胭脂米发酵液、其制备方法及其用于制备一护肤的组合物的用途

技术领域

本揭露关于胭脂米的应用，特别是关于一种胭脂米发酵液、其制备方法及其用于制备一护肤的组合物的用途。

背景技术

自有机及天然的饮食概念兴起后，生技公司及食品业者积极投入关于天然植物的相关产品之研发。为使植物相关产品对身体健康帮助有科学验证的基础，植物的活性成分分析及功效评估成为产品开发的重点项目。

来自中国台湾花莲的特有种的胭脂米，其已有300多年的栽种历史，且其富含花青素等效性成分的特性因而拥有坐月子的米的美名。因此，胭脂米亦成为生技公司及食品业者积极研究开发的对象之一。

发明内容

有鉴于此，如何自胭脂米提炼出大量的效性成分及胭脂米有何效用为各方所亟欲解决的课题。

在一些实施例中，一种胭脂米发酵液的制备方法，其包含：将一胭脂米萃取液经一酵母菌、一乳酸杆菌及一醋酸杆菌发酵而得胭脂米发酵液。

在一些实施例中，一种胭脂米发酵液，其是经由前述的胭脂米发酵液的制备方法所获得。

在一些实施例中，一种胭脂米发酵液的用途，其是用于制备一护肤的组合物，并且此胭脂米发酵液是经由前述的胭脂米发酵液的制备方法所获得。

综上所述，根据任一实施例的胭脂米发酵液的制备方法，其适用制备具有护肤作用的胭脂米发酵液。在一些实施例中，经发酵所得的胭脂米发酵液相较于发酵前可大幅提升其所具有总黄酮含量。

附图说明

图1是一实施例的胭脂米发酵液的制备方法的流程图。

图2是总黄酮含量的柱状图。

图3是相对细胞增生率的柱状图。

图4A是伤口外观的照片图。

图4B是基于图4A的结果量化后所得到的相对伤口愈合率的柱状图。

图5是相对粒线体活性的柱状图。

图6A是人体实验中，其中一位受试者的肌肤纹理检测的结果照片图。

图6B是10位受试者在服用前以及连续服用胭脂米发酵液4周后，进行肌肤纹理检测所得到的相对肌肤纹理的柱状图。

图7A是人体实验中，其中一位受试者的肌肤皱纹检测结果的照片图以及肉眼观察结果的照片图。

图7B是10位受试者在服用前以及连续服用胭脂米发酵液4周后，进行肌肤皱纹检测所得到的相对肌肤皱纹的柱状图。

图8A是人体实验中，其中一位受试者的肌肤毛孔检测的结果照片图。

图8B是10位受试者在服用前以及连续服用胭脂米发酵液4周后，进行肌肤毛孔检测所得到的相对肌肤毛孔的柱状图。

图9A是人体实验中，其中一位受试者的肌肤泛红检测的结果照片图。

图9B是10位受试者在服用前以及连续服用胭脂米发酵液4周后，进行肌肤泛红检测所得到的相对肌肤泛红的柱状图。

其中，附图标记：

S21～S24:步骤

具体实施方式

本文中所使用词汇「胭脂米(red rice)」，又可称为胭脂稻、红糙米、红稻米、红米液或红米粉，其学名为水稻(Oryza sativa)。

本文中所述及的「糖度」所指为白利糖度(Degrees Brix，符号°Bx)。白利糖度是测量糖度的单位，其是代表在20℃情况下，每100克水溶液中溶解的蔗糖克数。

在一实施例中，一种胭脂米发酵液的制备方法，其包含：将一胭脂米萃取液经一酵母菌、一乳酸杆菌及一醋酸杆菌(Acetobacter aceti)发酵而得胭脂米发酵液。

在一些实施例中，胭脂米萃取液可利用含有酵素液的水对胭脂米进行萃取程序而获得。

在一些实施例中，萃取程序可以是在60℃至100℃的温度下进行0.5小时至5小时。在一示范例中，萃取程序可分为二阶段(以下称第一阶段与第二阶段)。第一阶段是在80℃至100℃的温度下进行0.5小时至1小时的萃取。第二阶段是在60℃至65℃的温度下进行1.5小时的萃取。在另一示范例中，萃取程序可为单一阶段，如，在80℃至100℃的温度下进行0.5小时至1小时的萃取。在又一示范例中，萃取程序可分为三阶段(以下称第一阶段、第二阶段与第三阶段)。第一阶段是在80℃至100℃的温度下进行0.5小时至1小时的萃取。第二阶段是在60℃至65℃的温度下进行1.5小时的萃取。第三阶段是在95℃的温度下进行2.5小时的萃取。在一些实施例中，进行萃取的胭脂米可为完整的胭脂米米粒，或为已打碎的胭脂米颗粒，或为已磨粉的胭脂米粉末。

在一些实施例中，胭脂米萃取液的制备方法如下。首先，将完整胭脂米打碎以形成胭脂米颗粒，并将胭脂米颗粒与水以重量比为1:6的比例混合成原料混合液。接着，加入1％(w/v)淀粉酵素液(Amylase)至原料混合液中(即，胭脂米颗粒浸泡在含有1％(w/v)淀粉酵素液的水中)，然后进行一灭菌程序(以下称第一灭菌程序)，以得到第一次萃取液。在一些实施例中，第一灭菌程序可是在80℃至100℃的温度下进行0.5小时至1小时。在一些实施例中，胭脂米可为市售且产自中国台湾花莲的胭脂米。在一些实施例中，胭脂米颗粒的粒径可为12公厘(mm)以下。

在一些实施例中，第一次萃取液还可加入1％(w/v)糖化酵素液进一步反应以得到第二次萃取液。举例来说，将经灭菌程序所得的第一次萃取液降温至60℃至65℃，并加入1％(w/v)糖化酵素液，然后于60℃至65℃下反应(或称一般溶剂萃取)90分钟，以得到第二次萃取液。

在一些实施例中，第二次萃取液可再进行一次灭菌程序(以下称第二灭菌程序)，以得到灭菌后萃取液。在一些实施例中，第二灭菌程序可是在95℃的温度下进行2.5小时。

具体而言，当萃取程序为三阶段时，第一灭菌程序即为前述第一阶段，一般溶剂萃取即为前述第二阶段，而第二灭菌程序即为前述第三阶段。

在一些实施例中，淀粉酵素液可选自于α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶(葡萄糖淀粉酶)及异淀粉酶或其组合。在一些实施例中，淀粉酵素可以是葡萄糖淀粉酶(glucan 1,4-alpha-glucosidase)。

在一些实施例中，胭脂米萃取液可为前述的第一萃取液、前述的第二萃取液、或前述的灭菌后萃取液。

在一些实施例中，胭脂米萃取液冷却至室温后可不滤除其内部的固形物(如，作为萃取原料的胭脂米)而直接分阶段加入酵母菌、乳酸杆菌及醋酸杆菌进行5日至15.5日的发酵，以得到胭脂米发酵液。

在一些实施例中，前述酵母菌的添加量为胭脂米萃取液的0.5％(w/v)。前述乳酸杆菌的添加量为胭脂米萃取液的0.1％(w/v)。前述醋酸杆菌的添加量为胭脂米萃取液的5％(w/v)。

在一些实施例中，酵母菌、乳酸杆菌及醋酸杆菌的发酵天数比可为1至2.5：1至3：3至10，较佳为1：1：5。在一些实施例中，发酵温度可为28℃至37℃，较佳为30℃。

在一些实施例中，酵母菌可以是啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)。例如，啤酒酵母菌是以保藏编号BCRC 20271寄存于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(BCRC)(其亦以国际保藏编号ATCC26602寄存于美国典型培养物保存中心)，或其他市售啤酒酵母菌，或利用本技术领域中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中自行分离纯化出的啤酒酵母菌。

在一些实施例中，乳酸杆菌可以是胚芽乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum)。例如，胚芽乳酸杆菌是以保藏编号BCRC 910760寄存于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(其亦以国际保藏编号DSM32451寄存于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ))，或其他市售胚芽乳酸杆菌，或利用本技术领域中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中自行分离纯化出的胚芽乳酸杆菌。

在一些实施例中，醋酸杆菌是以保藏编号BCRC 11688寄存于中国台湾食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(其亦以国际保藏编号ATCC15973寄存于美国典型培养物保存中心)，或其他市售胚醋酸杆菌，或利用本技术领域中所惯用的微生物分离方法而从天然来源中自行分离纯化出的醋酸杆菌。

举例来说，参照图1，胭脂米萃取液冷却至室温后，先添加0.5％(w/v)的酵母菌至胭脂米萃取液，并将胭脂米萃取液与酵母菌的混合液在28℃至37℃下进行1日至2.5日的发酵，以形成第一初发酵液(步骤S21)。

在第一初发酵液形成后，再添加0.1％(w/v)的乳酸杆菌至第一初发酵液内，并将第一初发酵液与乳酸杆菌的混合液在28℃至37℃下进行1日至3日的发酵，以形成第二初发酵液(步骤S22)。

在第二初发酵液形成后，再添加5％(w/v)的醋酸杆菌至第二初发酵液，并将第二初发酵液与醋酸杆菌的混合液在28℃至37℃下进行3日至10日的发酵，以形成发酵原液(步骤S23)。

在一些实施例中，在发酵原液形成后，可再进行浓缩或/及过滤等处理。

在一些实施例中，在发酵原液形成后，将发酵原液在55℃至65℃下进行减压浓缩并以合适目数的网孔的滤网过滤，以得到发酵浓缩液(步骤S24)。在一些实施例中，合适目数可为200目数至400目数。

在一些实施例中，胭脂米发酵液即可为前述的第一初发酵液、前述的第二初发酵液、前述的发酵原液、或前述的发酵浓缩液。

在一些实施例中，胭脂米发酵液的pH值为小于3.5且大于0(误差值±1.0)，且胭脂米发酵液的糖度为2至3.5°Bx(误差值±2)。

在一些实施例中，胭脂米发酵液具有护肤之作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液可提升个体的皮肤纤维母细胞的粒线体活性、推迟肌肤老化、抗皱及改善泛红肌的作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液可改善个体的肌肤粗糙度、紧致肌肤及改善皮肤毛孔粗大的作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液具有促进个体的皮肤纤维母细胞再生率、促进伤口愈合及减少伤口面积的作用。其中，个体包含动物，较佳为人类。

在一些实施例中，胭脂米发酵液用于提升细胞的粒线体活性。学界普遍认为粒线体活性愈高，显示细胞的生理年龄愈低。粒线体活性高亦可以辅助细胞达到调节电解质(如钠、钾、钙)平衡的功能。

在一些实施例中，胭脂米发酵液能用于制备用以护肤的组合物。其中，护肤包括提升皮肤纤维母细胞的粒线体活性、推迟皮肤老化、抗皱、改善泛红肌、改善肌肤粗糙度、紧致肌肤、改善皮肤毛孔粗大、促进皮肤纤维母细胞再生率、促进伤口愈合、减少伤口面积或其组合。

在一些实施例中，前述之任一组合物可为食用组合物。换言之，食用组合物包含特定含量的胭脂米发酵液。在一些实施例中，前述之食用组合物可为食品产品或食品添加物(food additive)。在一些实施例中，食品产品可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)或膳食补充品(dietary supplements)。

在一些实施例中，前述之食用组合物可以口服方式施予个体。其中，食用组合物的型态可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体。

在一些实施例中，前述之任一组合物可为化妆品或保养品。换言之，化妆品或保养品包含特定含量的胭脂米发酵液。

在一些实施例中，前述之化妆品或保养品可为下列任一种型态：化妆水、凝胶、冻膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉饼、蜜粉、卸妆油、卸妆乳、洗面奶、沐浴乳、洗发精、护发乳、防晒乳、护手霜、指甲油、香水、精华液及面膜。

在一些实施例中，前述之化妆品或保养品可视需要更包含外用品可接受成分。在一些实施例中，外用品可接受成分可例如为乳化剂、渗透促进剂、软化剂、溶剂、赋型剂、抗氧化剂、或其组合。

在一些实施例中，前述之化妆品或保养品可以外用方式施予个体。其中，化妆品或保养品的型态可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体。

在一些实施例中，个体可为人。

例1：胭脂米发酵液的制备

(1-1)胭脂米萃取液的制备

将胭脂米打碎成粒径小于12公厘的胭脂米颗粒，并将胭脂米颗粒与水依据重量比为1：6混合以得到原料混合液。

然后，加入1％(w/v)淀粉酵素液至原料混合液中，以得到含有淀粉酵素液的原料混合液。其中，淀粉酵素液为葡萄糖淀粉酶。

接着，将含有淀粉酵素液的原料混合液在95℃下灭菌1小时，以得到含有固形物的初萃液。

再将含有固形物的初萃液降温至60℃，然后加入1％(w/v)糖化酵素液后于60℃反应90分钟，以制得胭脂米萃取液。

(1-2)胭脂米发酵液的制备

首先，添加0.5％(w/v)啤酒酵母至胭脂米萃取液，并将胭脂米萃取液与啤酒酵母菌的混合液在30℃下发酵1天以得到第一初发酵液。并且，获得的第一初发酵液的pH值小于4，且其糖度约为9°Bx。其中，啤酒酵母菌购自BCRC(保藏编号BCRC 20271)。于此，利用啤酒酵母菌使胭脂米萃取液进行发酵而产生酒精，以利于提取出胭脂米中的效性成分。

添加0.1％(w/v)胚芽乳酸杆菌于第一初发酵液，并将第一初发酵液与胚芽乳酸杆菌在30℃下发酵1天以得到第二初发酵液。其中，胚芽乳酸杆菌购自BCRC(保藏编号BCRC910760)。并且，获得的第二初发酵液的pH值小于3.5，且其糖度约为6°Bx。于此，利用乳酸杆菌进一步消耗第一初发酵液内的葡萄糖以降低溶液的糖度并产生乳酸，因而降低第一初发酵液的pH值，以利于进一步提取胭脂米内其他不同的效性成分。

添加5％(w/v)醋酸杆菌于第二初发酵液，并将第二初发酵液与醋酸杆菌在30℃下发酵5天以得到发酵原液。其中，醋酸杆菌购自BCRC(保藏编号BCRC11688)。并且，获得的发酵原液的pH值小于3.5，且其糖度约为3.5°Bx。于此，利用醋酸杆菌消耗第二初发酵液内的酒精，以再次降低其葡萄糖的含量。

将发酵原液在60℃下进行减压浓缩，并将减压浓缩后的发酵原液以孔径200目数的滤网进行过滤，以制得发酵浓缩液。并且，获得的发酵浓缩液的pH值小于3.5，且其糖度约为2°Bx。

最后，添加含30％(w/v)异麦芽寡糖的寡糖溶液至发酵浓缩液中使发酵浓缩液的糖度达到24°Bx，即得到后续实验所使用的胭脂米发酵液。

例2：胭脂米发酵液的总黄酮含量

(2-1)实验材料

(a)10％(v/v)硝酸铝(Aluminum nitrate,Alfa Aesar 12360)(水溶液)

(b)5％(v/v)亚硝酸钠(sodium nitrite,Sigma 31443)(水溶液)

(c)4％(v/v)氢氧化钠(sodium hydroxide,NaOH,Macron 7708-10)(水溶液)

(d)200μg/mL芸香素标准液(甲醇溶液)

(2-2)制作标准曲线的实验流程

取0μL、200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL及1200μL的上述芸香素标准液，并分别与1200μL、1000μL、800μL、600μL、400μL、200μL及0μL的水均匀混合，以分别形成7种不同浓度的芸香素溶液。

取200μL各浓度之芸香素溶液至各自的试管中，并且个别加入200μL的5％(v/v)亚硝酸钠，混合均匀后静置6分钟。

然后再个别加入200μL的10％(v/v)硝酸铝，混合均匀后静置6分钟。

再个别加入2mL的4％(v/v)氢氧化钠混合均匀，然后再加入1.4mL H

接着，从各试管中取200μL的反应液于96孔反应盘中，然后使用分光亮度计在O.D.500nm下测定其吸光值，并绘制标准曲线。

(2-3)检测样品的实验流程

将例1所获得的胭脂米萃取液作为正控制组(亦称对照组)的样品，以及将例1所获得的胭脂米发酵液作为实验组的样品。

将各样品经适当的稀释后，分别取200μL的稀释后样品加入至试管中。于此，每个样品至少三重复。

各试管加入200μL的5％(v/v)亚硝酸钠并混合均匀后第一次静置6分钟。

第一次静置后，各试管再加入200μL的10％(v/v)硝酸铝，混合均匀后第二次静置6分钟。

第二次静置后，各试管再加入2mL的4％(v/v)氢氧化钠混合均匀后，再加入1.4mL的水混合均匀，以形成反应液(于各试管中)。

从各试管中取200μL上述反应液于96孔反应盘中，并使用分光亮度计在O.D.500nm下测定其吸光值。

利用(2-2)所得的标准曲线与样品测定出的吸光值以内差法算出浓度后再回乘稀释倍数，即取得各样品的总黄酮含量的原始浓度。

(2-4)实验结果

请参阅图2。正控制组(亦即胭脂米萃取液)所测得的总黄酮含量为155μg/mL，实验组(亦即胭脂米发酵液)所测得的总黄酮含量为205μg/mL。换言之，相比于正控制组，经发酵处理的实验组，总黄酮含量有显著的提升(提升1.3倍)。

由本实验的结果显示，经发酵而得的胭脂米发酵液相较于发酵前会大量释出总黄酮。而黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化的能力。换言之，实验显示，相较于胭脂米萃取物，胭脂米发酵液的总黄酮含量大幅提升，因此胭脂米发酵液具有清除自由基、抗氧化及抗老化的作用。

例3：胭脂米发酵液促进皮肤细胞增生的能力

(3-1)材料与仪器

(a)细胞株：人类皮肤纤维母细胞(CCD-996SK，类型：human skin fibroblast)(BCRC：60153)。

(b)细胞培养基：含有10％(v/v)胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(Gibco；型号：10437-028)、1％(v/v)青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin)(Gibco；型号：15140122)与1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)(Gibco；型号：11360-070)的最低限度基本培养基(Minimum essential medium,MEM)(Gibco；型号：11095080)。

(c)细胞增殖的酵素结合免疫吸附法(ELISA,enzyme-linked immunosorbentassay)试剂套组(购自Roche；型号：11647229001)。

(d)测试样品：例1所获得的胭脂米萃取液以及例1所获得的胭脂米发酵液。

(3-2)实验流程

首先，将人类纤维母细胞以3x10

接着，每孔对应其组别加入100μL的实验培养基(如下表一所示)，以及每孔加入10μL的100μM溴化脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine,BrdU)，然后于37℃下培养24小时，并利用BrdU镶嵌入DNA的含量而得以侦测细胞增生情形。

表一

在不扰动贴附细胞的情况下去除每孔中的实验培养基，并于每孔加入200μL固定液(FixDenat)，然后于室温下作用30分钟。

接着，去除每孔中的固定液，并以磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline,PBS(1X))润洗一次。

润洗后，每孔加入100μL的Anti-BrdU-POD(Anti-BrdU POD stock solution：Antibody dilution solution＝1:100)，于室温下作用90分钟。于此，使标记过氧化酶(peroxidase)的Anti-BrdU来辨识BrdU。

作用后，移除残余的标记过氧化酶的Anti-BrdU并以200-300μL的清洗溶液润洗3次。

润洗后，于每孔加入100μL的基质溶液(Tetramethylbenzidine,TMB)，并于室温下静置约5至30分钟，以使反应呈色。

最后，加入25μL的1M的硫酸，并将培养盘以300rpm摇晃作用约1分钟，以终止反应。

终止反应后，以酵素免疫分析仪(ELISA reader)(BioTek公司，美国)测量在O.D.450nm下样品吸光值。

前述实验流程参考细胞增殖ELISA试剂套组中之使用说明书。

于此，实验结果是以平均值±标准偏差(SD)表示，并且各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)进行统计分析。在图3中，***代表与空白组比较具有极显著差异(p<0.001)。

(3-3)实验结果

请参阅图3。空白组为以未添加任何的测试样品的培养基进行培养的细胞，也就是指空白组中的人类纤维母细胞在正常的生理代谢情况下。于此，设定空白组的细胞增生率为100％。正控制组为以添加含有胭脂米萃取液的培养基进行培养的细胞。相对于空白组，正控制组所观察到的皮肤细胞增生率为227.8％。实验组为以添加含有胭脂米发酵液的培养基进行培养的细胞。相对于空白组，实验组所观察到的皮肤细胞增生率为322.2％。

由此可知，相比于正控制组，实验组所观察到的相对皮肤细胞增生率有显著的提升(提升1.4倍)。因此，经发酵后而获得的胭脂米发酵液，相较于发酵前，胭脂米发酵液在促进肌肤细胞增生的作用大幅提升，胭脂米发酵液具有加速皮肤组织再生以强化皮肤的屏障的能力。

例4：伤口愈合实验(Wound healing assay)

(4-1)材料与仪器

(a)细胞株：人类皮肤纤维母细胞(CCD-996SK，类型：human skin fibroblast)(BCRC：60153)。

(b)细胞培养基：添加10％(v/v)胎牛血清(Gibco；Cat.10437-028)之Eagle最低限度基本培养基(minimum essential medium(Eagle)；MEM(Eagle))(Gibco，产品编号11095080)。其中，Eagle最低限度基本培养基是由Eagle平衡盐溶液(Eagle’s balanceslat solution，Eagle’s BSS)额外添加成分使其含有1mM丙酮酸钠(sodium pyruvate)、1.5g/L碳酸氢钠(sodium bicarbonate)及0.1mM非必需胺基酸(non-essential aminoacid solution)所配制而成。

实验流程

(a)首先，将薄膜细胞培养皿(又称插入式细胞培养盘或插入式细胞培养容器)(Culture-Insert well)(

(b)将薄膜细胞培养皿从24孔盘的各孔中移除后，在各孔中能观察到细胞单层(cell monolayer)上有一道大小大致相同的细胞间隙。于此，以形成的细胞间隙来模拟伤口。

(c)移除各孔中的细胞培养基，并以PBS(1X)(Gibco)润洗一次。

(d)将润洗后的人类皮肤纤维母细胞分为三组(如表二所示)(每组三重复)，并添加实验培养基(如表二所示)，然后先利用显微镜(ZEISS)及摄像机取得细胞影像以观察及记录人类皮肤纤维母细胞的迁移距离(即0小时的间隙面积(T0))，再于37℃下额外培养6个小时。并且，以0小时的间隙面积(T0)做为初始的伤口面积(即做为基础水平)。

(e)于培养6个小时后，同样地利用显微镜及摄像机取得细胞影像，以观察及记录人类皮肤纤维母细胞的迁移距离(即6小时的间隙面积(T6))。于此，以6小时的间隙面积(T6)作为6小时修复后的伤口面积。

(f)于此，利用Image J软件测量细胞影像中细胞间隙的面积(以下称伤口面积)。并以下列公式1将量测到的伤口面积换算成伤口愈合率(％)，以表示人类皮肤纤维母细胞迁移至细胞间隙的距离。

于此，实验数据是以平均值±标准偏差表示，并且各组之间的差异是以学生t检验进行统计分析。

表二

其中，伤口愈合率(％)的计算公式为：

其中，T0时间点的伤口面积为0小时的间隙面积。T6时间点的伤口面积为培养6小时后的间隙面积。以T0时间点的间隙面积做为初始的伤口面积大小，在经过培养一段时间后，伤口面积渐渐缩小。伤口愈合率(％)的量化方式为，T0时间点的伤口面积减去培养一段时间后的伤口面积(即T6时间点的伤口面积)的面积差，此面积差除以T0时间点的伤口面积并以百分率方式表示。其中，此面积差即为人类皮肤纤维母细胞迁移至间隙的区域(伤口愈合的面积)。

(4-2)实验结果

参阅图4A。图4A为在伤口愈合实验中的伤口外观照片图，其呈现的是于T0时间点及T6时间点下，利用Image J软件测量各组别的人类皮肤纤维母细胞迁移至间隙的区域。说明的是，图4A中在T0时间点时，黑色虚线所围绕的区域即为各组别的原始的间隙面积(视为初始的伤口面积)，黑色虚线所围绕的区域以外的两侧即为人类纤维母细胞；图4A中在T6时间点时，黑色虚线所围绕的区域即为各组别于T6时间点下的间隙面积(视为T6时间点的伤口面积)。由图4A可见，在空白组中，T6时间点的伤口面积相较于T0时间点的伤口面积，于伤口外观上未见明显的伤口面积缩小的现象；在正控制组中，T6时间点的伤口面积相较于T0时间点的伤口面积，于伤口外观上见到伤口面积缩小的现象；在实验组中，T6时间点的伤口面积相较于T0时间点的伤口面积，于伤口外观上见到明显的伤口面积缩小的现象。

图4B是将图4A的结果量化后所得到的相对伤口愈合率。在图4B中，*表示与空白组比较具有统计上的显著差异(p<0.05)，而**表示与空白组比较具有统计上的非常显著差异(p<0.01)。

参照图4B。空白组为以未添加任何的测试样品的培养基进行培养的细胞，也就是指空白组中的人类纤维母细胞在正常的生理代谢情况下。于此，设定空白组的伤口愈合率为100％。正控制组为以添加含有胭脂米萃取液的培养基进行培养的细胞。相对于空白组，正控制组所观察到的伤口愈合率为213.8％。实验组为以添加含有胭脂米发酵液的培养基进行培养的细胞。相对于空白组，实验组所观察到的伤口愈合率为228.8％。

由此可知，在相同的培养时间下，相比于空白组，实验组所观察到的人类纤维母细胞的相对伤口愈合率有显著的提升(提升2.3倍)。同样地，在相同的培养时间下，相比于正控制组，实验组所观察到的人类纤维母细胞的相对伤口愈合率有显著的提升(提升1.1倍)。因此，经发酵而得的胭脂米发酵液相较于发酵前具有大幅提升人类纤维母细胞迁移至间隙的面积的能力，以及具有促进人类纤维母细胞修复的作用。

例5：胭脂米发酵液在提升皮肤细胞的粒线体活性上的能力

(5-1)材料

(a)细胞株：人类皮肤纤维母细胞(CCD-996SK，类型：human skin fibroblast)(BCRC：60153)。

(b)细胞培养基：含有10％(v/v)胎牛血清(Gibco；型号：10437-028)、1％(v/v)青霉素-链霉素(penicillin/streptomycin,Gibco；型号：15140122)、1mM丙酮酸钠(sodiumpyruvate,Gibco；型号：11360-070)、1.5g/L碳酸氢钠(Sigma；型号:S5761-500G)和0.1mM非必须氨基酸(Gibco；型号:11140050)的最低限度基本培养基(Minimum essential medium,MEM)(Gibco；型号：11095080)。

(c)测试样品：例1所获得的胭脂米萃取液以及例1所获得的胭脂米发酵液。

(5-2)实验流程

(a)首先，将人类纤维母细胞以1x 10

(b)在37℃培养细胞24小时后，将细胞分成3组(如表三所示)，并且将各组别的细胞培养基换成实验培养基(如表三所示)。各组细胞接续于37℃下再培养24小时。

(c)于培养后，各组别依据粒线体膜电位检测套组所附使用说明书进行粒线体活性分析。利用粒线体膜电位检测套组(BD

表三

(5-3)实验结果

参阅图5。空白组为以未添加任何的测试样品的培养基进行培养的细胞，也就是指空白组中的人类纤维母细胞在正常的生理代谢情况下，设定其本身的粒线体活性为100％。正控制组为以添加含有胭脂米萃取液的培养基进行培养的细胞。相对于空白组，正控制组所观察到的粒线体活性为102.91％。实验组为以添加含有胭脂米发酵液的培养基进行培养的细胞。相对于空白组，实验组所观察到的粒线体活性为120.21％。在图5中，***表示与空白组比较具有极显著差异(p<0.001)。

由此可知，在相同的培养时间下，相比于正控制组，实验组所观察到的粒线体活性有显著的提升(提升1.2倍)。实验结果显示具有抗氧化活性的胭脂米发酵液能提升皮肤细胞粒线体的活性，使皮肤细胞有足够能量以执行特定生理功能或增殖以汰换老旧细胞。粒线体参与细胞的氧化还原及生化代谢反应，其作为供给细胞能量的重要胞器。然而，当细胞中的粒线体在进行呼吸作用电子传递的过程中，会产生内源性的自由基。外源性和内源性的自由基伤害粒线体被认为是造成老化的主要原因。由实验可知，胭脂米发酵液具有提升个体的皮肤细胞的粒线体活性，因而具有提升皮肤细胞的抗老化作用。

例6：人体肌肤各项数值检测

(6-1)实验准备

(a)测试剂量：6.5mL的例1所获得的胭脂米发酵液/天。

(b)受试者人数与条件：10位受试者，其岁数年龄分布于20岁至55岁之间，个体的肌肤情况为肌肤松弛、毛孔粗大及/或肌肤泛红。

(6-2)实验进行方式

受试者于每日的早餐饭后服用一瓶测试样品，连续服用4周。受试者在服用前(未开始服用测试样品，并视为第0周)及服用后(即连续服用测试样品4周后，并视为第4周)，分别进行服用前后的个体的脸部肌肤的各项数值检测，依据不同的检测项目，使用对应的仪器及测量方式。于此，检测项目为(6-2-1)肌肤纹理检测、(6-2-2)肌肤皱纹检测、(6-2-3)肌肤毛孔检测以及(6-2-4)肌肤泛红检测。

在服用前、后进行脸部肌肤的各项数值检测时，受试者会先进行全脸清洁后，且受试者所在的测试区域的环境温度是与受试者的平均个体体温一致，且受试者所在的测试区域的环境湿度为适合人体肌肤的湿度，以减少测试区域的温度、湿度等因素会对个体皮肤所造成的外在影响。

(6-2-1)肌肤纹理(Texture)检测

(a)量测方式

使用美国Canfield公司所贩卖的VISIA高阶数字肤质检测仪对受试者的面部肌肤进行检测。透过肤质检测仪中的高分辨率的相机镜头以可见光(白光)对同一受试者在测试前与测试后的相同面部肌肤进行拍摄以取得面部肌肤的照片，并以肤质检测仪的内建软件根据皮肤的凹陷与凸起进行粗糙度分析以量化成对应的肌肤纹理(或称为皮肤粗糙度)。

(b)实验结果

图6A是其中一位受试者的肌肤纹理检测的结果照片图。相较于第0周，第4周的面部肌肤照片图显示在相同部位的面部肌肤中所检测到的皮肤凹陷与凸起的位置标记点明显减少。

请参阅图6B，将10位受试者于饮用前(第0周)的平均肌肤纹理视为100％。经过连续4周且每日服用胭脂米发酵液后，10位受试者的平均肌肤纹理为79.9％。亦即，每日服用6.5mL的胭脂米发酵液有效改善肌肤纹理达20.1％。基此，胭脂米发酵液具有改善个体肌肤纹理的作用。在图6B中，**表示与第0周的受试者的肌肤纹理比较具有非常显著差异(p<0.01)。

(6-2-2)肌肤皱纹(Wrinkles)检测

(a)量测方式

使用美国Canfield公司所贩卖的VISIA高阶数字肤质检测仪对受试者的面部肌肤进行检测。透过高分辨率的相机镜头以及可见光(白光)对同一受试者在测试前与测试后的相同面部肌肤进行拍摄以取得面部肌肤的照片，并以肤质检测仪的内建软件根据皱纹的长度与深度进行分析以量化成对应的皮肤皱纹。

(b)实验结果

图7A是其中一位受试者的肌肤皱纹检测结果的照片图以及肉眼观察结果的照片图。其中，上图即为大范围的观察区域的检测结果。其中，中图即为放大观察区域的肉眼观察结果，并且在不使用VISIA高阶数字肤质检测仪的情况下，观察第0周与第4周的肌肤皱纹的差异。其中，下图即为将图7A之中图透过VISIA高阶数字肤质检测仪而显示的检测结果。在图7A之下图，相较于第0周，第4周的面部肌肤照片图显示在相同部位的面部肌肤中所侦测到的皱纹的长度与深度的位置标记点明显减少。

请参阅图7B，将10位受试者于饮用前(第0周)的平均肌肤皱纹视为100％。经过连续4周且每日服用胭脂米发酵液后，10位受试者的平均肌肤皱纹为83％。亦即，每日服用6.5mL的胭脂米发酵液有效改善肌肤皱纹达17％。基此，胭脂米发酵液具有改善个体肌肤皱纹、抗皱的作用。在图7B中，*表示与第0周的受试者的肌肤皱纹比较具有显著差异(p<0.05)。

(6-2-3)肌肤毛孔(Pores)检测

(a)量测方式

使用美国Canfield公司所贩卖的VISIA高阶数字肤质检测仪对受试者的面部肌肤进行检测。透过高分辨率的相机镜头以及可见光(白光)对同一受试者在测试前与测试后的相同面部肌肤进行拍摄以取得面部肌肤的照片，并以肤质检测仪的内建软件根据皮肤粗大毛孔的数量进行分析以量化成对应的皮肤毛孔量。测量数值越高，说明粗大毛孔的数量越多。

(b)实验结果

图8A是其中一位受试者的肌肤毛孔检测的结果照片图。相较于第0周，第4周的面部肌肤照片图显示在相同部位的面部肌肤中所检测到的粗大毛孔的位置标记点明显减少。

请参阅图8B，将10位受试者于饮用前(第0周)的平均肌肤毛孔视为100％。经过连续4周且每日服用胭脂米发酵液后，10位受试者的平均肌肤毛孔为92.3％。亦即，每日服用6.5mL的胭脂米发酵液有效改善肌肤毛孔达7.7％。基此，胭脂米发酵液具有改善个体肌肤毛孔、紧致肌肤毛孔的作用。

(6-2-4)肌肤泛红(Redness)检测

(a)量测方式

使用美国Canfield公司所贩卖的VISIA高阶数字肤质检测仪对受试者的面部肌肤进行检测。利用肤质检测仪的RBX偏振光技术进行面部肌肤拍摄以取得脸部肌肤的照片，侦测皮肤深层血管或血红素，并以内建软件根据侦测结果进行测量以得到皮肤泛红的状况。测量数值越高，说明皮肤泛红状况越严重。

(b)实验结果

图9A是其中一位受试者的肌肤泛红检测的结果照片图。相较于第0周(结果照片图中显示颜色较深的位置即为肌肤泛红处)，第4周的面部肌肤照片图显示在相同部位的面部肌肤中所侦测到的肌肤泛红的状况明显降低。

请参阅图9B，将10位受试者于饮用前(第0周)的平均肌肤泛红视为100％。经过连续4周且每日服用胭脂米发酵液后，10位受试者的平均肌肤泛红为81.1％。亦即，每日服用6.5mL的胭脂米发酵液有效改善肌肤泛红达18.9％。基此，胭脂米发酵液具有改善个体肌肤泛红的作用。在图9B中，*表示与第0周的受试者的肌肤泛红比较具有显著差异(p<0.05)。

综上所述，根据任一实施例的胭脂米发酵液的制备方法，其适用制备具有护肤作用的胭脂米发酵液。在一些实施例中，经发酵所得的胭脂米发酵液相较于发酵前可大幅提升其所具有总黄酮含量。在一些实施例中，胭脂米发酵液还具有清除自由基、抗氧化及抗老化的作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液还可促进肌肤细胞增生的作用以及具有加速皮肤组织再生以强化皮肤的屏障的能力。在一些实施例中，胭脂米发酵液还可提升人类纤维母细胞的迁移至间隙的面积的能力以及具有促进人类纤维母细胞修复的作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液还可具有提升个体的皮肤细胞的粒线体活性，因而具有提升皮肤细胞的抗老化作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液还可具有改善个体肌肤纹理的作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液具有改善个体肌肤皱纹以及抗皱的作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液具有改善个体肌肤毛孔以及紧致肌肤毛孔的作用。在一些实施例中，胭脂米发酵液具有改善个体肌肤泛红的作用。

虽然本发明的技术内容已经以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神所作些许之更动与润饰，皆应涵盖于本发明的范畴内，因此本发明之保护范围当视后附之申请专利范围所界定者为准。