奥贝胆酸在制备预防和/或治疗放射性肠损伤药物中的应用

技术领域

本发明涉及制备预防和/或治疗放射性肠损伤药物，具体涉及奥贝胆酸在制备预防和/或治疗放射性肠损伤药物中的应用。

背景技术

盆腹腔及腹膜恶性肿瘤患者在进行放射治疗时，健康的肠道不可避免地暴露在电离辐射中，由于小肠是腹部放疗的主要敏感部位，因此易引起肠道并发症，形成放射性肠损伤，又称放射性肠炎。强辐射引起的肠道损伤可引起全身炎症反应综合征，引起粘膜上皮迅速丧失、出血、感染、败血症甚至死亡。虽然辐射损伤后肠道开始了再生过程，但LGR5+肠干细胞和增殖祖细胞仍然有大量损失。电离辐射会对基底上皮细胞造成损伤，阻碍其更新，导致组织学上可检测到的肠上皮细胞改变，如肠绒毛高度降低且数量减少、炎症、肠壁水肿和纤维蛋白沉淀等。

临床资料显示，约50％的肿瘤患者接受了放射治疗，而其中高达70％的患者在接受腹腔或盆腔放疗后出现不同程度的胃肠道症状，严重影响癌症患者的后续治疗计划和幸存者的生活质量。目前，对于放射性肠损伤尚缺乏有效的治疗手段，仅限于抗感染、营养支持、保护胃肠粘膜、止泻、调节肠道菌群等对症支持治疗和手术切除病变肠段。因此，迫切需要开发更多的辐射防护药物来预防和/或治疗放射性肠损伤。

奥贝胆酸(Obticholic acid，OCA，亦称为6-ECDCA或INT-747)作为一种有效的法尼醇X受体(Farnesoid X受体，FXR)激动剂，是人体初级胆汁酸鹅去氧胆酸(CDCA)的半合成衍生物，临床研究发现OCA的耐受性较好，有利于改善患者症状，延迟疾病进展，提高患者生存率。FXR是一种主要在肝脏和小肠中表达的核受体，而且是胆汁酸、炎症、纤维化和代谢途径的关键调节因子。FXR还具有保护肝脏作用，参与了肝脏解毒、肝再生、防止肝脏纤维化等病理生理过程。目前尚未有文献报道OCA治疗放射诱导的肠损伤。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中缺乏针对放射性肠损伤的辐射防护药物的不足之处，而提供一种奥贝胆酸在制备预防和/或治疗放射性肠损伤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术解决方案如下：

本发明提供一种奥贝胆酸在制备预防放射性肠损伤药物中的应用。

以及奥贝胆酸在制备减轻辐射后肠上皮细胞凋亡药物中的应用。

以及奥贝胆酸在制备治疗放射性肠损伤药物中的应用。

以及奥贝胆酸在制备促进辐射后肠隐窝增殖药物中的应用。

以及奥贝胆酸在制备促进辐射后肠绒毛胞增殖药物中的应用。

以及奥贝胆酸在制备治疗辐射后肠炎症药物中的应用。

以及奥贝胆酸在制备修复辐射后肠黏膜损伤药物中的应用。

本发明的有益效果：

本申请以放射性肠损伤小鼠为研究对象，首次将OCA应用到放射性肠损伤的研究，结果显示：

OCA能很好的保护辐照后的肠绒毛结构、隐窝数量和结肠长度，减轻放射性肠损伤；

OCA能有效改善由放射引起的肠道损伤，降低炎症细胞因子表达；

OCA可以有效激活FXR并促进其在放射性肠损伤中的表达。

附图说明

图1为补充OCA对X射线照射引起的小鼠放射性肠损伤的影响；其中，A为4组小鼠相对实验前其体重的百分比；B为4组小鼠的结肠长度的定量；C为4组小鼠的结肠大体形态图；D为4组小鼠小肠组织HE染色的代表性图像，Scale bar＝50μm；E为小肠组织切片中绒毛长度的定量；F为小肠隐窝数量的量化。数据表示为Mean±SD，n＝10，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001。

图2为OCA对减轻辐射诱导的小鼠小肠上皮细胞凋亡的影响；其中，A为TUNEL染色分析小肠细胞的显微镜视图，Scale bar＝100μm(上)；Scale bar＝20μm(下)；B为测定的每个视野内TUNEL阳性细胞的数量。数据表示为Mean±SD，n＝4，**：p<0.01，****：p<0.0001。

图3为OCA干预后放射性肠损伤小鼠小肠隐窝细胞的增殖情况；其中，A为小鼠小肠组织PCNA和Ki-67的免疫组化染色代表图像，Scale bar＝100μm；B为PCNA阳性细胞免疫组化染色定量分析；C为Ki-67阳性细胞免疫组化染色定量分析。数据表示为Mean±SD，n＝5，**p<0.01，***p<0.001。

图4为OCA对放射性肠损伤小鼠小肠组织中炎症因子的影响；其中，A为小肠组织中IL-1β的表达；B为小肠组织中TNF-α的表达；C为小肠组织中IL-6的表达。数据表示为Mean±SD，n＝8，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5为OCA对放射性肠损伤小鼠小肠组织中ZO-1和Occludin表达的影响；其中，A为小肠组织中ZO-1的表达；B为小肠组织中Occludin的表达。数据表示为Mean±SD，n＝8，*p<0.05，**p<0.01。

图6为OCA对放射性肠损伤小鼠中FXR表达的影响；其中，A为小鼠小肠组织FXR的免疫组化染色代表图像，Scale bar＝100μm；B为小鼠小肠组织中FXR阳性细胞免疫组化染色定量分析；C为qRT-PCR检测小鼠小肠隐窝细胞中FXR的mRNA表达水平；D为Western blot检测小鼠小肠隐窝细胞中FXR的mRNA表达水平；E为小鼠小肠隐窝细胞中FXR表达的定量分析。数据表示为Mean±SD，n＝5，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

本发明奥贝胆酸在制备预防和/或治疗放射性肠损伤药物的应用，以放射性肠损伤小鼠为研究对象，探讨奥贝胆酸在预防和/或治疗放射性肠损伤中的应用。

实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中使用6～8周龄(20～22g)健康成年雄性C57BL/6J小鼠。在12h的暗/光循环下，小鼠可以自由地获得水和食物，正常明暗周期下饲养，定期更换垫料，保证清洁的饲养环境，适应性饲养1周后进行后续实验。本实施例中，使用X射线进行辐射，实验结果同样适用于γ射线或其他射线导致的放射性肠损伤。

一、实验方法

(一)给药剂量和给药方法的选择

以12Gy X射线腹部照射的小鼠建立放射性肠损伤模型，设计两个给药组，给药剂量分别为2.5mg/kg和5mg/kg。从PCNA、Ki67阳性细胞数、隐窝数量、小肠绒毛高度等方面评价OCA给药对放射性肠损伤小鼠的影响。

(二)实验动物分组

40只SPF级C57BL/6J雄性小鼠，采用随机数字表法平均分为4组，分别为：正常对照组、照射对照组、OCA给药组(2.5mg/kg)、OCA给药组(5mg/kg)，每组的小鼠数量n＝10。

(三)给药方法

OCA给药组的小鼠照射一次，照前2小时给药，照后连续5天持续给药，每天给药一次。照射对照组的小鼠照射一次，按以上时间节点给予体积浓度为0.5％的羧甲基纤维素钠。两个OCA给药组分别按每天2.5mg/kg剂量给药和每天5mg/kg剂量给药，每天根据小鼠体重换算剂量，每g小鼠给药量为10μL，照射对照组给予等体积0.5％的羧甲基纤维素钠，正常对照组正常饲养。

(四)药物预处理

给药配置：OCA为粉末状，根据小鼠体重及数量称取对应量的OCA粉末，用带盖试管进行盛装，用0.5％羧甲基纤维素钠对OCA粉末进行溶解，溶解过程中先后用漩涡振荡器和超声进行辅助溶解。

(五)构建放射性肠损伤小鼠模型

X射线装置为Rad Source RS2000系列X射线生物辐照仪，工作电压160kV，工作电流25mA，剂量率1Gy/min(由辐射剂量仪实时监测)。用X射线装置辐照照射对照组、OCA给药组(2.5mg/kg)、OCA给药组(5mg/kg)中小鼠腹部，照射范围为小鼠胸骨剑突至耻骨联合，其余部位用5cm厚铅块屏蔽。X射线以1Gy/min照射，照射总剂量为12Gy，照射后第5天收取样本并进行后续实验。

(六)样本制备

照射后第5天取正常对照组，照射对照组，OCA给药组(2.5mg/kg和5mg/kg)小鼠各10只，取小鼠小肠组织，用4％多聚甲醛固定，进行HE染色，所有检测试剂均采用商品化的试剂盒。对所有小鼠的小肠组织依次通过步骤(七)至步骤(十一)进行处理，得到对应结果。

(七)HE染色

(1)将放射性肠损伤结肠粘膜组织切片放置于60℃烘箱烤片2h；

(2)脱蜡、水化：将组织切片依次放入以下试剂，生物透明剂I10min、生物透明剂II10min、100％酒精5min、90％酒精2min、80％酒精2min、70％酒精2min、超纯水2min；

(3)将组织切片用苏木精染色5min，流水冲洗2min；

(4)将组织切片用盐酸酒精分化数秒，流水冲洗2min；

(5)将组织切片用伊红染色2min，蒸馏水清洗1-2s；

(6)将组织切片依次放入以下试剂，70％酒精1min、95％酒精2min、100％酒精2min，生物透明剂I 5min、生物透明剂II 5min；

(7)将组织切片用中性树胶封片，显微镜下拍照。

(八)TUNEL染色

根据说明书使用TUNEL试剂盒(Roche)对肠道切片进行染色。用共聚焦显微镜观察结果，并对小肠细胞凋亡进行统计学分析。

(九)免疫组化染色

(1)将步骤(八)中得到的组织切片脱蜡复水后使用柠檬酸钠抗原修复液进行微波抗原修复，先中高火往下一档5min，缓慢放入切片后高火5min，中低火10min；

(2)将组织切片用PBS冲洗3min×3次，加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min；再用PBS冲洗5min×3次。

(3)抗体孵育：将配好的抗体滴加于组织切片上，4℃孵育10-12h；

(4)孵育后，将组织切片在室温放置15min，PBS冲洗5min×3次；

(5)孵育二抗：滴加试剂二抗后放入湿盒中，室温孵育30min；

(6)对组织切片进行DAB显色，显微镜下观察并中止反应；

(7)苏木素复染核：将组织切片用苏木素染色5min，流水冲洗1min，盐酸酒精分化数秒，流水冲洗2min；

(8)将组织切片依次放入70％酒精1min、95％酒精2min、100％酒精2min，生物透明剂I 5min、生物透明剂II 5min，用中性树胶封片，在显微镜下拍照。

(十)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

①总RNA提取

(1)提取小鼠隐窝细胞，在隐窝细胞中加入1ml的TRIzol，静置5min；

(2)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，静置3min后，4℃、12000rpm离心15min；

(3)轻轻吸取上层水相；

(4)加入500μL的异丙醇到水相中，室温孵育10min；

(5)4℃、12000rpm，离心10min；

(6)弃废液，加入75％乙醇洗涤沉淀；

(7)7500rpm，离心5min，去除残液；

(8)干燥5min后加入无酶水，得到总RNA，测其浓度；

(9)使用NanoDrop 2000测定RNA浓度和纯度，稀释RNA样本至相同浓度，进行反转录，得到的cDNA保存至-20℃冰箱。

②RNA反转录

A.根据下表配置反转录反应体系，配置过程在冰上进行；

B.反应体系在25°反应10min，42°反应15min，85°反应5min，cDNA存-20℃冰箱。

③按照下表配置PCR反应液

其中，正向引物和反向引物如下表所示：

④按照下表设定PCR反应程序设定

⑤使用循环阈值量化正常对照组、照射对照组、OCA给药组(2.5mg/kg)和OCA给药组(5mg/kg)的mRNA水平。以GAPDH为内参基因，采用2

(十一)蛋白质免疫印迹

(1)小肠隐窝细胞蛋白提取及BCA蛋白定量

首先，在RIPA裂解液中加入对应比例的蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和PMSF；置于冰上裂解30min，每隔5min涡旋振荡混匀一次；4℃，12000rpm，离心15min；轻轻吸取上清液，采用BCA定量法；上清液加入5×Loading Buffer，金属浴100℃加热10min使蛋白变性，得到蛋白样品，蛋白样品存于-80℃冰箱用于后续实验。

(2)SDS-PAGE电泳：根据蛋白的分子量配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样量为30μg，首先进行恒压80V，待蛋白迁移至分离胶(约30min)，恒压120V继续电泳；

(3)转膜：预先使用甲醇激活0.22μm的PVDF膜15s，恒流200mA转膜湿转120min，转膜时间根据具体的分子量确定；

(4)封闭：5％脱脂奶粉，室温条件下封闭2h；

(5)一抗孵育：一抗在4℃孵育过夜；

(6)TBST洗膜5min×3次；

(7)二抗孵育：1:5000稀释相应种属二抗，室温条件下孵育2h；

(8)洗膜5min×3次；

(9)HRP-ECL化学发光法发光，Image J分析条带。

二、统计学分析

实验分析中的所有数据均使用GraphPad Prism 9.2软件(San Diego，CA，USA)生成。采用非配对t检验或单因素方差分析，所有值都以Mean±SD表示，其中p<0.05被认为有统计学意义。

三、实验结果

(一)补充OCA能够减轻X射线照射引起的小鼠放射性肠损伤

为探讨OCA对放射性肠损伤是否具有保护作用，给予C57BL/6J小鼠X射线12Gy照射，照射前1小时给予不同剂量的OCA(2.5mg/kg或5mg/kg)，连续5天，经X射线12Gy照射的小鼠为放射性肠损伤小鼠。结果如图1所示，图1的A可以看出OCA促进照射小鼠体重的增长，图1的B和C可以看出OCA明显增加了小鼠结肠的长度，图1的D、E和F可以看出OCA明显增加了隐窝数量和肠绒毛长度。结果表明，补充OCA能够减轻小鼠放射性肠损伤。

(二)OCA可减轻辐射诱导的小鼠肠上皮细胞凋亡

为了研究OCA对小鼠小肠上皮细胞凋亡的影响，我们采用TUNEL法检测凋亡细胞的变化，结果如图2所示，与对照组相比，腹部照射暴露后小鼠的凋亡细胞更多，OCA明显减少了凋亡细胞的数量。因此，OCA可以减轻高剂量辐射诱导的小鼠小肠上皮细胞的凋亡。

(三)OCA促进放射性肠损伤小鼠小肠隐窝细胞增殖

为探讨OCA对放射性肠损伤小鼠隐窝细胞增殖是否具有保护作用，给予C57BL/6J小鼠X射线12Gy照射，照射前1小时给予不同剂量的OCA，连续5天。对放射性肠损伤小鼠小肠组织中PCNA和Ki-67的表达水平进行免疫组化检测。结果如图3所示，辐射明显降低了PCNA和Ki-67在小鼠小肠隐窝细胞中的表达水平，而OCA促进了PCNA和Ki-67在小鼠小肠隐窝细胞中的表达。提示OCA能够促进放射性肠损伤小鼠小肠隐窝细胞的增殖。

(四)OCA降低了放射性肠损伤小鼠小肠组织中炎症因子的表达

为检测OCA在放射性肠损伤小鼠中是否具有抗炎作用，通过qRT-PCR检测小肠组织中IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平。结果如图4所示，辐照后IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平上调，OCA处理可显著降低这3种炎症细胞因子在小肠组织中的表达。这些结果表明，OCA可能通过降低IL-1β、TNF-α和IL-6的表达，对辐射损伤小鼠具有抗炎作用。

(五)OCA促进放射性肠损伤小鼠小肠组织中ZO-1和Occludin的表达

紧密连接关键蛋白ZO-1和Occludin是肠黏膜机械屏障的最主要组成部分，广泛分布于相邻肠上皮细胞间，研究显示其表达在肠黏膜损伤修复中发挥重要作用。如图5所示，与正常对照组小鼠相比，照射对照组小鼠小肠组织紧密连接关键蛋白ZO-1和occludin的表达明显降低，而OCA给药组的小鼠小肠组织紧密连接关键蛋白的表达较照射对照组升高。

(六)OCA促进放射性肠损伤小鼠中FXR的表达

BAs的调节功能主要是细胞内配体激活核受体(NRs)激活的结果，如法尼醇X受体(FXR，NR1H4)和细胞表面G蛋白偶联受体(GPCRs)，特别是G蛋白偶联BAs受体TGR5，为了深入了解OCA促进辐照后肠道再生的潜在机制是否涉及FXR，小鼠经腹部照射并给予OCA，5天后取小鼠小肠和结肠组织进行免疫组化染色、免疫印迹和qRT-PCR检测FXR的表达，结果如图6所示，辐射后FXR在放射性肠损伤小鼠小肠组织中的表达水平降低，而OCA能够显著增强FXR在辐照后小鼠小肠组织、结肠组织中的蛋白表达水平和小鼠小肠组织中的mRNA表达水平。

四、分析

小肠对辐射高度敏感，是腹部肿瘤放射治疗时的主要损伤部位。放射性肠损伤严重影响肿瘤放疗的疗效，是腹盆腔放疗的主要剂量限制因素，目前尚无有效的防治方法。因此，寻找一种有效的药物和保护靶点来解决辐射引起的肠道损伤具有重要意义。

奥贝胆酸(OCA)为一种FXR激动剂，FXR是一种胆汁酸核受体，在肠道组织中高表达，参与胆汁酸稳态和肠道炎症。除胆汁酸外，许多FXR激动剂也在开发中，OCA是一种有效的选择性FXR激动剂，已被测试为几种肝脏疾病的治疗选择。

在本研究中，我们观察到OCA对辐射引起的肠道损伤具有保护作用。在实验中，我们发现小鼠照射前2小时开始补充OCA有利于维持小鼠腹部辐照期间的体重。通过对小鼠小肠组织切片进行HE染色，发现腹部照射后小鼠小肠隐窝结构出现异常，表现为隐窝扭曲、萎缩以及表面不规则，腺体结构紊乱和大量炎症细胞浸润等。腹部照射小鼠补充OCA后，肠隐窝和绒毛结构得到了很好的改善。辐射诱导的组织损伤增加了凋亡细胞的数量，OCA可显著减少TUNEL阳性细胞的数量，表明OCA可通过减轻辐射诱导的肠上皮细胞凋亡来预防辐射诱导的肠道损伤。细胞的增殖能力与肠道损伤的修复有关，PCNA和Ki67是增殖的标志，代表小肠细胞的自我修复能力，OCA处理促进了小鼠辐射损伤后肠道细胞的增殖。OCA可有效降低小肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平，对辐射损伤小鼠具有抗炎作用。肠黏膜机械屏障是肠道抵御外来侵袭的第一道屏障，防止肠腔内有害物质侵袭，对调节细胞通透性发挥重要作用。OCA可通过升高ZO-1和Occludin的表达保护肠上皮细胞屏障，改善肠上皮细胞通透性，进一步修复肠黏膜损伤。我们的结果显示，放射性肠损伤小鼠中FXR的表达降低，而OCA可以促进FXR在小鼠小肠组织的表达，激活FXR具有细胞保护作用，促进肠道损伤修复。

综上，我们的研究表明OCA对辐射引起的肠道损伤具有保护作用。我们发现OCA通过促进FXR的表达来减轻小鼠放射性肠损伤，我们证实了FXR对放射性肠损伤具有预防和/或治疗的作用，同时，OCA可以改善小肠上皮细胞凋亡，从而为临床预防放射性肠损伤，提供了新的治疗靶点。OCA可能在未来放射性肠损伤的治疗中发挥重要作用。