一种鬼臼毒素脂质衍生物、纳米载体及其制备方法和在肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明涉及一种鬼臼毒素脂质衍生物及纳米载体，具体地说，涉及一种环境响应鬼臼毒素脂质纳米载体及其制备方法和在化学治疗和免疫治疗肿瘤领域中的应用。

背景技术

恶性细胞已被认为开发了多种逃避免疫检测的机制，因此在免疫抑制肿瘤微环境中出现了唤醒衰竭免疫细胞的各种治疗策略。程序性细胞死亡-1(PD-1)是一种众所周知的免疫检查点受体，可以在活化的T细胞上表达。许多实体肿瘤过度表达程序性细胞死亡配体1(PD-L1)与PD-1相互作用，通过抑制激酶信号通路来抑制T细胞增殖和活性。这种机制推动了针对PD-1/PD-L1的单克隆抗体和治疗性肽拮抗剂的发展。然而，由于单克隆抗体或肽拮抗剂都存在免疫原性问题和肿瘤组织渗透性差的问题，因此，需要开发新的用于免疫治疗肿瘤的策略。

鬼臼毒素(PPT)，一种众所周知的天然存在的芳基四氢化萘木质素，通过破坏微管组织和抑制有丝分裂纺锤体的形成，显示出对各种癌细胞系的有效抗肿瘤作用。尽管PPT具有显著的抗肿瘤作用，但其溶解性差和显著的毒性使其在全身性癌症治疗中的临床应用并不成功。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提高鬼臼毒素的溶解性和克服鬼臼毒素的毒副作用强，而提供一种鬼臼毒素脂质衍生物、纳米载体及其制备方法和在肿瘤化学和免疫治疗中的应用，增强鬼臼毒素的生物相容性和治疗效力。

本发明的采用的技术方案如下：

本发明的目的之一是提供一种鬼臼毒素脂质衍生物，包括鬼臼毒素衍生物和脂溶性物质，其中鬼臼毒素衍生物包含鬼臼毒素和小分子，具有通式I的结构：

其中：A选自氨基、C

L为离去基团，选自羟基、巯基、卤素、氨基、甲氧基、乙氧基、叔丁氧基、叠氮基，优选：羟基、氨基和叠氮基；

R

R

X选自

本发明的目的之二是提供一种上述鬼臼毒素脂质衍生物的制备方法，所述制备方法为：在催化剂作用下，鬼臼毒素衍生物与脂溶性物质通过光延反应或缩合反应制备得到化合物I鬼臼毒素脂质衍生物；

所述鬼臼毒素衍生物具有通式II的结构：

其中：

L

所述脂溶性物质选自C

基于以上技术方案，优选的，所述疏水性氨基酸选自苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸。

基于以上技术方案，优选的，所述鬼臼毒素衍生物为N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素，所述脂溶性物质为1-十四烷酸、1-十四烷基氨基甲酸或1-十四烷碳酸酯。

基于以上技术方案，优选的，所述有机溶剂Ⅰ为四氢呋喃、二甲基甲酰胺、甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷的一种或几种。

基于以上技术方案，优选的，所述催化剂为偶氮二羧酸二乙酯、三苯基膦、1-羟基苯并三唑、二环已基碳二亚胺、N,N-二异丙基碳二亚胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯的一种或几种。

基于以上技术方案，具体地，上述鬼臼毒素脂质衍生物的制备方法，包括如下步骤：

将鬼臼毒素衍生物和脂溶性物质溶解于有机溶剂Ⅰ中，在催化剂作用下，0-60℃搅拌反应0.5-2h，将反应溶液减压蒸干、薄层色谱纯化后，得到化合物I鬼臼毒素脂质衍生物。

基于以上技术方案，优选的，所述鬼臼毒素衍生物与脂溶性物质的质量比为0.5-10：0.1-30，催化剂的用量相当于鬼臼毒素衍生物的1-2.4eq倍量。当催化剂使用两种的时候，每种催化剂的用量相当与鬼臼毒素衍生物的1-1.42eq倍量。

基于以上技术方案，优选的，所述鬼臼毒素衍生物的质量与有机溶剂Ⅰ的体积的比例为0.5-10g：5-10mL。

本发明的目的之三是提供一种鬼臼毒素脂质纳米载体的制备方法，利用上述鬼臼毒素脂质衍生物的两亲性结构，可以自组装形成纳米载体；所述鬼臼毒素脂质衍生物的载体的制备方法，包括如下步骤

1)将上述鬼臼毒素脂质衍生物、或上述鬼臼毒素脂质衍生物和鬼臼毒素衍生物溶于有机溶剂Ⅱ中，然后除去所述有机溶剂Ⅱ，得到处理后物质；

2)将步骤1)所得到的所述处理后物质用水性介质水化，进行温预超声，得到鬼臼毒素脂质纳米载体。

基于以上技术方案，优选的，步骤1)中，所述有机溶剂Ⅱ为氯仿和/或甲醇。

基于以上技术方案，优选的，本发明所提供的纳米载体，包括鬼臼毒素脂质衍生物、或鬼臼毒素脂质衍生物和鬼臼毒素衍生物，所述鬼臼毒素脂质衍生物和鬼臼毒素衍生物的摩尔比为100:1—1:20，优选30:1—1:2。

基于以上技术方案，优选的，步骤1)中采用蒸发、氮气吹膜、旋转蒸发、冷冻干燥的一种或几种方法除去溶剂。

基于以上技术方案，优选的，步骤1)中得到的处理后物质置于真空箱内室温下干燥12-36h。

基于以上技术方案，优选的，步骤2)中，所述水性介质为纯水或缓冲溶液，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲溶液。

基于以上技术方案，优选的，所述温预温度为50-60℃，优选为55℃；所述水化时间为2h-3h。

基于以上技术方案，具体为：将鬼臼毒素脂质衍生物、或鬼臼毒素脂质衍生物和鬼臼毒素衍生物溶于有机溶剂Ⅱ中利用薄膜超声分散法将其均匀分散于容器表面，真空干燥12-36h，优选时间24h，然后缓慢滴入水，同时50-60℃下超声振荡2h-3h，制备出稳定的鬼臼毒素脂质纳米载体。

本发明的目的之四提供上述制备方法得到的鬼臼毒素脂质纳米载体。

本发明的目的之五提供上述鬼臼毒素脂质纳米载体在治疗肿瘤中的应用，所述肿瘤细胞包括黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤。

本发明采用鬼臼毒素药物母核为疏水核，在其上链接小分子亲水基团形成鬼臼毒素衍生物，并引入高度疏水长链起稳定作用的脂溶性物质，制备了两亲性结构的鬼臼毒素脂质衍生物，进而制备出鬼臼毒素脂质纳米载体。通过改变脂溶性物质、小分子亲水基团的类型和大小，以及脂溶性物质和鬼臼毒素衍生物的投料比，可以合成不同结构的鬼臼毒素脂质衍生物及纳米载体。

本发明提供的鬼臼毒素脂质纳米载体具有脂双层的特殊结构，在PPT上链接功能性小分子，一方面，可以解决鬼臼毒素的溶解性(水溶性)差的问题；另一方面，由于PPT和小分子、脂溶性物质之间的连接键，具有酸/酶敏感的肿瘤微环境响应特征，可以解决鬼臼毒素的毒副作用，进而增强肿瘤细胞摄入性能。

本发明鬼臼毒素脂质纳米载体表现出优良的生物相容性，具有良好的抗肿瘤效果，不仅可以在酸和水解酶的存在下释放前药PPT杀伤肿瘤细胞，进而发挥化学治疗的作用，还可以通过小分子释放调剂PD-L1表达，来减少T细胞的凋亡从而避免了肿瘤细胞的免疫逃逸进而发挥免疫治疗的作用，实现化疗和免疫联合治疗的效果。鬼臼毒素脂质纳米载体包载PD-L1的抑制剂microRNA，同时用于PD-L1检查点阻塞，利用PPT的化学治疗和microRNA-424基因与鬼臼毒素脂质纳米载体免疫治疗协同增效的作用，还解决了肿瘤治疗中的单一治疗方法疗效差的问题，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明采用脂溶性疏水长链，小分子亲水基团，制备了鬼臼毒素脂质衍生物。

(2)本发明通过制备鬼臼毒素脂质衍生物及纳米载体，显著改善PPT的溶解性，并提高了PPT的细胞摄入含量。

(3)本发明通过制备鬼臼毒素脂质纳米载体，通过pH环境响应性能，提高对药物的控制释放能力，改善了其毒副作用。

(4)本发明制备的鬼臼毒素脂质纳米载体，不仅可以发挥其化学治疗作用，还可以使肿瘤细胞敏感，发挥免疫治疗的作用。

附图说明

图1为本发明实施例4制备的鬼臼毒素脂质衍生物的

图2为本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体的透射电镜图；

图3为本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体的体外PPT释放曲线；

图4为1-十四烷基氨基甲酸、PPT和本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体对正常细胞(HL7702)的细胞存活率影响实验图，无制剂的等体积培养基作空白对照组；

图5本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体对肺癌细胞(H460)的细胞生存曲线影响实验图；

图6为本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体对细胞周期的影响结果图，无制剂的等体积培养基作空白对照组；

图7为1-十四烷基氨基甲酸、PPT和本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体诱导PD-L1表达的结果示意图；

图8为1-十四烷基氨基甲酸、PPT和本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体诱导CD8

图9为本发明实施例10制备的鬼臼毒素脂质纳米载体-DiI(红色)包载microRNA-424-FAM(绿色)基因在体外细胞的摄入图。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买，其中N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素(PPT)参考文献(Zhou M,Li J,Li C,et al.Tertiaryamine mediated targeted therapy against metastatic lung cancer[J].JournalofControlledRelease,2016:81-93.)制备。

实施例1

取N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a 1.0g(1eq)和1-十四烷基氨基甲酸3a 1.1g(2.8eq)于50mL圆底烧瓶中，加入8mL四氢呋喃溶剂中，再加入偶氮二羧酸二乙酯1.0g(1.2eq)和三苯基膦0.8g(1.2eq)的作用下，常温搅拌反应1.5h，TLC检测反应完全后，溶液减压蒸干，得黄色粉末1.73mg即化合物1a，收率48％。

实施例2

取N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a 0.5g(1eq)和1-十四烷基氨基甲酸3a 2.5g(2.8eq)于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二甲基甲酰胺溶剂中，再加入N,N′-二异丙基碳二亚胺5ml(1.0eq)和1-羟基苯并三唑(1.2eq)，搅拌下，0℃反应2h，TLC检测反应完全后，溶液减压蒸干，得黄色粉末2.08mg即化合物1b，收率59％。

实施例3

取N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a10 g(1eq)和1-十四烷基氨基甲酸3a10 g(1.8eq)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL二甲基甲酰胺溶剂中，再加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯17.8g(1.2eq)和N，N-二异丙基乙胺3ml(1.0eq)，搅拌下，0℃反应1h，TLC检测反应完全后，溶液减压蒸干，得黄色粉末13.23mg即化合物1b，收率87％。

实施例4

取N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a 10g(1eq)和1-十四烷基氨基甲酸3a 30g(2.8eq)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL二甲基甲酰胺溶剂中，再加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯17.8g(1.2eq)和N，N-二异丙基乙胺3ml(1.0eq)，搅拌下，0℃反应1.5h，TLC检测反应完全后，溶液减压蒸干，得黄色粉末23.8mg即化合物1a，收率89％。

实施例5

取三苯基膦0.65g(1.2eq)和偶氮二羧酸二乙酯0.49g(1.2eq)和1-十四烷酸3b0.68g(1.2eq)于50mL圆底烧瓶中，加入5mL二氯甲烷溶剂中，再加入N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a 1.0g(1eq)，在氮气保护下，常温搅拌反应1.5h，TLC检测反应完全后，溶液减压蒸干。粗产品用硅胶柱层析纯化(乙醚：戊烷＝1:1)，萃取，硫酸钠干燥，减压过滤浓缩，得白色粉末1.36g即化合物1c，得率78％。

实施例6

取三苯基膦1.9g(1.2eq)和偶氮二羧酸二乙酯1.3g(1.2eq)和1-十四烷酸3b1.96g(1.2eq)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL二氯甲烷溶剂中，常温搅拌0.5h，再加入N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a3.0 g(1eq)，在氮气保护下，60℃搅拌反应1.5h，TLC检测反应完全后，溶液减压蒸干。粗产品用硅胶柱层析纯化(乙醚：戊烷＝1:1)，萃取，硫酸钠干燥，减压过滤浓缩，得白色粉末4.12g即化合物1c，得率81％。

实施例7

取三苯基膦0.65g(1.2eq)和偶氮二羧酸二乙酯0.49g(1.2eq)和1-十四烷碳酸酯3c 0.68g(1.2eq)于50mL圆底烧瓶中，加入5mL四氢呋喃溶剂中，再加入N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a 1.0g(1eq)，在氮气保护下，常温搅拌反应1.5h，TLC检测反应完全后，溶液减压蒸干。粗产品用硅胶柱层析纯化(乙醚:戊烷＝1:0.5)，萃取，硫酸钠干燥，减压过滤浓缩，得白色粉末1.36g即化合物1d，得率80％。

实施例8

取鬼臼毒素脂质衍生物1a 1mg溶解于氯仿1mL中，利用氮吹仪使两种试剂均匀分布在容器表面，室温条件下真空干燥24h，之后将其分散在1mL超纯水中，在55℃下超声振荡2h，得到的鬼臼毒素脂质纳米载体在4℃储存。

实施例9

取鬼臼毒素脂质衍生物1a 2mg和N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a 1mg溶解于氯仿1mL中，利用氮吹仪使两种试剂均匀分布在容器表面，室温条件下真空干燥24h，之后将其分散在1mL超纯水中，在55℃下超声振荡2h，得到的鬼臼毒素脂质纳米载体，在4℃储存。

实施例10

取鬼臼毒素脂质衍生物1a 29mg和N-4β-((4-甲基哌嗪-1-甲基)苯甲酰胺)-4'-去甲基表鬼臼毒素2a 1mg溶解于氯仿1mL中，利用氮吹仪使两种试剂均匀分布在容器表面，室温条件下真空干燥24h，之后将其分散在1mL超纯水中，55℃下超声振荡2h，得到的鬼臼毒素脂质纳米载体，在4℃储存。

实施例11

取100μL本发明实施例10鬼臼毒素脂质纳米载体置于透析袋，透析袋两端扎牢，浸入37℃恒温的40mL释放介质(分别为pH 7.4的水溶液、用盐酸调pH 5.5的水溶液、pH 7.4含8mL水解酶(胰蛋白酶)的水溶液、用盐酸调pH 5.5含8mL水解酶(胰蛋白酶)的水溶液中，摇床速度为200rpm/min。分别在预定时间0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、16h、22h、26h、28h、32h、36h、44h、48h、52h、55h、63h、72h、82h、92h后，从透析袋外释放介质中取出2mL等分试样，同时补充等量相同温度下的新鲜释放介质，以保持总体积。紫外/可见分光光度计测量释放的PPT含量。由图3可知，在肿瘤微环境(pH 5.5)下，药物几乎不释放；在pH 5.5和水解酶(肿瘤细胞内含量大)同时作用下，药物缓慢释放，说明本发明鬼臼毒素脂质纳米载体能够控制释放药物。

实施例12

本发明选择人源正常肝细胞HL7702为研究对象，将HL7702细胞按照1×10

实施例13

本发明选择人源肺癌细胞H460为研究对象，将H460细胞按照1×10

实施例14

本发明选择人源肺癌细胞H460为研究对象，将H460细胞按照1×10

实施例15

本发明选择人源肺癌细胞H460为研究对象，将H460细胞按照2×10

实施例16

将人源肺癌细胞H460细胞按照2×10

实施例17

用淋巴密度梯度离心法分离C57BL/6小鼠的外周血单核细胞。在6孔板中以1×10

实施例18

实验前预处理：首先将标有FAM(绿色)染料的microRNA-424(购买于上海吉玛制药技术有限公司)与实施例10得到的鬼臼毒素脂质纳米载体按照鬼臼毒素脂质纳米载体与标有FAM(绿色)染料的microRNA-424的质量比9:1孵育30min，然后将上述包有microRNA-424的鬼臼毒素脂质纳米载体与DiI(红色)染料(购买于碧云天生物技术有限公司)按照说明书，染色孵育20min，反复离心，除去未标记的DiI染料，得到包有microRNA-424-FAM的鬼臼毒素脂质纳米载体-DiI。

将人源肺癌细胞H460细胞按照2×10

本发明提供的鬼臼毒素脂质纳米载体体外实验表明其富集在肿瘤细胞周围后，可以携带PPT药物和microRNA-424基因穿越细胞膜进入细胞质中释放PPT和microRNA进行化学治疗和基因治疗，同时调节PD-L1表达，实现化学和免疫联合治疗的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。