。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。