MOF蛋白及其编码基因在细胞分裂调控和肿瘤治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和肿瘤治疗领域，具体涉及一种乙酰转移酶MOF及其编码基因在细胞分裂调控和肿瘤治疗中的应用。

背景技术

多细胞生物体的生长发育离不开细胞增殖和细胞程序性死亡，有丝分裂是体细胞增殖的主要途径，细胞中的多种信号网络共同调控以保证有丝分裂的正常进行。亲本细胞在分裂期经过染色质凝集、分裂极确立、染色体整列、姐妹染色单体分离和胞质分裂等多个过程后分裂为两个子细胞，任一环节出错都可能使得遗传物质分配不均，最终导致细胞分裂失败或肿瘤的发生。有丝分裂失控是肿瘤细胞的重要特征(Jamasbi et al.,2022)，抑制细胞分裂是肿瘤治疗的有效手段。

MOF是MYST组蛋白乙酰转移酶家族的成员，最初作为MSL复合物中的催化亚基组分被发现报道，MSL复合物乙酰化雄性果蝇X染色体上的H4K16增强基因转录，维持雄性果蝇和雌性果蝇的性染色体基因平衡表达(Shevelyov et al.,2022)。此外，MOF参与了DNA双链断裂(Double-strand break，DSB)的损伤修复(Sharma et al.,2010)、胚胎发育和胚胎干细胞的多能性维持(Li et al.,2012)、自噬相关基因的表达调控(Fullgrabe et al.,2013)以及线粒体基因转录(Chatterjee et al.,2016)等过程，但MOF在有丝分裂中的功能尚不清楚。

PLK1是Polo样激酶(Polo-like kinases，PLKs)家族的成员之一，其活性受到翻译后修饰和蛋白质相互作用等多种方式的共同调控(Qi et al.,2018；Seki et al.,2008)，Aurora A激酶磷酸化PLK1的210位苏氨酸从而激活PLK1。在有丝分裂过程中，PLK1结合并磷酸化Cep85启动中心体分离(Chen et al.,2019)，磷酸化Haspin参与着丝粒上染色体乘客复合物(Chromosomal passenger complex，CPC)的招募(Ghenoiu et al.,2013)，磷酸化BUBR1保证染色体的正常分离(Suijkerbuijk et al.,2012)，它也参与中体区域的蛋白招募从而调控胞质分裂。PLK1是细胞周期的重要调控因子，在多种癌症中均发现了PLK1的高表达(Jang et al.,2006；Wang et al.,2021；Yang et al.,2017)，因此PLK1一直是癌症治疗的重要靶点。

发明内容

本发明通过在肿瘤细胞中抑制MOF的乙酰转移酶活性或抑制MOF蛋白表达，研究MOF在细胞分裂过程和肿瘤细胞增殖中的功能。

具体来说，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包括抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂。

另一方面，本发明提供抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述敲低MOF的试剂为RNA干扰试剂。

在一些实施方案中，所述RNA干扰试剂包括siRNA。

在一些实施方案中，所述siRNA的序列如SEQ ID NO:5所示。

在一些实施方案中，所述抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂包括使得MOF的乙酰转移酶活性降低或丧失的试剂。

在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不仅限于非小型肺癌、食管癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自非小型肺癌、食管癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌。

另一方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的敲低MOF的试剂。

另一方面，本发明提供抑制细胞分裂或抑制细胞增殖或抑制PLK1蛋白激酶活性的方法，优选地，所述方法不是用于疾病的治疗，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂。

本发明提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在抑制细胞分裂，或制备用于抑制细胞分裂的试剂盒中的应用，所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在抑制细胞增殖，或制备用于抑制细胞增殖的试剂盒中的应用，所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。

本发明还提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在抑制PLK1的蛋白激酶活性，或制备用于抑制PLK1蛋白激酶活性的试剂盒中的应用，所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述PLK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了抑制MOF的乙酰转移酶活性的试剂或敲低MOF的试剂在制备肿瘤治疗药物中的应用，所述MOF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

以上所述药物的功能为(a)或(b)或(c)：(a)抑制肿瘤细胞分裂；(b)抑制肿瘤生长；(c)治疗肿瘤。

进一步地，所述肿瘤细胞为高表达PLK1的人源肿瘤细胞，包括但不仅限于人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞。

进一步地，所述肿瘤为高表达PLK1的肿瘤。

以上任一所述敲低MOF蛋白的方式可以是RNA干扰技术，也可以是靶向细胞中位于MOF蛋白上游调控MOF基因表达的调控因子，从而抑制MOF蛋白的表达以减少细胞中的MOF蛋白含量，也可以是靶向细胞中调控MOF蛋白降解的调控因子，从而促进MOF蛋白的降解以减少细胞中的MOF蛋白含量，也可以是抑制细胞中MOF基因表达的化合物或小分子。

以上任一所述抑制MOF乙酰转移酶活性的物质为MOF乙酰转移酶活性抑制剂。

定义

γ-tubulin：一种参与微管形成的定位于中心体的微管蛋白，本发明的实施例中利用γ-tubulin-GFP观察中心体情况。

H2A：一种组蛋白，本发明的实施例中利用H2A-mCherry观察染色体情况。

有益结果

本发明通过在肿瘤细胞中敲低MOF蛋白或抑制MOF的乙酰转移酶活性，研究MOF在细胞分裂和细胞增殖中的功能发现：

(1)利用RNA干扰技术敲低人宫颈癌细胞HeLa细胞中的MOF蛋白后，HeLa细胞表现出有丝分裂异常表型，这种异常表型与通过siRNA在细胞中敲低PLK1蛋白后产生的有丝分裂异常表型类似，并且敲低MOF蛋白后，与对照组相比同一时刻进入有丝分裂的细胞比例显著降低，敲低MOF蛋白能够显著抑制细胞的分裂。

(2)MOF与细胞分裂相关蛋白激酶PLK1具有共定位，间期时两者在细胞核内共定位，分裂期时两者在中心体上具有共定位，并且两者之间存在直接相互作用。

(3)利用RNA干扰技术在HeLa细胞中敲低MOF或转染MOF乙酰转移酶活性缺失突变体后，PLK1的蛋白激酶活性受到显著抑制。

(4)利用RNA干扰技术在HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞中敲低MOF蛋白，能够抑制细胞内PLK1的激酶活性，并显著抑制细胞的增殖。

附图说明

图1是检测敲低MOF对细胞有丝分裂的影响，γ-tubulin-GFP显示中心体情况，H2A-mCherry显示染色体情况，其中A为活细胞成像结果；B和C为染色体排列和纺锤体异常表型统计结果。

图2是检测敲低MOF后不同时间点进入分裂期的细胞比例的实验结果。

图3是MOF和PLK1的siRNA敲低效率检测。

图4是MOF和PLK1在间期和分裂期时在细胞内的定位检测。

图5是MOF和PLK1相互作用检测的免疫共沉淀和Pull down实验结果，其中A是用Flag抗体进行的免疫共沉淀实验结果；B是用HA抗体进行的免疫共沉淀实验结果；C是用GST琼脂糖珠进行的Pull down实验结果。

图6是通过免疫印迹检测敲低MOF对不同时间点Cyclin B1、PLK1的表达及PLK1激酶活性水平的影响。

图7是通过免疫印迹检测MOF的乙酰转移酶活性对PLK1激酶活性的影响。

图8是敲低MOF检测HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞中PLK1表达及激酶活性水平的实验结果，其中A为HeLa细胞的结果；B为HGC27细胞的结果；C为MDA-MB-231细胞的结果。

图9是敲低MOF检测HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞的增殖能力的实验结果，其中A、B为HeLa细胞的结果；C、D为HGC27细胞的结果；E、F为MDA-MB-231细胞的结果。

具体实施方式

以下实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可通过常规商业化途径购买。以下实施例所涉及的细胞生物学和分子生物学实验操作，如无特殊说明，均为本领域常规实验操作或根据实验中所用试剂的说明书进行。

本发明所用到的细胞：HeLa细胞、HGC27细胞和MDA-MB-231细胞均购自上海细胞库。

本发明所用到的siRNA及siRNA转染试剂siRNA-Mate均购自吉玛基因生物公司，实验中所用到的siControl和溶解siRNA粉末的DEPC水均为吉玛基因生物公司提供，涉及到的siRNA序列见表1。

表1 siRNA序列

本发明涉及的实验方法如下：

1.细胞培养及铺板：

(1)弃T25细胞培养瓶中旧培养液，用PBS缓冲液润洗细胞后吸去PBS，加入37℃预热的胰酶，待细胞消化好后吸去胰酶，加入新鲜DMEM培养基(购自VivaCell Biosciences，货号：C3113-0500)重悬细胞，按照1:4的比例传代至新培养瓶中，置于细胞培养箱(含5％CO

(2)若后续细胞用于显微镜下活细胞观察，则预先在六孔板中置入18mm×18mm玻片，若后续细胞用于显微镜下免疫荧光观察，则预先在六孔板中置入20mm×20mm的玻片。若后续实验需要将细胞同步化至有丝分裂期，则预先用促进细胞贴壁的多聚赖氨酸(购自Sigma，货号：P6407)孵育玻片或六孔板。在六孔板中加入1.5mL新鲜DMEM培养基和400μL细胞悬液，摇匀后放置于细胞培养箱(含5％CO

2.siRNA转染

每1OD的siRNA粉末用125μL的DEPC水溶解，在RNase-free的EP管中加入200μLOpti-MEM培养基(购自Gibco，货号：31985062)，加入5μL溶解后的siRNA后再加入5μLsiRNA-Mate，涡旋混匀后室温静置10分钟。将培养至合适密度的细胞更换新的DMEM培养基，将孵育完成后的混合液滴加至六孔板中。

3.质粒转染

准备两组EP管，分别加入100μL Opti-MEM培养基，将质粒或质粒混合物加入到其中一组EP管中，利用Lipofectamine 3000(购自Invitrogen)试剂盒进行转染。每1μg质粒或质粒混合物加入1μL试剂盒中的P3000溶液，用枪头混匀后室温静置3分钟。向对应的另一组EP管中加入与P3000等量的Lipo 3000溶液，将两组EP管中的溶液混合在一起，室温下静置孵育12分钟。将培养至合适密度的细胞更换新的DMEM培养基，将孵育完成后的混合液滴加至六孔板中。

4.免疫荧光

本发明实施例中涉及的免疫荧光是向细胞中转染并表达带有GFP(基因序列如SEQID NO:25所示)或mCherry(基因序列如SEQ ID NO:26所示)荧光标签的蛋白后，将细胞固定通透封片，具体实验步骤如下：

(1)细胞转染48小时后，吸去旧培养基，用PBS润洗细胞后弃去PBS。每孔加入1mL4％多聚甲醛，室温固定细胞10分钟。

(2)弃4％多聚甲醛，用PBS润洗细胞3次，每次5分钟。用PBS缓冲液配制含有0.2％TritonX-100的通透液，加入到细胞中，室温通透10分钟。

(3)PBS润洗细胞3次，每次5分钟。用PBS稀释Hoechst DNA染料(购自ThermoScientific，货号：62249)，将稀释液滴加在细胞爬片上，避光室温孵育10分钟。

(4)吸除DNA染料，PBS润洗细胞3次，每次5分钟。将抗荧光淬灭封片剂用PBS以1:1的比例稀释后，每个载玻片上滴加15μL稀释后的封片剂，覆盖细胞爬片后，用指甲油封片，尽快在显微镜下观察。

5.免疫共沉淀

(1)细胞转染48小时后，用PBS润洗细胞后加入胰酶消化，细胞变圆后加入新鲜DMEM培养基终止消化，将细胞悬液转移至离心管中，1100rpm离心5分钟。弃上清，用PBS重悬细胞后，相同条件离心5分钟，弃去PBS。

(2)加入250μL WB/IP裂解液重悬细胞沉淀(购自碧云天，货号：P0013)，冰浴30分钟，过程中涡旋震荡3次。离心机预冷至4℃，15000g离心15分钟。

(3)弃沉淀，向上清中加入15μL的proteinA/G琼脂糖珠(购自Santa Cruz，货号：sc-2003)，4℃孵育30分钟。

(4)置于4℃离心机中3000rpm离心5分钟，取适量上清留存作为Input。

(5)将抗体按照说明书推荐比例加入至上清中，并用WB/IP裂解液扩充体系至500μL。4℃过夜旋转孵育。

(6)加入20μL proteinA/G琼脂糖珠，4℃孵育3小时。

(7)4℃，3000rpm离心5分钟后，弃上清。用1mL预冷的PBS重悬琼脂糖珠，同样条件再次离心5分钟。

(8)重复PBS洗涤步骤5次，最后一次离心结束后，弃上清向沉淀中加入1×SDSLoading buffer，100℃煮样10分钟。

6.聚合酶链式反应

利用高保真DNA聚合酶试剂盒(购自Vazyme，货号：P505-01)进行PCR反应。50μL体系反应组分如下：25μL 2×Phanta Buffer，2μL模板DNA，2μL正向引物，2μL反向引物，1μLdNTP，1μL DNA Polymerase，去离子水补充体系至50μL。

混匀后放入PCR仪，PCR反应程序为：95℃预变性1分钟，95℃变性15秒，55℃-65℃退火15秒，72℃延伸(每1kb长度延伸1分钟)，72℃彻底延伸10分钟。

PCR后的产物通过产物纯化试剂盒(购自诺唯赞，货号：DC301-01)按照说明书步骤进行回收。

7.重组与转化

PCR产物与载体通过重组连接在一起，重组过程使用重组试剂盒(购自诺唯赞，货号：C112)，重组后的产物加入到大肠杆菌DH5α感受态中进行转化。筛选阳性克隆进行扩增，使用质粒抽提试剂盒(购自诺唯赞，货号：DC201-01)提取质粒，质粒测序正确后方可用于后续实验。

8.细胞增殖实验

(1)使用EdU-488细胞增殖检测试剂盒(购自碧云天，货号：C00715)进行细胞增殖检测。将EdU加入到DMEM培养基中，使其终浓度为10μM，细胞置于培养箱(含5％CO

(2)孵育结束后，用PBS缓冲液润洗细胞3次，加入4％多聚甲醛室温固定15分钟。

(3)弃4％多聚甲醛，用PBS润洗细胞3次。用PBS缓冲液配制含有0.2％TritonX-100的通透液，加入到细胞中，室温通透15分钟。

(4)PBS润洗细胞3次。用PBS稀释Hoechst DNA染料，将稀释液滴加在细胞爬片上，避光室温孵育10分钟。

(5)吸除DNA染料，PBS润洗细胞3次，每次5分钟。将抗荧光淬灭封片剂用PBS以1:1的比例稀释后，每个载玻片上滴加15μL稀释后的封片剂，指甲油封片，尽快在显微镜下观察。

9.细胞同步化处理

(1)Thymidine(购自Sigma，货号：T1895)是一种能够掺入并阻断DNA合成的一种脱氧核糖核酸特殊前体，工作浓度为2.5mM。细胞用Thymidine处理18小时后，PBS润洗两次并释放到新鲜DMEM培养基中8小时，即可将细胞同步化至有丝分裂期。

(2)Nocodazole(购自Sigma，货号：M1404)能够抑制微管形成，因此它与Thymidine联用可以将细胞同步化至有丝分裂的前中期。具体方法为：Thymidine处理且释放8小时后的细胞再用100ng/mL的Nocodazole处理1小时，即可将细胞同步化至前中期。

10.Pull down实验

(1)取适量GST琼脂糖珠(购自Solarbio，货号：P2020)溶液1000g，4℃离心10分钟，去除上清后用PBS重悬，重复三次。

(2)取等量的GST(氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)和GST-PLK1(氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示)加入到洗涤后的GST琼脂糖珠溶液中，4℃冰箱中旋转孵育3小时。

(3)1000g，4℃离心10分钟，弃上清，用含0.1％Tween 20的PBS洗涤，重复5次。

(4)用500μL PBS配制的5％BSA缓冲液重悬，4℃旋转孵育1小时。

(5)向两组中分别加入等量的His-MOF蛋白，4℃旋转孵育过夜。

(6)1000g，4℃离心10分钟，弃上清，用含0.1％Tween 20的PBS洗涤，重复5次。

(7)沉淀中加入1×SDS Loading buffer(购自翌圣生物，货号：20315ES05，使用时用去离子水稀释)，100℃水浴锅中煮样10分钟。

11.蛋白表达纯化

(1)将融合蛋白质粒转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌中，涂布于平板上。37℃过夜培育后，挑取阳性克隆至5mL含相应抗生素的液体LB培养基中，37℃，250rpm培育12小时。

(2)扩充培养体系至800mL，继续在摇床上培养，当菌液的OD600值达到0.8-1.0时，将菌液置于冰水中降温至16℃。

(3)加入IPTG，使其工作浓度为0.2mM。16℃，250rpm诱导20-24小时。

(4)4℃，5000rpm离心15分钟，弃上清，加入40mL预冷的Lysis buffer(1mM PMSF，150mM NaCl，0.5M HEPES，1mM MgSO

(5)将镍柱填料(购自Qiagen，货号：30210)平衡后与蛋白上清混合，4℃冰箱中孵育3小时。

(6)先用50mM浓度的咪唑洗脱杂蛋白，再用200mM浓度的咪唑洗脱目的蛋白，蛋白储存于-80℃冰箱。

若纯化GST标签蛋白则用预冷的Lysis buffer平衡GST琼脂糖珠(购自Solarbio，货号：P2020)，4℃冰箱中过夜孵育。后续步骤中用50mM Tris-HCl(pH7.0)去除杂蛋白，用50mM Tris-HCl(含有20mM还原性谷胱甘肽，pH8.0)洗脱目的蛋白。

12.数据处理

本发明实施例中的实验数据通过学生t检验进行分析，其中*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****p<0.0001表示数据具有显著性差异。

实施例1MOF在有丝分裂中的功能鉴定

为了确定MOF蛋白在细胞有丝分裂过程中的功能，利用RNA干扰技术在HeLa细胞中敲低MOF蛋白，并向HeLa细胞中共转染γ-tubulin-GFP(SEQ ID NO:7)和H2A-mCherry(SEQID NO:8)两种质粒，将HeLa细胞用Thymidine同步化至有丝分裂期后，在显微镜下观察细胞的分裂情况。结果显示，在HeLa细胞中敲低MOF蛋白后，出现了不同于对照组的异常的有丝分裂表型(图1A，标尺为5μm)，发生染色体赤道板集合缺陷的细胞比例增加了48.27％，P<0.001(图1B)，也出现了约24.76％的单极纺锤体细胞比例(图1C)。敲低MOF蛋白产生的有丝分裂异常表型与敲低PLK1蛋白产生的有丝分裂异常表型类似(图1)，表明敲低MOF能够影响HeLa细胞的有丝分裂，并且这种影响可能与PLK1蛋白相关。

将HeLa细胞分别转染siControl和siMOF，并用Thymidine处理同步化，将细胞释放至含有Nocodazole的培养基中，分别在释放后的6、7、8、9、10小时将细胞固定，Hoechst染色DNA后统计各组各时间点进入分裂期的细胞占总细胞的比例。结果如图2所示，敲低MOF的细胞与同一时间点的对照组细胞相比，进入分裂期的细胞比例显著降低，释放8小时后对照组进入分裂期的细胞比例已经接近20％，而敲低MOF组的分裂细胞比例还不到10％。结合释放时间来看，敲低MOF后进入有丝分裂的细胞比例增长趋势显著延缓于对照组，当释放10小时后，MOF敲低组进入分裂期的细胞比例才接近于20％，而对照组的细胞释放8小时后分裂期细胞比例已经接近20％，表明敲低MOF会显著抑制细胞的分裂。

将转染了对应siRNA的HeLa细胞同步化至有丝分裂期，收集细胞并检测siRNA的敲低效率，使用MOF抗体(购自Abcam，货号：ab200660)和PLK1抗体(购自Abcam，货号：ab17056)。结果如图3显示，MOF和PLK1的siRNA都能够显著敲低HeLa细胞中相应的蛋白。

实施例2MOF与PLK1共定位的鉴定

1.构建mCherry-MOF

以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得MOF基因，并连接到带有mCherry荧光蛋白的载体上，所用引物为：

上游引物：

5’-GCTGTACAAGAGGGGGTACCCGATGGCGGCACAGGGAGCT-3’

(SEQ ID NO:9)

下游引物：

5’-CACACTGGACTAGTGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTG-3’(SEQ ID NO:10)

用BamHⅠ和KpnⅠ酶切载体pcDNA3.1-mCherry(购自Invitrogen)，将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序，测序正确后即得到mCherry-MOF。

2.构建GFP-PLK1

以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得PLK1基因，并连接到带有GFP荧光蛋白的载体上，所用引物为：

上游引物：

5’-CTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGCAGGG-3’(SEQ ID NO:11)

下游引物：

5’

-GACTGCAGAATTCGAAGCTTTCAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTGG C-3’(SEQ ID NO:12)

用HindⅢ酶切载体pEGFP-C3(购自Clontech公司)，将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序，测序正确后即得到GFP-PLK1。

3.MOF与PLK1定位观察

向HeLa细胞中共转染mCherry-MOF和GFP-PLK1，将细胞同步化至分裂期，固定通透细胞，染色DNA后封片，显微镜下观察。

结果如图4所示(标尺为5μm)，MOF在间期时定位于细胞核中，在分裂期定位于纺锤体以及弥散在细胞质中，PLK1在间期时有少量的细胞核定位，分裂期时在中心体和动粒上均有定位，两者间期时在细胞核内具有共定位，在分裂期的中心体上具有共定位。

实施例3MOF与PLK1的相互作用检测

1.构建HA-MOF

以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得MOF基因，并连接到带有HA标签的载体上，所用引物为：

上游引物：

5’-GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGGCGGCACAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:13)

下游引物：

5’-ATCGATTGAATTCGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTGCT-3’(SEQ ID NO:14)

用BamHⅠ酶切pKH3载体(购自Clontech公司)，将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序，测序正确后即得到HA-MOF。

2.构建Flag-PLK1

以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得PLK1基因，并连接到带有Flag标签的载体上，所用引物为：

上游引物：

5’-CAAGGATGACGATGACAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGC-3’

(SEQ ID NO:15)

下游引物：

5’

-GAGATGAGTTTTTGTTCGGATCCGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTG-3’(SEQ ID NO:16)

用HindⅢ和BamHⅠ酶切载体p3×FLAG-Myc-CMV-24(购自Sigma公司)，将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序，测序正确后即得到Flag-PLK1。

3.构建His-MOF

以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得MOF基因，并连接到带有His标签的载体上，所用引物为：

上游引物：

5’-GACGACGACGACAAGCATATGATGGCGGCACAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:17)

下游引物：

5’

-GGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTGCTTACTTCTTGGAGAGCTTGAC TTGCT-3’(SEQ ID NO:18)

用NdeⅠ和BamHⅠ酶切pET19b载体(购自Clontech公司)，将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序，测序正确后即得到His-MOF。

4.构建GST-PLK1

以HeLa细胞的cDNA文库为模板进行PCR反应获得PLK1基因，并连接到带有GST标签的载体上，所用引物为：

上游引物：

5’-GGCCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGAGTGCTGCAGTGACTGC-3’(SEQ ID NO:19)

下游引物：

5’

-GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTTAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCT-3’(SEQ ID NO:20)

用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切载体pGEX-6p-1(购自Clontech)，将酶切后的载体与PCR产物重组转化后提取质粒进行测序，测序正确后即得到GST-PLK1。

5.MOF与PLK1体内免疫共沉淀实验

(1)将HA-MOF分别与Flag空载或Flag-PLK1共转染至HeLa细胞中，将细胞用Thymidine同步化至分裂期后，收集细胞用Flag抗体(购自Sigma，货号：F1804)进行免疫共沉淀实验。

(2)将Flag-PLK1分别与HA空载或HA-MOF共转染至HeLa细胞中，将细胞用Thymidine同步化至分裂期后，收集细胞用HA抗体(购自Proteintech，货号：66006-2-Ig)进行免疫共沉淀实验。

6.MOF与PLK1体外Pull down实验

利用大肠杆菌中纯化表达的His-MOF蛋白和GST-PLK1蛋白进行Pull down实验，考马斯亮蓝染色显示GST和GST-PLK1，免疫印迹后用MOF抗体(购自Abcam，货号：ab200660)显影His-MOF。

结果显示，在体内，HA-MOF可以随着Flag-PLK1一起被Flag抗体结合的琼脂糖珠沉淀下来(图5A)，Flag-PLK1也可以随着HA-MOF一起被HA抗体结合的琼脂糖珠沉淀下来(图5B)，说明MOF和PLK1在细胞内存在相互作用。在体外，His-MOF可以与GST-PLK1一同被GST琼脂糖珠沉淀下来(图5C)，说明MOF与PLK1之间存在直接相互作用。

实施例4检测敲低MOF对PLK1激酶活性的影响

HeLa细胞分别转染siControl和siMOF后，Thymidine处理18小时，PBS润洗细胞两次，更换新鲜的DMEM培养基后在细胞培养箱(37℃，5％CO

结果如图6显示，在细胞中转染siRNA抑制MOF蛋白的表达，PLK1的表达量不受影响，但表征PLK1激酶活性的PLK1-pT210水平受到显著抑制。Cyclin B1在有丝分裂结束时通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解，如siControl组所示，而相较于siControl组，siMOF组中的Cyclin B1在释放11小时后仍处于较高水平，说明有丝分裂无法及时退出。这些结果表明，敲低MOF抑制了PLK1的激酶活性，并影响细胞有丝分裂进程。

实施例5检测MOF的乙酰转移酶活性对PLK1激酶活性的影响

1.构建HA-MOF resist

以上述实施例中构建的HA-MOF质粒为模板，进行PCR反应，所用引物为：

上游引物：

5’-GAAGTCATTCAATCACGTGTCAACGACCAGGAGGGCCG-3’(SEQ ID NO:21)

下游引物：

5’-GTGATTGAATGACTTCAGCAGAATGCCAGGTGCTATCC-3’(SEQ ID NO:22)

PCR产物加入DpnⅠ酶消化(购自碧云天，货号：D6257)37℃水浴1小时，自身重组转化并提取质粒进行测序，测序正确的质粒即为HA-MOF resist。HA-MOF resist能在细胞转染siMOF的情况下不受影响地表达HA标签的MOF。

2.构建HA-MOF K274R resist

以上述构建的HA-MOF resist质粒为模板，进行PCR反应，所用引物为：

上游引物：

5’-GACCATCGCACACTGTACTTTGACGTGGAGCC-3’(SEQ ID NO:23)

下游引物：

5’-ACAGTGTGCGATGGTCCAGGAAAAGCTTGGCCA-3’(SEQ ID NO:24)

PCR产物加入DpnⅠ酶消化，37℃水浴1小时，自身重组转化并提取质粒进行测序，测序正确的质粒即为HA-MOF K274R resist。MOF在第274位赖氨酸位置发生自乙酰化，将274位的赖氨酸突变为精氨酸后MOF的乙酰转移酶活性受到显著抑制。HA-MOF K274R resist能在细胞转染siMOF的情况下不受影响地表达HA标签的MOF乙酰转移酶活缺失突变体。

3.回补实验

在HeLa细胞中使用Lipo3000试剂盒分别转染HA-MOF resist和HA-MOF K274Rresist质粒，6小时后更换新DMEM培养基，向两组中同时转染siMOF敲低内源的MOF蛋白，并通过Thymidine和Nocodazole将细胞同步化至前中期进行免疫印迹检测PLK1、PLK1-pT210、HA-MOF resist和HA-MOF K274R resist水平，一抗使用PLK1抗体、PLK1-pT210抗体、HA抗体(购自Proteintech，货号：51064-2-AP)和GAPDH抗体在4℃摇床孵育过夜，二抗使用羊抗鼠二抗抗体或羊抗兔二抗抗体室温孵育1小时后显影。

结果如图7所示，利用siRNA敲低细胞中内源性MOF蛋白时，野生型MOF能够回补由内源性MOF缺失引起的PLK1 T210磷酸化水平抑制，而MOF的乙酰转移酶活性缺失突变体无法回补由内源性MOF缺失引起的PLK1 T210磷酸化水平抑制，即MOF的乙酰转移酶活性对PLK1的激酶活性至关重要。

实施例6检测敲低MOF对细胞增殖能力的影响

1.检测敲低MOF对HeLa细胞内PLK1激酶活性及增殖能力的影响

HeLa细胞(一种宫颈癌细胞系)铺板后分别转染siControl和siMOF，将细胞用Thymidin和Nocodazole同步化至前中期，收集细胞进行免疫印迹，检测PLK1、PLK1-pT210和MOF水平。

六孔板铺玻片后铺HeLa细胞，分别转染siControl和siMOF，48小时后对细胞进行EdU实验检测细胞增殖情况。

2.检测敲低MOF对HGC27细胞内PLK1激酶活性及增殖能力的影响

HGC27细胞(源自未分化胃癌组织)铺板后分别转染siControl和siMOF，将细胞用Thymidin和Nocodazole同步化至前中期，收集细胞进行免疫印迹，检测PLK1、PLK1-pT210和MOF水平。

六孔板铺玻片后铺HGC27细胞，分别转染siControl和siMOF，48小时后对细胞进行EdU实验检测细胞增殖情况。

3.检测敲低MOF对MDA-MB-231细胞内PLK1激酶活性及增殖能力的影响

MDA-MB-231细胞(一种人乳腺癌细胞系)铺板后分别转染siControl和siMOF，将细胞用Thymidine和Nocodazole同步化至前中期，收集细胞进行免疫印迹，检测PLK1、PLK1-pT210和MOF水平。

六孔板铺玻片后铺MDA-MB-231细胞，分别转染siControl和siMOF，48小时后对细胞进行EdU实验检测细胞增殖情况。

结果显示，敲低MOF后人宫颈癌细胞HeLa细胞中的PLK1蛋白表达不受影响，但PLK1-pT210水平下降，说明PLK1的激酶活性受到显著抑制(图8A)。人胃癌细胞HGC27细胞中敲低MOF后，PLK1的表达不受影响，但PLK1-pT210水平下降，表示PLK1的激酶活性受到显著抑制(图8B)。在人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中敲低MOF后，PLK1的表达不受影响，PLK1-pT210水平下降，说明PLK1的激酶活性受到显著抑制(图8C)。EdU实验结果显示，敲低MOF后，HeLa细胞的EdU阳性细胞比例下降了约12.06％，HGC27细胞的EdU阳性细胞比例下降了约10.91％，MDA-MB-231细胞的EdU阳性细胞比例下降了约13.93％，说明敲低MOF能够显著抑制HeLa细胞(图9A和B，p<0.0001)、HGC27细胞(图9C和D，p<0.05)和MDA-MB-231细胞(图9E和F，p<0.01)的增殖能力。

以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列

SEQ ID NO:1MOF蛋白的氨基酸序列

MAAQGAAAAVAAGTSGVAGEGEPGPGENAAAEGTAPSPGRVSPPTPARGEPEVTVEIGETYLCRRPDSTWHSAEVIQSRVNDQEGREEFYVHYVGFNRRLDEWVDKNRLALTKTVKDAVQKNSEKYLSELAEQPERKITRNQKRKHDEINHVQKTYAEMDPTTAALEKEHEAITKVKYVDKIHIGNYEIDAWYFSPFPEDYGKQPKLWLCEYCLKYMKYEKSYRFHLGQCQWRQPPGKEIYRKSNISVYEVDGKDHKIYCQNLCLLAKLFLDHKTLYFDVEPFVFYILTEVDRQGAHIVGYFSKEKESPDGNNVACILTLPPYQRRGYGKFLIAFSYELSKLESTVGSPEKPLSDLGKLSYRSYWSWVLLEILRDFRGTLSIKDLSQMTSITQNDIISTLQSLNMVKYWKGQHVICVTPKLVEEHLKSAQYKKPPITVDSVCLKWAPPKHKQVKLSKK

SEQ ID NO:2MOF的基因序列

ATGGCGGCACAGGGAGCTGCTGCGGCGGTTGCGGCGGGGACTTCAGGGGTCGCGGGGGAGGGCGAGCCCGGGCCCGGGGAGAATGCGGCCGCTGAGGGGACCGCCCCATCCCCGGGCCGCGTCTCTCCGCCGACCCCGGCGCGCGGCGAGCCGGAAGTCACGGTGGAGATCGGAGAAACGTACCTGTGCCGGCGACCGGATAGCACCTGGCATTCTGCTGAAGTGATCCAGTCTCGAGTGAACGACCAGGAGGGCCGAGAGGAATTCTATGTACACTACGTGGGCTTTAACCGGCGGCTGGACGAGTGGGTAGACAAGAACCGGCTGGCGCTGACCAAGACAGTGAAGGATGCTGTACAGAAGAACTCAGAGAAGTACCTGAGCGAGCTCGCAGAGCAGCCTGAGCGCAAGATCACTCGCAACCAAAAGCGCAAGCATGATGAGATCAACCATGTGCAGAAGACTTATGCAGAGATGGACCCCACCACAGCAGCCTTGGAGAAGGAGCATGAGGCGATCACCAAGGTGAAGTATGTGGACAAGATCCACATCGGGAACTACGAAATTGATGCCTGGTATTTCTCACCATTCCCCGAAGACTATGGGAAACAGCCCAAGCTCTGGCTCTGCGAGTACTGCCTCAAGTACATGAAATATGAGAAGAGCTACCGCTTCCACTTGGGTCAGTGCCAGTGGCGGCAGCCCCCCGGGAAAGAGATCTACCGCAAGAGCAACATCTCCGTGTACGAAGTTGATGGCAAAGACCATAAGATTTACTGTCAGAACCTGTGTCTGCTGGCCAAGCTTTTCCTGGACCATAAGACACTGTACTTTGACGTGGAGCCGTTCGTCTTTTACATCCTGACTGAGGTGGACCGGCAGGGGGCCCACATTGTTGGCTACTTCTCCAAGGAGAAGGAGTCCCCGGATGGAAACAATGTGGCCTGCATCCTGACCTTGCCCCCCTACCAACGCCGCGGCTACGGGAAGTTCCTCATCGCTTTCAGTTATGAGCTCTCCAAGCTGGAGAGCACAGTCGGCTCCCCGGAGAAGCCGCTGTCTGACCTGGGCAAGCTCAGCTACCGCAGCTACTGGTCCTGGGTGCTGCTGGAGATCCTGCGGGACTTCCGGGGCACACTGTCCATCAAGGACCTCAGCCAGATGACCAGTATCACCCAAAATGACATCATCAGTACCCTGCAATCCCTCAATATGGTCAAGTACTGGAAGGGCCAGCACGTGATCTGTGTCACACCCAAGCTGGTGGAGGAGCACCTCAAAAGTGCCCAGTATAAGAAACCACCCATCACAGTGGACTCCGTCTGCCTCAAGTGGGCACCCCCCAAGCACAAGCAAGTCAAGCTCTCCAAGAAG

SEQ ID NO:3PLK1的氨基酸序列

MSAAVTAGKLARAPADPGKAGVPGVAAPGAPAAAPPAKEIPEVLVDPRSRRRYVRGRFLGKGGFAKCFEISDADTKEVFAGKIVPKSLLLKPHQREKMSMEISIHRSLAHQHVVGFHGFFEDNDFVFVVLELCRRRSLLELHKRRKALTEPEARYYLRQIVLGCQYLHRNRVIHRDLKLGNLFLNEDLEVKIGDFGLATKVEYDGERKKTLCGTPNYIAPEVLSKKGHSFEVDVWSIGCIMYTLLVGKPPFETSCLKETYLRIKKNEYSIPKHINPVAASLIQKMLQTDPTARPTINELLNDEFFTSGYIPARLPITCLTIPPRFSIAPSSLDPSNRKPLTVLNKGLENPLPERPREKEEPVVRETGEVVDCHLSDMLQQLHSVNASKPSERGLVRQEEAEDPACIPIFWVSKWVDYSDKYGLGYQLCDNSVGVLFNDSTRLILYNDGDSLQYIERDGTESYLTVSSHPNSLMKKITLLKYFRNYMSEHLLKAGANITPREGDELARLPYLRTWFRTRSAIILHLSNGSVQINFFQDHTKLILCPLMAAVTYIDEKRDFRTYRLSLLEEYGCCKELASRLRYARTMVDKLLSSRSASNRLKAS

SEQ ID NO:4PLK1的基因序列

ATGAGTGCTGCAGTGACTGCAGGGAAGCTGGCACGGGCACCGGCCGACCCTGGGAAAGCCGGGGTCCCCGGAGTTGCAGCTCCCGGAGCTCCGGCGGCGGCTCCACCGGCGAAAGAGATCCCGGAGGTCCTAGTGGACCCACGCAGCCGGCGGCGCTATGTGCGGGGCCGCTTTTTGGGCAAGGGCGGCTTTGCCAAGTGCTTCGAGATCTCGGACGCGGACACCAAGGAGGTGTTCGCGGGCAAGATTGTGCCTAAGTCTCTGCTGCTCAAGCCGCACCAGAGGGAGAAGATGTCCATGGAAATATCCATTCACCGCAGCCTCGCCCACCAGCACGTCGTAGGATTCCACGGCTTTTTCGAGGACAACGACTTCGTGTTCGTGGTGTTGGAGCTCTGCCGCCGGAGGTCTCTCCTGGAGCTGCACAAGAGGAGGAAAGCCCTGACTGAGCCTGAGGCCCGATACTACCTACGGCAAATTGTGCTTGGCTGCCAGTACCTGCACCGAAACCGAGTTATTCATCGAGACCTCAAGCTGGGCAACCTTTTCCTGAATGAAGATCTGGAGGTGAAAATAGGGGATTTTGGACTGGCAACCAAAGTCGAATATGACGGGGAGAGGAAGAAGACCCTGTGTGGGACTCCTAATTACATAGCTCCCGAGGTGCTGAGCAAGAAAGGGCACAGTTTCGAGGTGGATGTGTGGTCCATTGGGTGTATCATGTATACCTTGTTAGTGGGCAAACCACCTTTTGAGACTTCTTGCCTAAAAGAGACCTACCTCCGGATCAAGAAGAATGAATACAGTATTCCCAAGCACATCAACCCCGTGGCCGCCTCCCTCATCCAGAAGATGCTTCAGACAGATCCCACTGCCCGCCCAACCATTAACGAGCTGCTTAATGACGAGTTCTTTACTTCTGGCTATATCCCTGCCCGTCTCCCCATCACCTGCCTGACCATTCCACCAAGGTTTTCGATTGCTCCCAGCAGCCTGGACCCCAGCAACCGGAAGCCCCTCACAGTCCTCAATAAAGGCTTGGAGAACCCCCTGCCTGAGCGTCCCCGGGAAAAAGAAGAACCAGTGGTTCGAGAGACAGGTGAGGTGGTCGACTGCCACCTCAGTGACATGCTGCAGCAGCTGCACAGTGTCAATGCCTCCAAGCCCTCGGAGCGTGGGCTGGTCAGGCAAGAGGAGGCTGAGGATCCTGCCTGCATCCCCATCTTCTGGGTCAGCAAGTGGGTGGACTATTCGGACAAGTACGGCCTTGGGTATCAGCTCTGTGATAACAGCGTGGGGGTGCTCTTCAATGACTCAACACGCCTCATCCTCTACAATGATGGTGACAGCCTGCAGTACATAGAGCGTGACGGCACTGAGTCCTACCTCACCGTGAGTTCCCATCCCAACTCCTTGATGAAGAAGATCACCCTCCTTAAATATTTCCGCAATTACATGAGCGAGCACTTGCTGAAGGCAGGTGCCAACATCACGCCGCGCGAAGGTGATGAGCTCGCCCGGCTGCCCTACCTACGGACCTGGTTCCGCACCCGCAGCGCCATCATCCTGCACCTCAGCAACGGCAGCGTGCAGATCAACTTCTTCCAGGATCACACCAAGCTCATCTTGTGCCCACTGATGGCAGCCGTGACCTACATCGACGAGAAGCGGGACTTCCGCACATACCGCCTGAGTCTCCTGGAGGAGTACGGCTGCTGCAAGGAGCTGGCCAGCCGGCTCCGCTACGCCCGCACTATGGTGGACAAGCTGCTGAGCTCACGCTCGGCCAGCAACCGTCTCAAGGCCTCC

SEQ ID NO:5敲低MOF蛋白的siRNA序列

GUGAUCCAGUCUCGAGUGA

SEQ ID NO:6敲低PLK1蛋白的siRNA序列

AGAUUGUGCCUAAGUCUCU

SEQ ID NO:7γ-tubulin-GFP的DNA序列

ATGCCGAGGGAAATCATCACCCTACAGTTGGGCCAGTGCGGCAATCAGATTGGGTTCGAGTTCTGGAAACAGCTGTGCGCCGAGCATGGTATCAGCCCCGAGGGCATCGTGGAGGAGTTCGCCACCGAGGGCACTGACCGCAAGGACGTCTTTTTCTACCAGGCAGACGATGAGCACTACATCCCCCGGGCCGTGCTGCTGGACTTGGAACCCCGGGTGATCCACTCCATCCTCAACTCCCCCTATGCCAAGCTCTACAACCCAGAGAACATCTACCTGTCGGAACATGGAGGAGGAGCTGGCAACAACTGGGCCAGCGGATTCTCCCAGGGAGAAAAGATCCATGAGGACATTTTTGACATCATAGACCGGGAGGCAGATGGTAGTGACAGTCTAGAGGGCTTTGTGCTGTGTCACTCCATTGCTGGGGGGACAGGCTCTGGACTGGGTTCCTACCTCTTAGAACGGCTGAATGACAGGTATCCTAAGAAGCTGGTGCAGACATACTCAGTGTTTCCCAACCAGGACGAGATGAGCGATGTGGTGGTCCAGCCTTACAATTCACTCCTCACACTCAAGAGGCTGACGCAGAATGCAGACTGTGTGGTGGTGCTGGACAACACAGCCCTGAACCGGATTGCCACAGACCGCCTGCACATCCAGAACCCATCCTTCTCCCAGATCAACCAGCTGGTGTCTACCATCATGTCAGCCAGCACCACCACCCTGCGCTACCCTGGCTACATGAACAATGACCTCATCGGCCTCATCGCCTCGCTCATTCCCACCCCACGGCTCCACTTCCTCATGACCGGCTACACCCCTCTCACTACGGACCAGTCAGTGGCCAGCGTGAGGAAGACCACGGTCCTGGATGTCATGAGGCGGCTGCTGCAGCCCAAGAACGTGATGGTGTCCACAGGCCGAGACCGCCAGACCAACCACTGCTACATCGCCATCCTCAACATCATCCAGGGAGAGGTGGACCCCACCCAGGTCCACAAGAGCTTGCAGAGGATCCGGGAACGCAAGTTGGCCAACTTCATCCCGTGGGGCCCCGCCAGCATCCAGGTGGCCCTGTCGAGGAAGTCTCCCTACCTGCCCTCGGCCCACCGGGTCAGCGGGCTCATGATGGCCAACCACACCAGCATCTCCTCGCTCTTCGAGAGAACCTGTCGCCAGTATGACAAGCTGCGTAAGCGGGAGGCCTTCCTGGAGCAGTTCCGCAAGGAGGACATGTTCAAGGACAACTTTGATGAGATGGACACATCCAGGGAGATTGTGCAGCAGCTCATCGATGAGTACCATGCGGCCACACGGCCAGACTACATCTCCTGGGGCACCCAGGAGCAGGGATCCATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

SEQ ID NO:8H2A-mCherry的DNA序列

ATGTCGGGACGCGGCAAGCAGGGAGGCAAAGCTCGCGCCAAAGCCAAGACCCGCTCTTCTCGTGCCGGTCTCCAGTTCCCCGTGGGCCGAGTGCACCGACTGCTCCGCAAGGGCAACTATGCTGAGCGGGTCGGGGCCGGCGCGCCGGTGTACCTGGCGGCGGTGCTGGAGTACCTGACTGCCGAGATCCTGGAGCTGGCGGGCAACGCCGCCCGCGACAACAAGAAGACCCGCATTATCCCGCGCCACTTGCAGCTGGCCATCCGCAACGACGAGGAGCTCAACAAGCTGCTGGGCAAAGTAACCATCGCTCAGGGTGGTGTCCTGCCCAACATCCAGGCTGTGCTACTGCCCAAGAAGACCGAGAGTCACCACAAGGCCAAAGGCAAAAAGCTTGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

SEQ ID NO:9构建mCherry-MOF的上游引物

GCTGTACAAGAGGGGGTACCCGATGGCGGCACAGGGAGCT

SEQ ID NO:10构建mCherry-MOF的下游引物

CACACTGGACTAGTGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTG

SEQ ID NO:11构建GFP-PLK1的上游引物

CTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGCAGGG

SEQ ID NO:12构建GFP-PLK1的下游引物

GACTGCAGAATTCGAAGCTTTCAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTGGC

SEQ ID NO:13构建HA-MOF的上游引物

GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGGCGGCACAGGGAGC

SEQ ID NO:14构建HA-MOF的下游引物

ATCGATTGAATTCGGATCCCTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTGCT

SEQ ID NO:15构建Flag-PLK1的上游引物

CAAGGATGACGATGACAAGCTTATGAGTGCTGCAGTGACTGC

SEQ ID NO:16构建Flag-PLK1的下游引物

GAGATGAGTTTTTGTTCGGATCCGGAGGCCTTGAGACGGTTGCTG

SEQ ID NO:17构建His-MOF的上游引物

GACGACGACGACAAGCATATGATGGCGGCACAGGGAGC

SEQ ID NO:18构建His-MOF的下游引物

GGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTGCTTACTTCTTGGAGAGCTTGACTTGCT

SEQ ID NO:19构建GST-PLK1的上游引物

GGCCCCTGGGATCCCCGGAATTCATGAGTGCTGCAGTGACTGC

SEQ ID NO:20构建GST-PLK1的下游引物

GTCACGATGCGGCCGCTCGAGTTAGGAGGCCTTGAGACGGTTGCT

SEQ ID NO:21构建HA-MOF resist的上游引物

GAAGTCATTCAATCACGTGTCAACGACCAGGAGGGCCG

SEQ ID NO:22构建HA-MOF resist的下游引物

GTGATTGAATGACTTCAGCAGAATGCCAGGTGCTATCC

SEQ ID NO:23构建HA-MOF K274R resist的上游引物

GACCATCGCACACTGTACTTTGACGTGGAGCC

SEQ ID NO:24构建HA-MOF K274R resist的下游引物

ACAGTGTGCGATGGTCCAGGAAAAGCTTGGCCA

SEQ ID NO:25GFP的基因序列

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

SEQ ID NO:26mCherry的基因序列

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG

SEQ ID NO:27GST的氨基酸序列

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK

SEQ ID NO:28GST-PLK1的氨基酸序列

MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSPEFMSAAVTAGKLARAPADPGKAGVPGVAAPGAPAAAPPAKEIPEVLVDPRSRRRYVRGRFLGKGGFAKCFEISDADTKEVFAGKIVPKSLLLKPHQREKMSMEISIHRSLAHQHVVGFHGFFEDNDFVFVVLELCRRRSLLELHKRRKALTEPEARYYLRQIVLGCQYLHRNRVIHRDLKLGNLFLNEDLEVKIGDFGLATKVEYDGERKKTLCGTPNYIAPEVLSKKGHSFEVDVWSIGCIMYTLLVGKPPFETSCLKETYLRIKKNEYSIPKHINPVAASLIQKMLQTDPTARPTINELLNDEFFTSGYIPARLPITCLTIPPRFSIAPSSLDPSNRKPLTVLNKGLENPLPERPREKEEPVVRETGEVVDCHLSDMLQQLHSVNASKPSERGLVRQEEAEDPACIPIFWVSKWVDYSDKYGLGYQLCDNSVGVLFNDSTRLILYNDGDSLQYIERDGTESYLTVSSHPNSLMKKITLLKYFRNYMSEHLLKAGANITPREGDELARLPYLRTWFRTRSAIILHLSNGSVQINFFQDHTKLILCPLMAAVTYIDEKRDFRTYRLSLLEEYGCCKELASRLRYARTMVDKLLSSRSASNRLKAS

SEQ ID NO:29siControl的序列

UUCUCCGAACGUGUCACGU

参考文献

Chatterjee,A.,Seyfferth,J.,Lucci,J.,Gilsbach,R.,Preissl,S.,Bottinger,L.,Martensson,C.U.,Panhale,A.,Stehle,T.,Kretz,O.,et al.(2016).MOF AcetylTransferase Regulates Transcription and Respiration in Mitochondria.Cell 167,722-738e723.

Chen,C.,Xu,Z.,Zhang,T.,Lin,L.,Lu,M.,Xie,C.,and Yu,X.(2019).Cep85Relays Plk1 Activity to Phosphorylated Nek2Afor Its Timely Activation inCentrosome Disjunction.iScience 11,114-133.

Fullgrabe,J.,Lynch-Day,M.A.,Heldring,N.,Li,W.,Struijk,R.B.,Ma,Q.,Hermanson,O.,Rosenfeld,M.G.,Klionsky,D.J.,and Joseph,B.(2013).The histone H4lysine 16acetyltransferase hMOF regulates the outcome of autophagy.Nature500,468-471.

Ghenoiu,C.,Wheelock,M.S.,and Funabiki,H.(2013).Autoinhibition andPolo-dependent multisite phosphorylation restrict activity of the histone H3kinase Haspin to mitosis.Mol Cell 52,734-745.

Jamasbi,E.,Hamelian,M.,Hossain,M.A.,and Varmira,K.(2022).The cellcycle,cancer development and therapy.Mol Biol Rep 49,10875-10883.

Jang,Y.J.,Kim,Y.S.,and Kim,W.H.(2006).Oncogenic effect of Polo-likekinase 1expression in human gastric carcinomas.Int J Oncol 29,589-594.

Li,X.,Li,L.,Pandey,R.,Byun,J.S.,Gardner,K.,Qin,Z.,and Dou,Y.(2012).The histone acetyltransferase MOF is a key regulator of the embryonic stemcell core transcriptional network.Cell Stem Cell 11,163-178.

Qi,F.,Chen,Q.,Chen,H.,Yan,H.,Chen,B.,Xiang,X.,Liang,C.,Yi,Q.,Zhang,M.,Cheng,H.,et al.(2018).WAC Promotes Polo-like Kinase 1Activation for TimelyMitotic Entry.Cell Rep 24,546-556.

Seki,A.,Coppinger,J.A.,Jang,C.Y.,Yates,J.R.,and Fang,G.(2008).Boraand the kinase Aurora a cooperatively activate the kinase Plk1 andcontrolmitotic entry.Science 320,1655-1658.

Sharma,G.G.,So,S.,Gupta,A.,Kumar,R.,Cayrou,C.,Avvakumov,N.,Bhadra,U.,Pandita,R.K.,Porteus,M.H.,Chen,D.J.,et al.(2010).MOF andhistone H4acetylation at lysine 16 are critical for DNA damage response anddouble-strand break repair.Mol Cell Biol 30,3582-3595.

Shevelyov,Y.Y.,Ulianov,S.V.,Gelfand,M.S.,Belyakin,S.N.,and Razin,S.V.(2022).Dosage Compensation in Drosophila:Its Canonical andNon-CanonicalMechanisms.Int J Mol Sci 23.

Suijkerbuijk,S.J.,Vleugel,M.,Teixeira,A.,and Kops,G.J.(2012).Integration of kinase and phosphatase activities by BUBR1 ensuresformationof stable kinetochore-microtubule attachments.Dev Cell 23,745-755.

Wang,B.,Huang,X.,Liang,H.,Yang,H.,Guo,Z.,Ai,M.,Zhang,J.,Khan,M.,Tian,Y.,Sun,Q.,et al.(2021).PLK1 Inhibition Sensitizes BreastCancer Cells toRadiation via Suppressing Autophagy.Int J Radiat Oncol BiolPhys 110,1234-1247.

Yang,X.,Chen,G.,Li,W.,Peng,C.,Zhu,Y.,Yang,X.,Li,T.,Cao,C.,and Pei,H.(2017).Cervical Cancer Growth Is Regulated by a c-ABL-PLK1SignalingAxis.Cancer Res 77,1142-1154.