一种条锈菌效应蛋白及其在抗条锈菌中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种条锈菌效应蛋白及其在抗条锈菌中的应用。

背景技术

小麦条锈病（Stripe rust）是危害小麦生产的重大病害之一，农药防治可以在一定程度上减少条锈病造成的危害，但耗费大量的财力、物力，危害环境安全和人类的健康。条锈病的病原菌条锈菌是一种条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f.sptritici, Pst），通过频繁的毒性变异产生新的致病小种，导致许多新培育的优秀品种丧失抗性。

效应蛋白是病原菌分泌的重要致病因子，大量效应蛋白能够抑制寄主的免疫反应，但也有一些效应蛋白能够在质外体被植物的细胞膜受体识别并激发植物免疫。相对于细菌、卵菌、以及其他真菌，条锈菌效应蛋白的研究相对滞后，特别是具有激发子功能的效应蛋白鲜有报道。因此，鉴定条锈菌具有激发子活性的效应蛋白，利用激发子提高小麦抗病性，对实现小麦广谱、持久抗病性育种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提高植物的条锈菌抗性。

基于上述目的，本申请通过提供一种条锈菌效应蛋白及其在抗条锈菌中的应用来解决该领域中的这种需要。

一方面，本发明涉及一种条锈菌效应蛋白，编码所述条锈菌效应蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，本发明提供的条锈菌效应蛋白中，所述条锈菌效应蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

另一方面，本发明涉及一种表达载体，其包含上述的编码所述条锈菌效应蛋白的核苷酸序列。具体地，由本发明提供的条锈菌效应蛋白的核苷酸序列插入载体pGR106、pCambia1302、pANIC6E中的一种得到。

另一方面，本发明涉及一种重组菌，其包含上述的表达载体。

另一方面，本发明涉及一种重组农杆菌，其包含上述的表达载体。

另一方面，本发明涉及条锈菌效应蛋白在抗条锈菌植物品种改良中的应用，其包括：将上述的编码所述条锈菌效应蛋白的核苷酸序列导入受体植物。

另一方面，本发明涉及上述的表达载体在抗条锈菌植物品种改良中的应用。

另一方面，本发明涉及上述的重组菌在抗条锈菌植物品种培育中的应用。

另一方面，本发明涉及上述的重组农杆菌在抗条锈菌植物品种培育中的应用。

具体地，本发明所述受体植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为本氏烟或拟南芥；所述单子叶植物为小麦。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：

（1）本发明首次揭示了条锈菌效应蛋白Pst_9与植物互作过程中发挥的功能，是一种具有激发子活性的效应蛋白，利用其提高植物抗病性，对于实现抗条锈菌植物育种，提高植物抗条锈菌的广谱、持久抗病性，具有重要意义。

（2）本发明通过将条锈菌效应蛋白Pst_9的编码基因导入重组菌中，感染受体植物，可提高受体植物的条锈菌抗性。

（3）本发明在小麦抗条锈菌的品种培育中意义重大。通过转基因培育后，本发明提供条锈菌效应蛋白Pst_9在小麦叶片过量表达，能够显著增强小麦对条锈菌的抗性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本氏烟叶片注射不同质粒后的坏死情况。Pst_9-pGR106为Pst_9连接至pGR106质粒的重组载体；GFP-pGR106为Pst_9与GFP序列融合的编码框序列连接至pGR106质粒的重组载体；Pst_9SP-GFP-pGR106为Pst_9连接信号肽与GFP序列融合的编码框序列连接至pGR106质粒的重组载体；Pst_9-nosp-pGR106为Pst_9去掉信号肽的编码框序列连接至pGR106质粒的重组载体。

图2为GUS染色技术对Pst_9过表达小麦阳性植株的鉴定结果。WT表示未经过基因修饰的野生型小麦品种Fielder；Pst_9-OE表示过表达Pst_9的转基因小麦。

图3为Pst_9过表达小麦和野生型小麦接种条锈菌CYR32后的表型。WT表示未经过基因修饰的野生型小麦品种Fielder；Pst_9-OE表示过表达Pst_9的转基因小麦；L1表示Pst_9-OE转基因小麦的株系Line1；L2表示Pst_9-OE转基因小麦的株系Line2。

图4为Pst_9过表达小麦和野生型小麦接种条锈菌CYR32后的免疫反应。WT表示未经过基因修饰的野生型小麦品种Fielder；L1表示Pst_9-OE转基因小麦的株系Line1；L2表示Pst_9-OE转基因小麦的株系Line2；TaPR1表示小麦中的病程相关基因1；TaPR2表示小麦中的病程相关基因2；*代表P<0.05，**代表P<0.01。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述各实施例中实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述药剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到；所述指标数据，如无特殊说明，均为常规测量方法。

实施例1

本实施例提供了本发明提供的条锈菌效应蛋白（Pst_9）诱导植物免疫和细胞坏死试验。

利用NotI、ClaI限制性内切酶双酶切pGR106质粒，利用PCR技术分别获得Pst_9以及GFP的全长编码框序列、Pst_9信号肽序列（1-60 bp）与GFP序列融合的编码框序列、Pst_9去掉信号肽的编码框序列（61-726 bp）。将PCR获得的编码框序列连接至NotI、ClaI双酶切的pGR106质粒。具体重组步骤参见Thermo Scientific公司的限制性内切酶说明书。将重组质粒转化大肠杆菌菌种DH5α，经过PCR鉴定为阳性且测序正确的克隆即含有目标基因的表达载体。

将Pst_9-pGR106、GFP-pGR106、Pst_9SP-GFP-pGR106、Pst_9-nosp-pGR106的质粒分别转化至农杆菌菌株GV3101，利用PCR鉴定阳性单克隆，在超净台中将阳性单克隆挑至含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，放置于摇床中，220rpm、28℃过夜培养至OD600=1.0。

Pst_9-pGR106为Pst_9连接至pGR106质粒的重组载体。GFP-pGR106为Pst_9与GFP序列融合的编码框序列连接至pGR106质粒的重组载体。Pst_9SP-GFP-pGR106为Pst_9连接信号肽与GFP序列融合的编码框序列连接至pGR106质粒的重组载体。Pst_9-nosp-pGR106为Pst_9去掉信号肽的编码框序列连接至pGR106质粒的重组载体。

编码效应蛋白Pst_9的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。Pst_9SP-GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。Pst_9-nosp的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。Pst_9的信号肽（SP）序列为：

“ATGATTAAAGCTTCAGTAGTCGCCTTGTGCATGTTCTTGCTAGGGTCAAGCGTTTCCGCC”。

以4000 rpm离心收集农杆菌菌体，利用10 mM MgCl

由图1可知，注射含有Pst_9-pGR106质粒农杆菌的叶片位置产生坏死，而对照注射含有GFP-pGR106质粒农杆菌的叶片位置未产生细胞坏死，表明Pst_9能够引起烟草细胞坏死。

实施例2

本实施例提供了Pst_9基因过量表达转基因小麦的产生和抗病性鉴定试验。

利用PCR技术获得Pst_9的全长编码框序列，利用Gateway® BP Clonase® II 酶将获得的Pst_9基因全长编码框序列连接至中间载体pDONR221。利用限制性内切酶NruI将构建好的Pst_9-pDONR221载体线性化，利用Gateway® LR Clonase® II酶将线性化的Pst_9-pDONR221序列连接至目的载体pANIC6E载体，具体重组步骤参见Thermo Scientific公司的限制性内切酶和Invitrogen公司的Gateway® BP Clonase® II、Gateway® LRClonase® II说明书。将重组质粒转化大肠杆菌菌种 DH5α，经过PCR鉴定为阳性且测序正确的克隆即含有 Pst_9基因的过量表达载体。

以小麦品种Fielder幼胚愈伤组织为转化受体，采用农杆菌介导法将Pst_9基因过量表达载体导入到受体材料中，经过与农杆菌 EHA105共培养后，再进行草铵膦抗性愈伤组织的筛选、再生、生根等步骤产生T0代转基因植株。

从小麦二叶采集2cm左右的幼嫩片段，浸泡在购自于北京酷来搏科技有限公司的GUS染色液中，-100 pka下抽气15分钟，37℃黑暗条件下孵育过夜，转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色，筛选阳性株系，GUS染色结果如图2所示。

T0代转基因植株自交产生后代，选取两个独立的Pst_9过量表达转基因株系进行抗稻瘟病鉴定。将T3代Pst_9过量表达转基因材料穴播在15×15×15cm 花盆里，每盆播种9粒种子，同时播种野生型品种Fielder，放置于16℃、16 h 光照/ 8 h 黑暗条件下生长至二叶期。

将新鲜的条锈菌毒性小种CYR32接种至小麦的第二叶，12℃黑暗条件下保湿24h，再移至16℃、16 h 光照/ 8 h 黑暗条件下培养，十四天后调查条锈病发病情况，并拍照，拍照结果如图3所示。

由图3可知，Pst_9过量表达转基因小麦叶片上的条锈菌夏孢子堆明显少于野生型植株。

提取接种后24 h的小麦叶片RNA，利用诺唯赞公司的HiScript® III RTSuperMix逆转录酶逆转录合成cDNA第一链（方法参见逆转录酶说明书），其中，以cDNA为模板，以TaEF为内参基因（TaEF扩增引物为：TaEF-F: 5’-TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT-3’；TaEF-R: 5’-ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT-3’）。利用植物免疫相关基因TaPR1（扩增引物TaPR1-F: 5’-GAGAATGCAGACGCCCAAGC-3’；TaPR1-R: 5’-CTGGAGCTTGCAGTCGTTGATC-3’）、TaPR2（扩增引物TaPR2-F: 5’-AGGATGTTGCTTCCATGTTTGCCG-3’；TaPR2-R: 5’-AAGTAGATGCGCATGCCGTTGATG-3’）为引物，进行RT-qPCR分析小麦中的免疫反应，试验结果如图4所示。

如图4所示，Pst_9过量表达转基因小麦中的TaPR1、TaPR2表达量显著高于野生型小麦，结果表明Pst_9过量表达能够增强小麦对条锈菌的抗性。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。