一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法

技术领域

本发明属于蛋白改造技术领域，尤其涉及一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法。

背景技术

艾司利卡西平(S-利卡西平，(S)-10-hydroxy-10,11-dihydro-5H-dibenzo[b,f]axepine-5-carboxamide)是一种新型的抗癫痫药物，可阻断电压门控钠通道活性，抑制脑部神经的异常放电，是醋酸艾司利卡西平(商品名Aptiom)的前体物，也是现有治疗药物奥卡西平在体内的主要活性代谢产物。

奥卡西平在体内可代谢为S-利卡西平和R-立卡西平两种异构体，其中S-异构体比R-利卡西平的不良反应更轻微，且治疗效果更好，S-利卡西平可以更有效地穿过血脑屏障。因此，后续开发出可有效释放S-利卡西平的艾司利卡西平醋酸酯前体药物，它可以在消化道中被有效吸收，并水解作用代谢为S-利卡西平，与奥卡西平相比其机体耐受性更好。

现有文献报道的艾司利卡西平的制备方法主要分为两类，一类是化学催化法，其是使用各类催化物及氢供体还原生成艾司利卡西平，但反应过程中常常需要使用到一些昂贵的催化试剂，整体成本较高，反应路线长，最终产品难以保证较高的收率；另外，反应过程中使用的多种有机试剂，造成后处理困难，难以实现大规模的生产。而另外一类则是生物催化法，多使用全细胞或者胞内酶还原奥卡西平以获得艾司利卡西平。CN102465159A公开了以奥卡西平为底物，以酿酒酵母发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，进行生物转化反应制得艾利西平。CN107475211A公开了使用一株炭疽芽孢杆菌bacillus anthracis获得羰基还原酶，并通过构建两相反应体系，在油/水两相体系进行催化反应将奥卡西平转化为艾司利卡西平。生物催化法制备艾司利卡西平具有转化效率高、反应专一性强、成本低廉等优势，在未来必会有巨大的生产应用前景。但现有的酮基还原酶存在反应活性及专一性较差，对底物的耐受力差，反应效率低，所获得的产物存在较多的异构体成分难以去除等问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酮基还原酶突变体及其制备方法、应用和艾司利卡西平的制备方法，为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种酮基还原酶突变体，所述酮基还原酶突变体为发生了氨基酸突变的酮基还原酶，所述酮基还原酶包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述氨基酸突变的类型包括D77S、P195Y、D207F、D77S/P195Y、P195Y/D207F、D77S/D207F或D77S/P195Y/D207F。

SEQ ID NO:1：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSDFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAPLTPFKVRAGPVDEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。

在本发明中，所述酮基还原酶的编码序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCGATTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCCCCCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTGACGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，所述酮基还原酶来源于Microdochium trichocladiopsis。

在本发明中，通过在Microdochium trichocladiopsis(NCBI ReferenceSequence:XP_046005050.1)来源的酮基还原酶的编码基因的氨基酸序列SEQ IDNO:1的基础上对第77位、195位或207位进行了一个或多个突变构建酮基还原酶突变体。

在本发明中，所述氨基酸突变的类型D77S为将SEQ ID NO:1的第77位天冬氨酸(Asp)突变为丝氨酸(Ser)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型D77S包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSSFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAPLTPFKVRAGPVDEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。

所述氨基酸突变的类型D77S的编码序列包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:4：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCTCTTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCCCCCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTGACGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，所述氨基酸突变的类型P195Y为将SEQ ID NO:1的第195位脯氨酸(Pro)突变为酪氨酸(Tyr)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型P195Y包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSDFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAYLTPFKVRAGPVDEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。

所述氨基酸突变的类型P195Y的编码序列包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:6：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCGATTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCTACCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTGACGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，所述氨基酸突变的类型D207F为将SEQ ID NO:1的第207位天冬氨酸(Asp)突变为苯丙氨酸(Phe)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型D207F包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSDFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAPLTPFKVRAGPVFEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。

所述氨基酸突变的类型D207F的编码序列包括SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCGATTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCCCCCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTTTCGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y为将SEQ ID NO:3的第195位脯氨酸(Pro)突变为酪氨酸(Tyr)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y包括SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSSFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAYLTPFKVRAGPVDEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。

所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y的编码序列包括SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:10：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCTCTTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCTACCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTGACGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，所述氨基酸突变的类型P195Y/D207F为将SEQ ID NO:5的第207位天冬氨酸(Asp)突变为苯丙氨酸(Phe)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型P195Y/D207F包括SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSDFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAYLTPFKVRAGPVFEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。

所述氨基酸突变的类型P195Y/D207F的编码序列包括SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:12：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCGATTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCTACCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTTTCGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，所述氨基酸突变的类型D77S/D207F为将SEQ ID NO:3的第207位天冬氨酸(Asp)突变为苯丙氨酸(Phe)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型D77S/D207F包括SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSSFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAPLTPFKVRAGPVFEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD。

所述氨基酸突变的类型D77S/D207F的编码序列包括SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:14：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCTCTTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCCCCCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTTTCGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y/D207F为将SEQ ID NO:9的第207位天冬氨酸(Asp)突变为苯丙氨酸(Phe)获得的突变体，所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y/D207F包括SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15：

MAIPNIRLGSEAQVPVLAYGTGTTWIKQDGDSLDRKTIDGIKEAIELGYRHLDGAQYYGTEAELGQAIRESGVPRSSFFITTKAVSHVDVEGSLRESCRKLQTDHVDLYLIHEPFSATDEQDLQQTWADMEICLDKGLARHIGVSNFLPTHLDSLVKTARVKPAVNQIELHPYLQRQKVIQYCRENGIVLQGFAYLTPFKVRAGPVFEICSKLAERHGVSESSILLRWVVDQGIIVITTSGQKTRLQQYLRELPNFVLSQEEVQEIAAAGKAKSVRQFFADGFGPDNFD

所述氨基酸突变的类型D77S/P195Y/D207F的编码序列包括SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16：

ATGGCGATACCAAATATTCGACTCGGTTCGGAAGCCCAAGTCCCTGTGCTCGCGTACGGCACTGGGACGACGTGGATCAAACAGGATGGGGACAGTCTAGACCGGAAGACGATTGATGGTATCAAAGAGGCGATAGAACTCGGCTACCGCCATCTTGATGGAGCACAATACTACGGCACTGAGGCAGAATTGGGGCAGGCCATCCGCGAGTCGGGTGTCCCTCGCTCCTCTTTCTTCATAACAACAAAGGCCGTCTCACACGTCGACGTCGAGGGGTCGCTACGAGAGAGCTGTCGAAAGTTGCAAACGGATCATGTCGACCTATATCTCATACATGAACCATTCTCTGCAACGGACGAGCAAGATCTCCAGCAGACGTGGGCGGACATGGAGATCTGTCTTGACAAGGGGCTCGCTCGCCACATTGGCGTCTCCAACTTTCTCCCGACACACCTGGATTCTCTAGTCAAGACAGCCCGGGTGAAGCCGGCCGTCAACCAAATCGAGCTGCACCCGTACCTCCAGCGGCAGAAAGTCATCCAATACTGCAGGGAGAACGGCATCGTCTTGCAAGGGTTCGCCTACCTCACTCCCTTCAAGGTCCGGGCCGGTCCGGTTTTCGAGATCTGCTCCAAGCTGGCTGAACGACATGGCGTCAGTGAGTCCTCGATTCTCCTGCGATGGGTTGTGGACCAAGGAATCATTGTCATCACAACCAGCGGCCAGAAGACGCGCTTGCAACAATATTTGCGCGAGTTGCCTAACTTTGTGCTCTCCCAGGAGGAAGTGCAGGAGATAGCGGCAGCTGGCAAAGCCAAGAGCGTCAGGCAATTTTTTGCTGATGGGTTTGGACCCGACAACTTTGATTGA。

在本发明中，获得以上所述突变体D77S、P195Y、D207F、D77S/P195Y、P195Y/D207F、D77S/D207F和D77S/P195Y/D207F所需的各对引物序列如下所示：

获得D77S突变类型的正向引物的核苷酸序列(D77S-F)包括SEQ ID NO:17所示的序列，反向引物的核苷酸序列(D77S-R)包括SEQ ID NO:18所示的序列。

SEQ ID NO:17：

AGTCGGGTGTCCCTCGCTCCTCTTTCTTCATAACAACA。

SEQ ID NO:18：

AGAGGAGCGAGGGACACCCGACTCGCGGATGGCCTGCC。

获得P195Y突变类型的正向引物的核苷酸序列(P195Y-F)包括SEQ IDNO:19所示的序列，反向引物的核苷酸序列(P195Y-R)包括SEQ ID NO:20所示的序列。

SEQ ID NO:19：

TCGTCTTGCAAGGGTTCGCCTACCTCACTCCCTTCAAG。

SEQ ID NO:20：

GTAGGCGAACCCTTGCAAGACGATGCCGTTCTCCCTGC。

获得D207F突变类型的正向引物的核苷酸序列(D207F-F)包括SEQ IDNO:21所示的序列，反向引物的核苷酸序列(D207F-R)包括SEQ ID NO:22所示的序列。

SEQ ID NO:21：

AGGTCCGGGCCGGTCCGGTTTTCGAGATCTGCTCCAAG。

SEQ ID NO:22：

GAAAACCGGACCGGCCCGGACCTTGAAGGGAGTGAGGG。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码如第一方面所述的酮基还原酶突变体。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述表达载体为pET系列质粒，优选为pET-28a。

第四方面，本发明提供了一种酮基还原酶突变体转化子，所述酮基还原酶突变体转化子为表达第一方面所述的酮基还原酶突变体的基因工程菌株。

优选地，所述酮基还原酶突变体转化子含有第二方面所述的核酸分子。

优选地，所述酮基还原酶突变体转化子含有第三方面所述的表达载体。

优选地，所述基因工程菌株包括大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)。

第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述的酮基还原酶突变体的制备方法，所述制备方法包括：

构建表达载体，转化至受体细胞中，构建酮基还原酶突变体转化子；

培养所述酮基还原酶突变体转化子，收集培养物，得到所述酮基还原酶突变体。

作为优选技术方案，本发明所述酮基还原酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

将编码酮基还原酶突变体的核酸分子经酶切连接重组到表达载体pET-28a(+)中，再转入受体细胞BL21(DE3)中，筛选阳性克隆，得到酮基还原酶突变体转化子；

将酮基还原酶突变体转化子置于LB液体培养基中活化，再进行发酵培养，收集细胞，破碎离心后，得到含有酮基还原酶突变体的消化液。

第六方面，本发明提供第一方面所述的酮基还原酶突变体在催化酮基还原反应中的应用；

优选地，所述酮基还原反应的底物包括奥卡西平。

优选地，所述应用为利用所述酮基还原酶突变体催化奥卡西平进行还原反应制备得到艾司利卡西平。

第七方面，本发明提供一种艾司利卡西平的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将含有奥卡西平的溶液和含有如第一方面所述的酮基还原酶突变体的酶液混合，进行反应，得到所述艾司利卡西平。

优选地，所述含有奥卡西平的溶液中奥卡西平的浓度为0.1～50g/L，例如0.1g/L、1g/L、3g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L或50g/L，优选为20g/L。

优选地，所述含有奥卡西平的溶液中含有有机溶剂和缓冲溶液。

优选地，所述有机溶剂包括有机醇，优选异丙醇和/或三乙醇胺。

优选地，所述含有奥卡西平的溶液中异丙醇的体积百分比为20-50％(例如20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％)，优选为40％，三乙醇胺的体积百分比为2-15％(例如2％、5％、8％、10％、13％或15％)，优选为7％。

优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，即K

优选地，所述含有酮基还原酶突变体的酶液的用量为奥卡西平质量的1-5％，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，优选2.5％。

优选地，所述含有酮基还原酶突变体的酶液中还含有葡萄糖脱氢酶、辅酶和葡萄糖。

优选地，所述反应体系中葡萄糖脱氢酶添加浓度为50-300U/L，例如50U/L、80U/L、100U/L、150U/L、200U/L、250U/L或300U/L，优选为100U/L。

优选地，所述辅酶为NADP+。

优选地，所述反应体系中辅酶的浓度为0.01～0.1mol/L，例如0.01mol/L、0.02mol/L、0.04mol/L、0.06mol/L、0.08mol/L或0.1mol/L，优选为0.04mol/L。

优选地，所述反应体系中葡萄糖的含量为奥卡西平质量的30％～100％，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，优选为50％。

优选地，所述含有酮基还原酶突变体的酶液中含有缓冲溶液。

优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，即K

在本发明中，所述反应体系的pH范围为6.5-8.0，例如6.5、6.8、7.0、7.4、7.8或8.0，优选为7.4。

优选地，所述反应的温度为20-45℃，例如20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、38℃、40℃或45℃，优选为35℃。

优选地，所述反应的反应时间为2-48h，例如2h、5h、10h、12h、18h、24h、30h、36h、40h、42h或48h，优选为4-20h。

优选地，所述反应在震荡下进行，所述震荡的转速为50-250rpm，例如50rpm、80rpm、100rpm、150rpm、180rpm、200rpm、230rpm或250rpm，优选为200rpm。

本发明使用所述酮基还原酶突变体能够在高浓度底物(例如大于10g/L)水平下进行反应，而原始酮基还原酶并不能耐受很高的底物浓度。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明的酮基还原酶突变体与原始酮基还原酶相比，其酶活得到明显增强，酶促反应所需时间大大缩短，提高了反应特异性，转化率和产物的光学纯度大幅提升，且酶的底物耐受能力更高，能够在高浓度底物水平下进行反应，实现了奥卡西平向艾司利卡西平的高效转化，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.酮基还原酶突变体菌株的构建

以Microdochium trichocladiopsis基因组(NCBI Reference Sequence:XM_046159711.1)的原始酮基还原酶核苷酸序列(如SEQ ID NO:2所示，由常州基宇生物科技有限公司合成)为模板，在序列两端添加NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点后进行合成，使用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ(购自New England Biolabs公司，根据说明书进行操作)酶切后重组至pET28a载体中。将重组后的载体转化至trans 5α感受态细胞(购自全式金公司)，涂布于含有50μg/mL kana抗性的LB平板中37℃培养过夜，获得带有原始酮基还原酶质粒的重组菌株mt-K0。

挑取mt-K0单克隆至带50μg/mL kana抗性的LB液体培养基，37℃200rpm培养8h，培养后菌液经质粒提取试剂盒提取出带原始酮基还原酶基因的重组质粒；以提取的质粒为模板，再利用各突变引物(SEQ ID NO:17-22)分别进行单点突变扩增PCR，使用TakaraPrimestar max高保真聚合酶(购自Takara公司)扩增，PCR程序为：98℃预变性3min，30个扩增循环(98℃10s，55℃5s，72℃70s)，72℃10min。扩增产物使用DpnⅠ37℃消化1h去除模板；将突变体质粒转化至BL21 DE3感受态细胞(全式金公司)，涂布于含有50μg/mL kana抗性的LB平板中37℃培养过夜，获得带有酮基还原酶单点突变质粒的重组菌株mt-K1(D77S)、mt-K2(P195Y)、mt-K3(D207F)。

分别挑取mt-K1/2/3单克隆至带50μg/mL kana抗性的LB液体培养基，37℃200rpm培养8h，培养后菌液进行PCR鉴定及测序验证，测序结果正确的菌株mt-K1/2/3提取质粒继续进行其他不同点突变后获得各组多点突变的重组菌株mt-K4(D77S/P195Y)、mt-K5(P195Y/D207F)、mt-K6(D77S/D207F)、mt-K7(D77S/P195Y/D207F)，使用各重组菌株mt-K1～mt-K7用于后续发酵表达。

实施例2.酮基还原酶突变体菌株的表达及粗酶制备

挑取各重组菌株的单菌落，接种于5mL带50μg/mL kana抗性的LB液体培养基中，37℃200rpm摇床培养8h。按2％接种量取种子液转接至50mL含50μg/mL kana抗性的TB液体培养基中，37℃200rpm摇床培养约2h，至OD

实施例3.应用酮基还原酶突变体酶促制备艾司利卡西平

在500mL三角瓶依次加入60mL异丙醇、10.5mL 0.1M三乙醇胺和3g固体奥卡西平，补加1M K

转化率HPLC检测方法：取样品1mL按照1:9比例加入DMSO:乙腈(50％:50％)溶液中。超声处理30min后10000rpm离心5min，取50μL上清液加入950μL乙腈中，0.22μm滤膜过滤后取10μL上机分析。

色谱条件：安捷伦XDB C18色谱柱，流动相为甲醇：水＝(体积比为50％：50％)，25℃、1.4mL/min、波长210nm。

表1原始酮基还原酶及各酮基还原酶突变体在不同反应时间下转化率对比

实施例4.应用酮基还原酶突变体酶促制备艾司利卡西平

在500mL三角瓶依次加入60mL异丙醇、10.5mL 0.1M三乙醇胺和0.15g固体奥卡西平，补加1M K

实施例5.应用酮基还原酶突变体酶促制备艾司利卡西平

在500mL三角瓶依次加入60mL异丙醇、10.5mL 0.1M三乙醇胺和6g固体奥卡西平，补加1M K

实施例6.酶促产物的纯化检测

各酮基还原酶突变体酶液按实施例3的方法反应16h后，将各试验后的反应混合物按如下方法处理：

将反应混合液转移到圆底烧瓶中，50℃下通过旋转蒸发去除异丙醇，经3h浓缩后加入50mL纯水，继续蒸馏过夜。将浓缩后的粗产物通过漏斗抽滤收集，用100mL水和100mL庚烷3次洗涤后抽滤，在恒温烘箱内35℃干燥40h。

在干燥后的粗品中加入200mL甲醇，并加热到40℃搅拌1h。加入1.0g硅藻土，在40℃下搅拌15min。通过砂芯漏斗过滤去除硅藻土，过滤物用50mL甲醇洗涤。然后将滤液减压蒸馏至约20mL体积。放入4℃冰箱冷却30min，加入20mL 4℃纯水静置30min，将得到的溶液在4℃下搅拌30min。沉淀产物通过砂芯漏斗过滤，过滤物用20mL纯水冲洗2次，然后在恒温烘箱中30℃干燥24h后获得纯品，各组具体结果如下表所示。

表2原始酮基还原酶各酮基还原酶突变体酶液反应产物的ee值对比

手性检测(HPLC)：称量50.0mg纯化后的艾司利卡西平置入100mL容量瓶中，加入乙腈超声10min后再用乙腈定容，0.22μm滤膜过滤后取10μL上机分析。色谱条件：DaicelCHIRALCEL OD-H液相手性色谱柱，流动相：正己烷：异丙醇＝(95％：5％体积比)，15℃、1.0mL/min、波长215nm。

计算公式：ee％＝(S-利卡西平峰面积-R-利卡西平峰面积)/(S-利卡西平峰面积+R-利卡西平峰面积)×100％。

由如上结果，可以看出，通过在原始的酮基还原酶中引入突变，显著提高了酶活，使得制备艾司利卡西平时，转化率和产物的光学纯度均有不同程度的提升，特别是多点突变的重组菌株mt-K4(D77S/P195Y)、mt-K5(P195Y/D207F)、mt-K6(D77S/D207F)和mt-K7(D77S/P195Y/D207F)能够获得更为显著的转化率和产物的光学纯度的提升，反应16小时后，转化率能够达到86％以上。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的酮基还原酶突变体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。