一种激活型近红外小分子荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物探针领域，具体涉及一种近红外激活型小分子荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

急性肾损伤是一种发病率和致死率很高的全球性疾病，主要表现为肾小球滤过作用的显著下降，导致肾功能紊乱。急性肾损伤有很多诱因，比如败血症、低血压、肾结石、器官衰竭以及药物的过度使用等等，在众多诱因中，药物过度使用引起的急性肾损伤最为普遍。传统诊断急性肾损伤的方法主要包括活肾穿刺活检或者测量血液中肌酐和血尿素氮的含量，但前者由于其侵入性的特点，可能会有潜在的其他器官感染的风险；后者由于检测的灵敏性不足，无法在急性肾损伤的早期阶段及时检出，这往往导致病人错过了最佳的治疗时机。因此，为了能对急性肾损伤患者做及时的干预，提高治疗的成功率，急需要开发高灵敏度的诊断工具，来实现对急性肾损伤早期、非侵入性检测。

分子荧光成像以其高的灵敏度、低成本、操作简易以及非侵袭性等优点，被广泛应用于对疾病的成像检测，在生物医学研究和临床诊断领域具有广阔的前景。近年来，科研工作者针对急性肾损伤，开发了许多能对其早期进行检测的光学成像探针。例如，来自美国德克萨斯大学的郑杰课题组开发了一种表面修饰了谷胱甘肽的修饰的金纳米颗粒，该纳米探针主要通过肾脏清除，来实现对不同阶段急性肾损伤的近红外成像。来自新加坡国立大学的浦侃裔课题组针对发生在早期急性肾损伤的不同分子事件，开发了一系列响应不同生物靶标的激活型荧光探针，实现对急性肾损伤小鼠的早期成像检测分析。尽管目前已有的荧光探针可以基本实现对急性肾损伤的早期检测，但是这些探针往往仅响应一个单独的分子事件且容易被清除，这会降低成像结果的准确性且难以监测急性肾损伤的发生和进程。因此，需要开发一种能够靶向多个生物靶标的激活型小分子荧光探针，使其靶向多个生物靶标，从而实现对急性肾损伤的早期高灵敏度的成像检测。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种激活型近红外荧光探针及其制备方法，从而实现对早期急性肾损伤更精准、更高信背比的成像检测分析。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种激活型近红外小分子荧光探针，它包括如下几个部分键合而成：

半胱天冬酶-3(Casp-3)特异性识别的多肽序列(G-DEVD-G)：

特异性结合磷脂酰丝氨酸蛋白(PS)的二甲基吡啶胺-锌螯合物(DPA-Zn)：

具有近红外荧光淬灭效应的淬灭剂(QC-1)：

以及具有近红外荧光的花菁类荧光染料(IR-780dye)：

具体地，它具有如下的分子结构：

进一步地，本发明还提供上述激活型近红外小分子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(a)将化合物IR-780-Alkyne与化合物3进行点击化学反应，引入二甲基吡啶胺(DPA)基团；

(b)步骤(a)完成后，产物不纯化直接进行取代反应，引入叠氮(N

(c)步骤(b)反应产物不纯化直接与G-DEVD-G-Alkyne进行点击化学反应，引入Casp-3识别多肽序列G-DEVD-G-Alkyne，得到化合物4；

(d)将化合物4进行取代反应，引入荧光猝灭基团QC-1；

(e)将步骤(d)反应产物不纯化直接进行配位反应，向二甲基吡啶胺(DPA)基团引入Zn

上述步骤反应式如下：

其中，步骤(a)中，所述的点击化学反应为将化合物IR-780-Alkyne、化合物3、无水硫酸铜(CuSO

步骤(b)中，将叠氮化钠(NaN

步骤(c)中，将化合物G-DEVDG-Alkyne溶于溶剂中，加入步骤(b)反应产物中进行反应；其中，化合物IR-7810-Alkyne与化合物G-DECDG-Alkyne的摩尔比为5：(5-10)，优选为5：7.5；反应温度为20-30℃，优选为室温，搅拌状态下反应15-45min，优选为30min，得到含有化合物4的反应液，经纯化、冻干，得到化合物4；所述溶剂包括但不限于二甲基亚砜，优选为二甲基亚砜。

所述的化合物G-DEVDG-Alkyne结构为：

步骤(d)中，化合物4、QC-1活化酯和N,N-二异丙基乙胺溶于溶剂中进行反应；其中，化合物4、QC-1活化酯和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的摩尔比为5：(5-8)：(5-8)，优选为5：6：8；反应温度为20-30℃，优选为室温，搅拌状态下反应0.5-1.5h，优选为1h；所述反应溶剂包括但不限于甲醇，优选为甲醇。

所述的QC-1活化酯结构为：

步骤(e)中，将氯化锌溶于溶剂，加入步骤(d)产物中进行配位反应；其中，化合物4与ZnCl

进一步地，本发明还要求保护上述激活型近红外小分子荧光探针用于在体外对Casp-3活性检测中的应用。

进一步地，本发明还要求保护上述激活型近红外小分子荧光探针用于对早期急性肾损伤成像检测中的应用。

本发明探针1-DPA

有益效果：

本发明将受体介导的结合以及滞留效应和酶响应的荧光激活策略相结合，设计了合成了一种PS靶向、Casp-3激活的近红外荧光探针1-DPA

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为PS蛋白靶向、Casp-3激活的近红外荧光探针的设计及其作用机理。

图2为探针1-DPA

图3为探针1-DPA

图4为探针1-DPA

图5为探针1-DPA

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所述“％”，如无特殊说明，均为摩尔百分比。

试剂与仪器：所有化学试剂和溶剂均购自百灵威科技有限公司(中国上海)，梯希爱(中国上海)化成工业发展有限公司和Sigma-Aldrich。分析溶剂与试剂为色谱纯，常规试剂均为分析纯且未经进一步纯化处理。荧光淬灭剂QC-1购自于LI-COR Biosciences(美国林肯)。

实施例1：

探针1-DPA

2-[2-(2-Azidoethoxy)ethoxy]-N,N-bis(2-pyridinylmethyl)ethanamine中间体化合物3(CAS:1613538-61-6)的合成路线如下：

反应条件：(a)NaN

化合物1的合成：将2-氯乙氧基-2-乙氧基二乙醇(991mg，5.9mmol)，NaN

化合物2的合成：将化合物1(525mg，3mmol)溶解于10mL无水DCM中。随后将TsCl(684mg，3.6mmol)，三乙胺(500μL，3.6mmol)分别加入反应溶液中，室温搅拌4小时。反应完成后，真空旋蒸除去DCM。残余物通过硅胶快速色谱法纯化，使用PE/EA(50：1至10：1v/v)的混合溶液作为洗脱剂，得到化合物2为无水液体。产量：436mg(83％)。

化合物3的合成：在氮气保护下，将化合物2(395mg，1.2mmol)和2,2-二甲基吡啶胺(199mg，1.0mmol)溶于9mL无水乙腈中，然后将三乙胺(167μL，1.2mmol)溶于1mL无水乙腈中并滴加入反应液中，反应溶液在90℃回流并持续搅拌24小时。反应结束后，真空旋蒸除去乙腈，然后将反应混合物用50mL DCM稀释，并用饱和食盐水溶液萃取3次(每次20mL)，有机层用无水Na

中间体化合物G-DEVD-G-Alkyne的合成路线如下：

反应条件：(a)HBTU,DIPEA,DMF,r.t.,2h,73％；(b)炔丙胺,HBTU,DIPEA,THF,r.t.,2h,81％；(c)95％TFA/DCM,r.t.,4h,74％。

化合物Boc-GDEVDG(O

化合物Boc-GDEVDG(O

化合物G-DEVD-G-Alkyne的合成：将化合物Boc-GDEVDG(O

探针1-DPA

反应条件：(a)化合物3,CuSO

化合物4的合成：首先，根据已报道的方法(J.Am.Chem.Soc.2020,142,2787-2794.)合成了近红外荧光染料IR-780-Alkyne。(a)将化合物3(16mg,0.044mmol)和IR-780-Alkyne(26mg,0.02mmol)溶于DMSO中，将CuSO

化合物1-DPA

如图1所示，PS蛋白靶向、Casp-3激活的近红外荧光探针的设计及其作用机理：(a)1-DPA

对比例：

对照探针Ctrl-DPA

对照探针Ctrl-DPA

反应条件：(a)ZnCl

化合物Ctrl-DPA

对照探针Ctrl-QC的合成路线如下：

反应条件：(a)化合物1,CuSO

化合物5的合成：(a)将化合物1(7.7mg,0.044mmol)和IR-780-Alkyne(26mg,0.02mmol)溶于二甲基亚砜(1mL)中，将CuSO

化合物Ctrl-QC的合成：(d)将QC-1活化酯(1.1mg,0.001mmol)，化合物5(1.9mg,0.0012mmol)和DIPEA(0.26μL,0.0015mmol)溶于二甲基亚砜(200μL)溶液中，室温搅拌0.5小时引入荧光猝灭基团QC-1。反应结束后通过制备HPLC纯化残余物，通过冻干获得化合物Ctrl-QC为墨绿色固体。产量：2.3mg(89％)。MS:calcd.for C

探针性能测试

1、探针对Casp-3的酶切响应

在Casp-3的酶切缓冲液(含有50mM HEPES缓冲液,100mM NaCl,1mM EDTA,10mMTCEP,40mM NaHCO

2、探针对Casp-3的检测灵敏性

取1-DPA

结果如图2c所示，探针的荧光强度随着Casp-3浓度的增大而增强。荧光强度与Casp-3浓度(0-0.2μg/mL)成线性关系。探针对Casp-3的检测限(LOD)经计算为1.35ng/mL，表明探针可用于对Casp-3的高灵敏检测。

3、探针对Casp-3的检测特异性

取1-DPA

结果如图2d所示，只有加入Casp-3才可以激活探针1-DPA

4、探针在活体水平对顺铂诱导的急性肾损伤的成像检测

取15只6-8周龄的雌性BALB/C裸鼠，任选其中的12只，通过腹腔注射顺铂(20mg/kg)的方式，构建急性肾损伤模型，剩余的3只小鼠仅注射生理盐水作为健康小鼠对照。在48h后，将含有1-DPA

如图3a所示，在尾静脉注射1-DPA

尾静脉注射1-DPA

收集1-DPA

从以上的结果可以看出，探针1-DPA

5、探针在活体水平对顺铂诱导的不同程度急性肾损伤的成像检测

任选15只6-8周龄的雌性BALB/C裸鼠，用顺铂(20mg/kg，腹腔注射)处理不同的时长(0，24，48，72和96h)，构建不同程度的急性肾损伤模型。通过尾静脉注射的方式将含有1-DPA

如图4a所示，在尾静脉注射1-DPA

测定顺铂诱导的急性肾损伤小鼠的肾小球滤过率(GFR)，可以看到在注射了顺铂0，24，48h后，小鼠的肾小球滤过率还没有明显下降(图4d)；但在注射顺铂72h后，可以看到小鼠的肾小球滤过率显著下降，约为5.15μL min

6、探针用于在活体水平NAC对顺铂诱导的急性肾损伤的疗效评估

取15只6-8周龄的雌性BALB/C裸鼠，任选其中12只腹腔顺铂(20mg/kg)构建急性肾损伤模型。剩余3只注射生理盐水作为空白对照。随后通过腹腔注射NAC(400mg/kg)的方式对小鼠肾损伤进行1次(1X，12h)、2次(2X，12和24h)以及3次(3X，12，24和36h)的治疗(图5a)。在顺铂处理后的72h，将含有1-DPA

如图5b所示，在尾静脉注射1-DPA

本发明提供了一种激活型近红外小分子荧光探针及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。