一株棒孢新拟盘多毛孢真菌及其在草莓病害的鉴定中的应用

技术领域

本发明属于微生物菌株及草莓病害鉴定技术领域，具体涉及一株棒孢新拟盘多毛孢真菌及其在草莓病害的鉴定中的应用。

背景技术

近两年来，草莓种植区出现了一种新症状的病害，国内多地包括北京、辽宁、河北、陕西、山东、浙江、甘肃、云南、河南等大部分草莓种植区均有发现，并随着种苗的运输等因素逐渐在国内蔓延开来，已严重影响我国草莓产业的健康发展。新发现的这种病害发病大都出现在草莓现蕾之后，此时已经错过最佳补苗阶段，再加上此病害一旦发病，发病面积就很大，因此死苗造成的损失将无法弥补。

目前，这种新症状病害还没有正式的名称，国内还没有机构严格按照植物病害认定的科赫法则做出确切答案，莓农大多称其为“空心病”或“断头病”。

根据田间观察的结果，当草莓的根部被病原菌侵染后，短缩茎发生病变，内部呈现水烫状，逐渐发生液化，最终会出现空心的状态；其叶片背部会出现不规则的黑色斑块，点状发生，逐步增多，汇聚成片。发病严重时，整个植株萎蔫，短缩茎用手轻轻一掰就会断掉。本发明将此种病害称为空心病。

由于空心病在叶片上的表现症状，有人推断此病是由黄单胞菌

查询文献与资料发现，国外还没有空心病这一新病害的相关报道，而国内的相关研究也几乎处于空白阶段，甚至连引发此病症的病原菌都没有确切报道。仅有宁志怨

发明内容

本发明提供了一株棒孢新拟盘多毛孢真菌及其在草莓病害的鉴定中的应用，为草莓空心病这一新病害的诊断和防治奠定基础。

本发明由如下技术方案实现的：一株棒孢新拟盘多毛孢真菌，该菌株的名称为：棒孢新拟盘多毛孢

该菌株的形态学特征为：分子孢子盘的直径约为150-250μm，黑色散生在菌落表面，表皮发生不规则开裂散发出分生孢子。分生孢子呈纺锤形或长梭形，18–26×6.5–8.5 μm ，整个孢子呈现直或者略微弯曲的状态，一共有5个细胞，4个隔膜，分隔处缢缩不明显。

基部细胞长4-5μm，颜色透明，三角锥形；中间3个细胞颜色较深，多位褐色，3个细胞长分别为4.5–5.4μm、5.4–6.5μm、4.3–5.7μm；顶端细胞长为3.2–4.5μm，形状为圆锥形，颜色透明。基部细胞具有1-2根无色附属着丝，管状，长为21-30μm；顶端有1根不分支的附属丝，无色透明。本发明所述棒孢新拟盘多毛孢

本发明的另一目的为提供了所述棒孢新拟盘多毛孢作为对照品在用于鉴定草莓空心病病害方面的应用。

实验结果显示：棒孢新拟盘多毛孢

本发明所述菌株为棒孢新拟盘多毛孢

附图说明

图1为发生病害的草莓根部剖面图；

图2为菌株CMSF-1在PDA培养基上的生长状态，图中：A为正面；B为反面；

图3为菌株CMSF-1的分生孢子；

图4为菌株CMSF-1的多基因系统发育树；

图5为菌株 CMSF-1在不同培养基上的生长状态，图中：A：PDA培养基；B：OA培养基；C：玉米培养基；D：察式培养基；E：淀粉-察式；F：甘露醇-察式；G：果糖-察式；H：葡萄糖-察式；I：乳糖-察式；J：氯化铵-察式；K：尿素-察式；L：胰蛋白胨-察式；M：谷氨酸-察式；N：精氨酸-察式。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。

一、病株采集、分离纯化、鉴定：

1、情况介绍：近两年来，草莓种植区出现了一种新症状的病害，国内多地包括北京、辽宁、河北、陕西、山东、浙江、甘肃、云南、河南等大部分草莓种植区均有发现，并随着种苗的运输等因素逐渐在国内蔓延开来，已严重影响我国草莓产业的健康发展。2020年笔者在山西省榆次市东阳县对草莓病害调查研究发现，一种真菌性病害危害草莓的根部以及叶片。当草莓的根部被病原菌侵染后，短缩茎发生病变，内部呈现水烫状（图1），逐渐发生液化，最终会出现空心的状态；叶片背部会出现不规则的黑色斑块，点状发生，逐步增多，汇聚成片。发病严重时，整个植株萎蔫，短缩茎用手轻轻一掰就会断掉。本发明将此种病害称为空心病。

采集当地草莓病株进行病菌分离纯化，形态和症状描述，并进行草莓盆栽灌根回接实验，对比回接根部与标本根部一致，确定病原菌为棒孢新拟盘多毛孢。

2、病菌分离纯化：供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(北京索莱宝科技有限公司）；供试仪器：主要仪器有Nikon光学显微镜。

于2020年在山西省榆次市东阳县草莓种植基地对病害进行调查，同时进行症状描述，并采集典型病株，描述病株形态为：病株萎蔫，叶片背部有不规则斑点，可产生黑色的分生孢子盘；切开病株的茎基部，可看见内部组织出现水烫状病变，严重者出现空心状态。采集病株进行病菌分离纯化。

病原菌分离纯化：采用组织分离法。将采集的草莓病株根部冲洗干净，用70%酒精对病变部位进行消毒，之后用灭菌的蒸馏水冲洗三遍，在病健交界处切取5mm ×5mm的组织块，用70%酒精对病变部位进行消毒，之后用灭菌的蒸馏水冲洗三遍，放置到PDA培养基中，每个培养皿接种2-4块，25℃培养。

选取生长状态好并杂菌污染少的菌落，当菌丝长度达到2cm时，用接种钩挑取菌落边缘的菌丝体，再次接到 PDA 培养基中央，进行多次的分离纯化，直至菌落生长整齐一致没有杂菌出现。观察菌落形态，并在显微镜下观察分生孢子形态。选择生长良好，状态典型的一株病原菌（编号CMSF-1）进行后续实验。

PDA培养基中分离到的菌株，菌落长出白色菌丝，呈绒毛状，生长迅速，长满整个培养皿，后期会在菌落表面长出黑色分生孢子盘。有些培养皿中菌落出现绿色，黑色和淡黄色菌落。

纯化：纯化得到的菌落呈白色丝绒状，近似圆形，边缘不规则，表面呈波浪状，后期菌落正面未见明显的色素产生，背面淡橘黄色，15d左右会产生黑色分生孢子。最终共获得纯菌株5株。选择生长典型的菌株进行后续实验，编号为CMSF-1。菌株CMSF-1在PDA培养基上的生长状态如图2所示。

3、柯赫氏法则验证：运用柯赫氏法则进行验证，挑选健康的盆栽草莓植株进行回接实验。采用盆栽草莓植株刺伤灌根接种法。选取生长良好，健康无病的“红颜”草莓植株进行实验。

盆栽草莓植株刺伤灌根接种：洗脱病原菌CMSF-1的孢子以制备悬浮液，加入0.01%吐温 20，轻微震荡至孢子均匀分散开，孢子液浓度为 1 ×10

灌根接种实验显示，灌根后40d左右，草莓发生萎蔫，解剖其根部，发现短缩茎内部发生病变，与病株的根部症状一直，将病变组织进行分离纯化，得到的菌株（3株）与接种的菌株一致，菌落为白色绒毛状，菌落呈波浪形，后期会产生黑色分生孢子盘。

4、形态学鉴定：挑取分离纯化的单株菌落菌丝接种到PDA培养基，培养5天，观察菌落性状。

形态学鉴定结果为：分子孢子盘的直径约为150-250μm，黑色散生在菌落表面，表皮发生不规则开裂散发出分生孢子。分生孢子如图3所示，分生孢子呈纺锤形或长梭形，18–26×6.5–8.5μm ，整个孢子呈现直或者略微弯曲的状态，一共有5个细胞，4个隔膜，分隔处缢缩不明显。

基部细胞长4-5μm，颜色透明，三角锥形；中间3个细胞颜色较深，多位褐色，3个细胞长分别为4.5–5.4μm、5.4–6.5μm、4.3–5.7μm；顶端细胞长为3.2–4.5μm，形状为圆锥形，颜色透明。

基部细胞具有1-2根无色附属着丝，管状，长为21-30μm；顶端有1根不分支的附属丝，无色透明。

5、分子学鉴定（DNA提取，PCR扩增，系统发育树构建）：

DNA提取：采用CTAB法提取病原菌基因组DNA。

PCR扩增：利用引物 ITS1/4进行PCR扩增。引物序列： ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC。

扩增体系（50.0 ul）：基因组 DNA（20ng/ul）、 1.0ul 10×Buffer(含 2.5mM Mg2+) 5.0ul 、Taq 聚合酶(5u/μL) 1.0ul 、dNTP（10mM） 1.0ul 、ITS1 引物 (10uM) 1.5ul 、ITS4 引物 (10uM) 1.5ul 、ddH

反应条件：95℃预变性 3 min、95℃变性 30 s、58℃ 30 s、72℃延伸 1 min，共35 个循环，72℃总延伸 7 min，4℃保存。

ITS序列测序：将PCR产物送至派森诺公司测序，测序结果：菌株CMSF-1的ITS序列如SEQ ID NO. 1所示。

（7）构建发育树：测序所得序列在 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行 BLAST 比对，利用MEGA 7.0构建系统发育树。系统发育树如图4所示。

根据比对结果构建系统发育树，结果显示本实验菌株CMSF-1与

N.clavispora

目前，关于草莓空心病的防治研究还处在发展阶段，尤其是空心病的病原菌研究在国内还是很少。本次试验对导致草莓出现新型病害空心病的病原菌分离纯化，致病性检测，再对病原菌进行形态学和分子系统学鉴定，最终确定病原菌为棒孢新拟盘多毛孢。

病原菌鉴定结果，草莓空心病致病菌为棒孢新拟盘多毛孢

二、病原菌生物学特性分析：

1、实验方法：

不同营养条件对病原菌菌丝生长和产孢量的影响：供试培养基选择 PDA、OA、CMA和察式培养基；以察式培养基为基础培养基，将其中的蔗糖用含等碳量的葡萄糖、果糖、甘露醇、可溶性淀粉和乳糖替换，制成含不同碳源的培养基平板；将其中硝酸钠用含等氮量的尿素、氯化铵、胰蛋白胨、谷氨酸和精氨酸替换，制成含不同氮源的培养基平板。接种后黑暗条件下25℃，培养7d。

环境条件对病原菌菌丝生长和产孢量的影响：采用PDA 培养基培养菌株。温度试验设10、15、20、25和30 ℃共5个温度梯度，黑暗培养；光照试验设置24 h连续光照、12h光照12h 黑暗、24 h连续黑暗共3种条件，25 ℃恒温培养。培养时间均为7d。

2、结果与分析：实验结果如图5及表1和2。

从图5和表1中看出菌株CMSF-1在PDA培养基和燕麦培养基上生长状态良好，生长15d后二者培养基中均产生黑色孢子。对于不同碳源来说，菌株CMSF-1在淀粉为碳源的培养基上菌落直径最长，在甘露醇为碳源的培养基上菌丝长势较好；在不同氮源的实验中，菌株CMSF-1在氯化铵和蛋白胨为氮源的察式培养基上生长状态较好。综合考虑成本等客观因素，最合适菌株CMSF-1的培养基就是PDA培养基。表2结果表明，菌株CMSF-1的菌丝生长最适宜的生长温度是25℃，最佳光照培养条件是黑暗培养。综上所述，菌株CMSF-1的最适培养基为PDA培养基，最佳碳源是可溶性淀粉，最佳氮源是胰蛋白胨，最适生长温度25℃，最佳培养条件是黑暗培养。

表1 不同培养基上菌株CMSF-1的生长状态

表2：不同培养条件下菌株CMSF-1的生长情况

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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