一种小分子化合物在桉树无性繁殖和遗传转化中的应用

技术领域

本发明涉及植物无性繁殖技术领域，具体涉及一种小分子化合物在桉树无性繁殖和遗传转化中的应用。

背景技术

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的发明内容，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。

非哌西特盐(FIP，Fipexide)是对氯苯乙酸衍生物，是一种医学上使用的促智药物。FIP降低了纹状体腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)的活性，并且FIP通过多巴胺能神经传递对认知表现出积极的作用，另外FIP还具有用于老年痴呆研究的潜力。

胚性组织诱导率低、严重依赖基因型和外植体类型是制约林木体胚发生，以及高效无性系化的关键问题，其中国家林木良种无性系材料高效再生问题是制约林木良种快速推广繁育的主要技术障碍，无性组培再生困难的关键问题是树木存在明显的成熟效应以及次生代谢物较多，繁殖材料容易老化而降低组培能力，亟需进行突破。传统的植物生长激素，如生长素类物质IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)，以及细胞分裂素6-苄氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、玉米素(ZT)等，只能对少部分易于转化的杨树起到无性繁殖的作用，而对抗性强、环境适应能力强、次生代谢物多的杨树良种和桉树效果不佳。本发明首次提出将医学上所使用的促进认知、缓解神经细胞老化的药物用在促进植物高效组织培养上，在木本植物这一研究领域尚属空白，在草本植物也鲜有报道。

桉树在我国18个省份的600多个县(区)都有种植，其中主要在我国南方地区广西、广东、福建等地广泛种植。桉树以占我国人工林面积6.3％的林地，每年贡献了我国超三分之一的木材产量，对维护我国“木材安全”，建设木材战略储备基地起到了关键支撑作用。仅我国的广西省,种植面积达到3000多万亩,木材产量2500多万立方米,经济效益规模已经达到4700多亿。同时桉树在减排吸碳环保方面,每年吸收二氧化碳超过8.5亿吨,也为国家的环保事业做出巨大贡献。

目前桉树的无性繁殖有两种，一种是扦插育苗，主要是通过从采穗园苗圃，采集剪过叶片的萌芽条，浸泡生根溶剂后，在育苗基质上进行扦插生根，但是这种效率较低，而且受到生根存活率的限制。二是通过外殖体消毒在组培条件下直接诱导隐芽生长，再进行生根继代，这种不经过愈伤组织诱导，以及诱导不定芽的方法，使得繁殖效率较低，且外殖体消毒繁殖过程中容易污染，成本较高。

然而桉树产业发展存在的关键问题是育种手段停留在传统的杂交育种，其遗传转化困难，包括基因编辑等工作一直滞后于其它物种，原因是桉树的无性繁殖困难，愈伤和不定芽的诱导效率低，严重限制了桉树的无性繁殖和高效育种工作。

发明内容

本发明实施例的目的是提供一种小分子化合物在桉树无性繁殖和遗传转化中的应用；利用该小分子化合物高效诱导愈伤组织形成以及不定芽的发生，来提高桉树的无性繁殖效率，继而提高林业大规模繁殖的效益。

本发明实施例的目的是通过如下技术方案实现的：

一种小分子化合物在桉树无性繁殖和遗传转化中的应用，所述的小分子化合物为非哌西特盐，分子式为：

进一步的，所述的应用为将非哌西特盐加在组培培养基中，并按照组培流程进行扩繁。

进一步的，包括如下步骤：

(1)将非哌西特盐配制成浓度为90mM的水溶液，并进行过滤灭菌得到非哌西特盐溶液；

(2)以固体MS为基本培养基，在培养基中加入稀释后的非哌西特盐溶液，使得工作液浓度为5μM、15μM、30μM、45μM、90μM、180μM；

(3)将固体茎段放置在培养基上，待愈伤组织长出。

进一步的，所使用的工作液浓度为45μM。

进一步的，将固体茎段放置在培养基上处理的时间为10天。

进一步的，在愈伤组织长出后还包括步骤：利用非哌西特盐溶液进行不定芽的诱导：

将长出的愈伤组织，接种在MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+0.3mg/L噻苯隆(TDZ)，45μMFIP的培养基上面，进行不定芽的诱导，其中每隔7d换一次培养基，待不定芽长出。

进一步的，在愈伤组织长出后还包括步骤：将长有愈伤组织的叶片和茎段经抗性芽诱导、伸长培养和生根培养后长成完整植株。

进一步的，所述的抗性芽诱导包括如下步骤：将长有愈伤组织的叶片和茎段，转移到含有筛选抗生素和抑菌剂的培养基上，培养30d，期间每个10d换一次培养基，直到部分茎段有抗性芽产生。

进一步的，所述的伸长培养和生根培养包括如下步骤：将长出抗性芽的叶片和茎段，放置在继代培养基上，光下培养20d，将继代培养，茎直径约为1mm的无菌苗，接种到生根培养基上，培养25d，待长成完整植株。

本发明实施例具有如下有益效果：

本发明首次提出将医学上所使用的促进认知、缓解神经细胞老化的药物用在促进植物高效组织培养上，通过施加外源的小分子化合物，促进桉树愈伤组织的形成，对于桉树的高效繁殖和再生，以及通过基因工程培育桉树新种质具有重要的意义。

本发明的应用方法处理10天后，显著诱导了愈伤组织的产生，比传统生长素和细胞分裂素的组合诱导愈伤时间缩短了2/3。FIP和细胞分裂素组合使用，可以显著加速诱导不定芽的分化，并且分化的芽可以长成完整的植株，芽的分化比传统的方法缩短1/3。本发明通过诱导再生困难的树种快速产生愈伤组织，为通过无性繁殖苗木，提供了思路，在林木无性系化和产业化方面具有极大的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中利用FIP进行愈伤组织的诱导效果图；

图2为本发明实施例中FIP诱导不定芽的产生效果图；

图3为本发明实施例中利用FIP进行尾巨桉的遗传转化效果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

首先配制FIP的水溶液，配制成浓度为90mM的母液，过滤灭菌后，稀释成5个梯度，加入到MS基本培养基中，进行愈伤组织的诱导。然后再用FIP和TDZ的组合进行不定芽的诱导。建立高效愈伤组织和不定芽诱导体系后，利用该体系进行尾巨桉的遗传转化。

实施例一：

将从阿拉丁网站购买的非哌西特盐酸盐(Fipexide hydrochloride)，CAS号34161-23-4，5g装，加入142.9mL蒸馏水，稀释成浓度为90mM的母液，然后用过滤的方式进行灭菌，FIP母液储存在-20℃备用。

愈伤诱导培养基：调整pH＝5.8，6g/L琼脂，121℃高温灭菌15min，待冷却至温度为60℃时，在每1L固体MS培养中分别加入56μL、167μL、333μL、500μL、1000μL、2000μL的FIP母液，使得FIP的最终的工作液浓度分别为5μM、15μM、30μM、45μM、90μM、180μM。

不定芽诱导培养基：在愈伤培养基的基础上加入最终工作浓度为0.3mg/L的噻苯隆(TDZ)。

实施例二：

将温室生长的三倍体尾巨桉置于组培室中进行组织培养，光照强度为80μmol m

取组培苗的叶片和茎段，叶片剪成直径为0.5cm的小方块，茎段切成长度为0.5-1cm，然后将叶片和茎段分别放置在以下培养基上：

MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖

MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+5μM FIP

MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+15μM FIP

MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+30μM FIP

MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+45μM FIP

MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+90μM FIP

MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+180μM FIP

放置在黑暗的环境下培养10d，取出统计愈伤组织的诱导情况。

图1为空白对照组与MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+30g/L蔗糖+45μM FIP组的效果对比图。

实施例三：

利用FIP进行桉树不定芽的诱导：

将长出的愈伤组织，接种在MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+0.3mg/L噻苯隆(TDZ)45μMFIP，对照组为MS+6g/L琼脂+0.3mg/L噻苯隆(TDZ)+0.2mg/L萘乙酸(NAA)+45μM FIP的培养基上面，进行不定芽的诱导，其中每隔7d换一次培养基，待不定芽长出来后，分别进行统计分析。图2为MS+pH＝5.8+6g/L琼脂+0.3mg/L噻苯隆(TDZ)45μM FIP与对照组的效果对比图。

实施例四：

利用FIP进行愈伤诱导及芽分化培养基进行桉树的遗传转化：

(1)配制培养基:愈伤诱导培养基MS+45μM FIP+蔗糖30g/L+6g/L琼脂。不定芽分化诱导培养基：MS+45μM FIP+0.3mg/L TDZ+30g/L蔗糖+10mg/L潮霉素(Hyg)+6g/L琼脂。生根筛选培养：1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IBA+Car 200mg/L+蔗糖19g/L+甘露糖11g/L。

(2)菌液活化：从-80℃超低温冰箱中取出pSuper1300-GFP农杆菌菌株，置于冰上融化。用接种针取菌液在含有抗生素(100mg/L卡那霉素，50mg/L利福平)的固体LB培养基上划线。然后将培养皿倒置在28℃培养箱中暗培养3d，待长出单菌落后，挑取单克隆放置在含有抗生素(100mg/L卡那霉素，50mg/L利福平)的10mL液体LB培养基上，28℃培养，200rpm振荡培养至OD

(3)侵染液准备：在超净台工作中完成一下步骤，首先将培养好的菌液室温6000rpm，离心10min，去掉上清液，用MS悬浮液重悬，其中添加150mg/L乙酰丁香酮(AS)和150mg/L的2-吗啉乙磺酸(MES)，重悬至至OD

(4)农杆菌侵染：将之前用FIP进行无性繁殖得到的尾巨桉组培苗，叶片剪成0.5cm的小方块，茎剪成0.5-1.0cm的小茎段，放置在愈伤诱导上(MS+45μM FIP+蔗糖30g/L+6g/L琼脂)，置于组培室黑暗环境下预培养1d。然后再将经过预培养的茎段，置于重悬完成的农杆菌菌液中，缓慢摇晃25min。

(5)愈伤组织的诱导：将侵染过的茎段和叶片取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，将其接种在含有抑菌剂的愈伤诱导培养基上(MS+45μM FIP+200mg/L羧苄+蔗糖30g/L+6g/L琼脂)，防止在黑暗环境下，培养10d。

(6)抗性芽的诱导：将长有愈伤组织的叶片和茎段，转移到含有筛选抗生素和抑菌剂的培养基上(MS+45μM FIP+0.3mg/L TDZ+30g/L蔗糖+200mg/L羧苄+10mg/L潮霉素+6g/L琼脂)，培养30d，期间每个10d换一次培养基，直到部分茎段有抗性芽产生。

(7)植株再生，伸长培养和生根培养；将长出抗性芽的叶片和茎段，放置在继代培养基上(MS+5μM FIP+0.2mg/L激动素+0.2mg/L 6-氨基腺嘌呤+0.1mg/L萘乙酸+200mg/L羧苄+10mg/L潮霉素+蔗糖30g/L)，光下培养20d，将继代培养，茎直径约为1mm的无菌苗，接种到生根培养基上(1/2MS+NAA0.5 mg/L+IBA0.5mg/L+200mg/L羧苄+10mg/L潮霉素+30g/L蔗糖)，培养25d，待长成完整植株。图3为本发明实施例中利用FIP进行尾巨桉的遗传转化效果图。

这个化合物之前并未用到树木无性繁殖和遗传上，是因为该化合物是医学上使用的药物，用来治疗人类的相关疾病，改善认知能力。由于人和植物存在的巨大差异，是否能将其用在植物上并产生效果，并未做尝试。

该化合物的价格并不贵，5g价格￥298，使得其在植物上利用成为可能。

本发明的应用方法处理10天后，显著诱导了愈伤组织的产生，比传统生长素和细胞分裂素的组合诱导愈伤时间缩短了2/3。FIP和细胞分裂素组合使用，可以显著加速诱导不定芽的分化，并且分化的芽可以长成完整的植株，芽的分化比传统的方法缩短1/3。本发明通过诱导再生困难的树种快速产生愈伤组织，为通过无性繁殖苗木，提供了思路，在林木无性系化和产业化方面具有极大的应用价值。

本发明中通过施加外源的小分子化合物，促进桉树愈伤组织的形成，对于桉树的高效繁殖和再生，以及通过基因工程培育桉树新种质具有重要的意义。本发明利用该小分子化合物高效诱导愈伤组织形成以及不定芽的发生，来提高桉树的无性繁殖效率，继而提高林业大规模繁殖的效益。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。