一种敲低circXPO1的抑制剂及其在制备治疗胶质瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子诊断技术领域，特别涉及一种敲低circXPO1的抑制剂及其在制备治疗胶质瘤药物中的应用。

背景技术

人类胶质细胞瘤(Glioma)是中枢神经系统中最常见的原发型恶性肿瘤，占所有恶性原发性脑和中枢神经系统肿瘤的80％。根据组织学形态和分子特征，2016年世界卫生组织(WHO)重新将胶质细胞瘤分为I-IV型，其中，I型和II型常被称为低等级胶质细胞瘤(Low-grade glioma，LGG)，III型和IV型包括胶质母细胞瘤(GBM)、间变性星形细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤。由于胶质瘤对药物具有极大耐受性、复发率较高并且严重影响患者的生活质量，相应地也极大地缩短了病人的生存时间，所以III型和IV型胶质瘤常常被当作研究对象。低等级胶质瘤发病率较低，只占胶质瘤总数的15％，切除、放射性治疗、化学药物治疗等临床治疗方法均有较好的治疗效果，预后较佳，具有十年以上生存期的患者约占47％。恶性胶质细胞瘤是恶性程度极高的脑肿瘤之一，虽然总人口发病率仅为5.55/10万，但患者存活率只有三分之一，未作干预的患者存活时间仅为三个月，治疗后的存活时间为12-15个月，且最长不超过五年。

环状RNA(circRNA)是一类由mRNA前体反向剪接产生的共价闭合环状的编码RNA，没有3'聚腺苷酸尾巴和5'帽子结构，通常比其同源线性mRNA更加稳定，不受RNA外切酶影响，其表达具有时间和组织特异性，因此是良好的生物标志物候选分子。CircRNA分为三类：外显子circRNA(ecircRNA)，由一个或多个外显子经过反向剪接形成；内含子circRNA(ciRNA)，由内含子形成；外显子-内含子circRNA(EIciRNA)既包括外显子也包括内含子。CircRNA在多种疾病中差异性表达，并参与生理和病理生理过程的调节。CircRNAs主要通过结合miRNA使其下游靶基因免受miRNA降解、结合RNA结合蛋白(RBP)、或者通过RNA-POL II调节转录和翻译肽和蛋白质，参与中枢神经系统相关疾病以及肿瘤等过程。CircRNA生成和功能的研究涉及到了肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、胶质瘤等肿瘤领域的方方面面。因此，circRNA可以作为治疗肿瘤的手段，进一步推动相关领域的发展。

目前研究报道circXPO1的表达与骨肉瘤、肺腺癌、前列腺癌的发生有关，尚未有其对恶性胶质瘤的相关作用的报道。经过我们的长期研究发现circXPO1的抑制剂可以作为一种活性物质，对恶性胶质瘤有一定的治疗作用。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种利用shRNA敲低的circXPO1在制备治疗胶质瘤药物或保健品中的应用，shRNA的核苷酸序列由正义链和反义链组成：

正义链的苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-GATCCGTGCGAAGTAATCTATGCCAGCCTTCCTGTCAGAGCTGGCATAGATTACTTCGCACTTTTTG-3’；

反义链的苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-AATTCAAAAAGTGCGAAGTAATCTATGCCAGCTCTGACAGGAAGGCTGGCATAGATTACTTCGCACG-3’。

所述circXPO1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为优选，所述胶质瘤为胶质瘤细胞U-87MG或胶质瘤细胞U251。

本发明的第二个目的是提供一种利用shRNA敲低的circXPO1在制备胶质母细胞瘤活性抑制剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种治疗胶质瘤药物，包括利用shRNA敲低的circXPO1。

作为优选，所述药物的剂型为医学上认可的任何一种剂型。

作为优选，还包括药学上可接受的载体。

本发明的第四个目的是提供一种用于敲除circXPO1的抑制剂shRNA，干扰circXPO1表达的情况下能够抑制神经胶质瘤的生长，为临床上治疗胶质瘤，提供了一个新的解决方法。所述抑制剂抑制circXPO1的表达，以降低所述circXPO1的表达产物的水平。

为了探究circXPO1在神经胶质瘤发生发展中的作用，本发明根据circXPO1的拼接位点设计了一对shRNA，利用转染试剂将shRNA和scramble(阴性对照)利用慢病毒包装的方法感染U87-MG和U251细胞系来敲低circXPO1的表达。感染72小时收集细胞，利用实时荧光定量PCR技术检测circXPO1的表达水平以检测shRNA的转染效率，发现设计的shRNA能显著抑制circXPO1的表达水平，并可以抑制神经胶质瘤的活性、增殖和迁移。同时circXPO1的过表达可以促进神经胶质瘤的细胞活性、增殖和迁移等，因此circXPO1对于治疗胶质细胞瘤具有重要的意义。

附图说明

图1为circXPO1的环状结构和Sanger测序；(A)circXPO1的环状结构及形成示意图，(B)sanger测序结果的峰图，(C)RT-PCR检测circXPO1环状结构及引物特异性，(D)qRT-PCR检测RNase R处理后的circXPO1，(E)qRT-PCR检测RNase R处理后的XPO1的表达水平。

图2为circXPO1在正常组织和神经胶质瘤组织及GBM细胞系中的表达水平；(A)qRT-qPCR检测circXPO1在正常脑组织(Normal brain)、低级别胶质瘤(LGG)和高级别胶质瘤(GBM)中的表达水平，(B)qRT-qPCR检测circXPO1在U87-MG细胞和U251细胞中表达水平。

图3为qRT-PCR检测胶质瘤细胞系中circXPO1的shRNA的敲低效率；(A)为circXPO1-sh处理后circXPO1表达水平的变化，(B)为circXPO1-sh处理后XPO1表达水平的变化。

图4为CCK-8检测circXPO1-sh处理后对U87-MG和U251细胞活性的影响。

图5为免疫荧光检测circXPO1-sh处理后对U87-MG和U251的细胞增殖的影响。

图6为划痕实验检测circXPO1-sh处理后对U87-MG和U251细胞划痕愈合能力的影响。

图7为qRT-PCR检测胶质瘤细胞系中circXPO1的过表达效率。

图8为过表达circXPO1后对U87-MG和U251细胞生长、增殖和迁移的影响；(A)为CCK-8检测过表达circXPO1后对U87-MG和U251的细胞活力的影响，(B)为免疫荧光检测过表达circXPO1后对U87-MG和U251的细胞增殖的影响，(C)为过表达circXPO1后对U87-MG和U251细胞划痕愈合能力的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：Sanger测序及RNase R处理证明形成的是环状RNA

一、实验方法

1、RT-PCR获得circXPO1

提取GBM细胞系(即U87-MG、U251细胞)总RNA，采用Trizol试剂(ThermoFisherScientific)，逆转录后用于RT-PCR分析。引物如(表1)所示。

RT-PCR体系：

为了证明circXPO1形成的是环状RNA而非线性的，将RT-PCR产物回收，送公司进行sanger测序，将测序结果用DNASTAR软件进行比对。结果显示，circXPO1确实是由母基因XPO1的2、3、4号外显子头尾相接环化形成(图1A、B、C)。

2、为了确认circXPO1的环状结构，通过用核酸外切酶(RNase R)处理来评估其稳定性。结果表明，circXPO1对RNase R有抵抗性(图1D)，而XPO1则被RNase R降解消化了(图1E)。综上所述，circXPO1是一种环状且稳定的转录本。

表1 circXPO1和XPO1的PCR及qPCR引物序列

实施例2：circXPO1在正常组织和神经胶质瘤组织及GBM细胞系中的表达

一、实验方法：

1、荧光定量PCR检测circXPO1在正常组织和神经胶质瘤组织及GBM细胞系中的表达

提取神经胶质瘤组织及GBM细胞系(即U87-MG、U251细胞)总RNA，采用Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific)用于荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。扩增反应由cfx96实时PCR检测系统完成(Bio-Rad公司，Hercules，CA，美国)根据操作规范使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒。对于circXPO1和XPO1引物(表1)所示，使用

qRT-PCR体系：

二、实验结果

分析circXPO1在正常脑组织、低级别胶质瘤组织样品、高级别神经胶质瘤组织样品及相关细胞系(U87-MG和U251)中的表达情况。qRT-PCR结果表明，在高级别GBM组织(图2A)以及几个GBM衍生的细胞系如U87-MG和U251中(图2B)，circXPO1表达上调。

实施例3：在U87-MG和U251细胞中使用shRNA抑制circXPO1表达

一、实验方法

1、scramble，circXPO1-sh质粒(GFP共表达)的构建：用的是最常用的干扰质粒构建方法，通过内切酶(Biolabs)，酶切shRNA序列和P GreenPuro载体(生工)，用T4连接酶(碧云天)连接构成质粒。

病毒液获得方法：(1)取2个1.5mL离心管，加入30μLDMEM，30μLFectin(ThermoFisher)。(2)另取2个1.5mL离心管，加入60μLDMEM，0.75μgpspax2包装质粒，0.25μgpmd2.G包装质粒，分别加入1μg scramble，circXPO1-sh干扰质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，静置20分钟后，分别加入在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养的293T细胞液中，24、48小时后，分别取培养液上清。

用带有scramble和circXPO1-sh的病毒液感染U87-MG和U251细胞，待在荧光显微镜下观察到细胞感染效率为90％以上后可进行后续实验。

2、采用qRT-PCR的方法检测circXPO1-sh的高低效果。

qRT-PCR体系：

提取scramble和circXPO1-sh感染后的U87-MG和U251细胞得总RNA，采用Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific)用于实时定量PCR(qRT-PCR)分析。扩增反应由cfx96实时PCR检测系统完成(Bio-Rad公司，Hercules，CA，美国)根据操作规范使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒。对于circXPO1和XPO1引物如(表1)所示，使用

二、实验结果

利用qRT-PCR技术检测circXPO1的表达水平以检测shRNA的高低效率，确认circXPO1-sh下调circXPO1的表达，P value小于0.05。(见图4A)。同时qRT-PCR检测发现shiRNA并未敲低线性XPO1的表达(见图4B)，说明shRNA是特异性敲低circXPO1的表达。

实施例4:circXPO1的抑制对GBM细胞活力的影响

一、实验方法

1、CCK-8

根据实施例3方法一中的慢病毒感染胶质瘤细胞系(U87-MG和U251)后，将含10％胎牛血清的DMEM培养基配置100μL的胶质瘤细胞按照(U87-MG和U251)按照2000个/孔传至96孔板中。分为scramble组和circXPO1-sh组，将培养板在培养箱中37℃、CO

二、实验结果

在GBM细胞系U87-MG和U251中检测了circXPO1对GBM细胞活力的影响，发现circXPO1-sh的干扰显著抑制U87-MG和U251细胞活力(图4A)。

实施例5:BrdU标记法及Ki-67染色法分析circXPO1的抑制对GBM细胞增殖的影响

一、实验方法

1、BrdU标记法及Ki-67染色法

(1)细胞样品的准备：根据实施例3方法一中的慢病毒感染胶质瘤细胞系(U87-MG和U251)

(2)加入终浓度为90g/L的BrdU(5－溴脱氧尿嘧啶核苷)，于37℃环境中孵育2小时。培养基孵育2小时后，弃培养基，PBS清洗细胞2次，每次5分钟。

(3)细胞固定：每孔加入200μl细胞固定液(4％多聚甲醛)室温孵育30分钟，弃固定液。PBS清洗3次，每次5分钟。

(4)HCl固定：向步骤2的培养孔中每孔加入足以覆盖细胞的2M的HCl水溶液，于37℃环境中孵育20分钟后，PBS清洗3次，每次5分钟。

(5)封闭：用5％的羊血清室温封闭1小时。

(6)孵育一抗、二抗：一抗(小鼠BrdU单抗和兔Ki-67单抗)孵育4℃过夜，PBS洗涤3次后，孵育二抗(goat-anti-mouse IgG1(r1),594和goat-anti-rabbitIgG,633)1小时，在二抗孵育结束前5分钟按照体积比1:10000的比例加入DAPI(4',6－二脒基－2－苯基吲哚)，PBS清洗三次。荧光显微镜下拍照。

二、实验结果

利用BrdU标记法及Ki-67染色法检测circXPO1在GBM细胞系(U87-MG和U251)中对GBM细胞增殖的影响，发现circXPO1-sh显著抑制U87-MG和U251细胞中BrdU阳性的细胞和Ki-67阳性的细胞，及显著抑制U87-MG和U251细胞的增殖(图5)。

实施例6:circXPO1干扰对GBM细胞迁移能力的影响。

一、实验方法

1、细胞迁移实验

根据实施例3方法一中的慢病毒感染胶质瘤细胞系(U87-MG和U251)后，待细胞汇合度至80％左右时，更换无血清培养基，细胞血清饥饿24小时后用小号枪头进行划痕实验，PBS清洗2遍洗去漂浮的细胞，加入无血清的培养基。

2、拍照观察

在显微镜下每隔24小时对划痕部位拍照，并对划痕宽度进行统计分析。

二、实验结果

通过伤口愈合测定来研究circXPO1抑制对GBM细胞的迁移的影响。发现circXPO1-sh显著抑制U87-MG和U251细胞的迁移(图6)。

实施例7:qRT-PCR检测circXPO1的过表达效果

一、实验方法

1、载体质粒构建

Vector，circXPO1-OE质粒(GFP共表达)的构建：用的是最常用的过表达质粒构建方法，通过内切酶(Thermo)酶切pLC5-ciR载体(吉赛生物公司)，用T4连接酶(碧云天)连接构成质粒。将circXPO1全长序列克隆进pLC5-ciR质粒空载。

2、病毒液获得方法

(1)取2个1.5mL离心管，加入30μLDMEM，30μLFectin(ThermoFisher)。(2)另取2个1.5mL离心管，加入60μL DMEM，0.75μg pspax2包装质粒，0.25μg pmd2.G包装质粒，分别加入1μg Vector，circXPO1-OE质粒，然后与步骤(1)离心管的溶液混合，静置20分钟后，分别加入在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养的293T细胞液中，24、48小时后，分别取培养液上清。用带有Vector和circXPO1-OE的病毒液感染U87-MG和U251细胞，待在荧光显微镜下观察到细胞感染效率为90％以上后可进行后续实验。

3、采用qRT-PCR的方法检测circXPO1-OE的过表达效果。

qRT-PCR体系：

提取Vector和circXPO1-OE感染后的U87-MG和U251细胞得总RNA，采用Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific)用于实时定量PCR(qRT-PCR)分析。扩增反应由cfx96实时PCR检测系统完成(Bio-Rad公司，Hercules，CA，美国)根据操作规范使用SYBR Green荧光定量PCR试剂盒。对于circXPO1和XPO1引物如(表1)所示，使用

二、实验结果

利用qRT-PCR技术检测circXPO1的表达水平以检测circXPO1的过表达效率，确认circXPO1-OE上调circXPO1的表达，P value小于0.05。(如图7)。

实施例8：过表达circXPO1对GBM细胞活性、增殖和迁移能力的影响。

一、实验方法

根据实施例4、5、6的方法检测circXPO1对GBM细胞活性、增殖和迁移能力的影响。

二、实验结果

利用CCK-8、Brdu标记法、Ki-67染色法和划痕实验检测过表达circXPO1对GBM细胞活性、增殖和迁移能力的影响，结果表明过表达circXPO1可以显著提高GBM细胞活性如(图8A)、促进细胞增殖如(图8B)和迁移如(图8C)。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种敲低circXPO1的抑制剂及其在制备治疗胶质瘤药物中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 307

<212> RNA

<213> 人工序列(circXPO1)

<400> 2

uaaucuaugc cagcaauuau gacaauguua gcagaccaug cagcucguca gcugcuugau 60

uucagccaaa aacuggauau caacuuauua gauaaugugg ugaauugcuu auaccaugga 120

gaaggagccc agcaaagaau ggcucaagaa guacugacac auuuaaagga gcauccugau 180

gcuuggacaa gagucgacac aauuuuggaa uuuucucaga auaugaauac gaaauacuau 240

ggacuacaaa uuuuggaaaa ugugauaaaa acaaggugga agauucuucc aaggaaccag 300

ugcgaag 307

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(circXPO1-shRNA正义链)

<400> 3

gatccgtgcg aagtaatcta tgccagcctt cctgtcagag ctggcataga ttacttcgca 60

ctttttg 67

<210> 3

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(circXPO1-shRNA反义链)

<400> 3

aattcaaaaa gtgcgaagta atctatgcca gctctgacag gaaggctggc atagattact 60

tcgcacg 67

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物1)

<400> 4

cagtgcgaag taatctatgc ca 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(引物2)

<400> 5

gagccattct ttgctgggct 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(引物3)

<400> 6

agtcgaatgg ctaaaccaga gg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(引物4)

<400> 7

ggagcctatt gcccaacaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(引物5)

<400> 8

ccaaggagta agacccctgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(引物6)

<400> 9

tggttgagca cagggtactt 20