一种骨多肽提取液的制备方法

技术领域

本发明涉及一种骨多肽提取液的制备方法。

背景技术

畜骨蛋白是较为全价的可溶性蛋白质，生物学效价高。畜骨是一种天然复杂的有机体，主要包括骨基质(胶原与胶原蛋白)和骨矿物质(羟基磷酸钙与羟基磷酸镁)。其中胶原蛋白是动物结缔组织(骨、软骨、皮肤、腱、韧等)的主要成分，在脊椎动物中约占总蛋白质的1/3左右，性质较稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解。目前对畜骨蛋白质的利用从加工方式来分：一方面是通过将畜骨加工成粉、浆或是糊状加以利用；另一方面是通过一定的提取工艺将畜骨中的蛋白质提取出来加以利用。

畜骨中的蛋白质提取过程一般为：畜骨粉碎后经洗涤脱脂，加酸去杂，浸泡熬煮，浓缩成胶冻状的物质。骨胶的主要成分就是骨蛋白，它被广泛应用于医药和食品工业中。利用畜骨蛋白质酶水解得到的水解产物具有很多活性功能，如抗氧化、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松等。

骨瓜多肽提取物是将猪、牛或鹿骨提取物、甜瓜子提取物混合制成的产品，其中含有多种活性多肽和游离氨基酸，具有调节骨代谢，剌激成骨细胞增殖，促进新骨形成，调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松等作用。现有骨瓜多肽提取物主要有注射制剂和口服制剂，但提取物中含有大分子量的多肽，影响活性物质的消化吸收。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有骨多肽提取液中小分子多肽含量较低的问题，而提供一种骨多肽提取液的制备方法。

本发明骨多肽提取液的制备方法按照以下步骤实现：

一、剔除动物肢骨上的残肉，断开肢骨去脂，用水冲洗后粉碎成骨粉，将骨粉加入到纯水中，在100～120℃、0.1～0.3MPa的条件下热压处理，冷却后得到骨粉混合液；

二、调节骨粉混合液的pH＝1.5～3.0，加入胃蛋白酶，在35℃～40℃的温度下酶解1.5～2h，灭酶冷却后，离心分离处理，分别收集酶解沉淀物和上清液；

三、调节上清液的pH＝3.5～4.5，在3℃～6℃的温度下静置15～24h，过滤后收集一次滤液；

四、调节一次滤液的pH＝8～9，在3℃～6℃的温度下静置15～24h，过滤后收集二次滤液；

五、将步骤二得到的酶解沉淀物和纯水混合，在100～120℃、0.1～0.3MPa的条件下热压处理，冷却后加入中性蛋白酶，在45℃～55℃的温度下酶解处理1.5～2.5h，灭酶冷却后，收集酶解清液；

六、将二次滤液和酶解清液混合，调节混合液的pH＝8～9，加入碱性蛋白酶，在50℃～60℃的温度下酶解1～2h，灭酶冷却后，离心收集提取液；

七、采用截留分子量为3～5KDa的滤膜对提取液进行超滤处理，得到骨多肽提取液；

其中步骤二中控制酶底比为2000～2500U/g；步骤五中控制酶底比为4000～4500U/g。

本发明骨多肽提取液的应用是将该骨多肽提取液和甜瓜籽多肽提取液混合，制备骨瓜提取液。本发明骨多肽提取液也可作为口服保健食品。

本发明调节骨粉混合液为酸性环境，在酸性体系下使骨粉中的钙溶出，加入胃蛋白酶，利用胃蛋白酶对骨粉混合液初步水解，初步水解过程中需要控制酶解时间，以避免过度水解，胃蛋白酶酶解处理后分别收集酶解沉淀物和上清液，上清液依次经过酸沉淀和碱沉淀以析出蛋白质，而酶解沉淀物再经过中性蛋白酶进行深度水解，中性蛋白酶作为微生物蛋白酶，酶活性适中，对酶解沉淀物进行水解，进一步增加水溶性多肽的含量，最后将二次滤液和酶解清液混合，采用碱性蛋白酶对水溶性多肽再进行酶切，提高小分子多肽的含量，小分子多肽提高人体对氨基酸的吸收速度，提高消化吸收率。

本发明骨多肽提取液的制备方法反应条件温和、工艺时间短、无污染，利用多种蛋白酶分别对沉淀物和上清液进行酶解处理，提高提取液中低分子量多肽的含量，产品性质稳定，消化吸收性高。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式骨多肽提取液的制备方法按照以下步骤实施：

一、剔除动物肢骨上的残肉，断开肢骨去脂，用水冲洗后粉碎成骨粉，将骨粉加入到纯水中，在100～120℃、0.1～0.3MPa的条件下热压处理，冷却后得到骨粉混合液；

二、调节骨粉混合液的pH＝1.5～3.0，加入胃蛋白酶，在35℃～40℃的温度下酶解1.5～2h，灭酶冷却后，离心分离处理，分别收集酶解沉淀物和上清液；

三、调节上清液的pH＝3.5～4.5，在3℃～6℃的温度下静置15～24h，过滤后收集一次滤液；

四、调节一次滤液的pH＝8～9，在3℃～6℃的温度下静置15～24h，过滤后收集二次滤液；

五、将步骤二得到的酶解沉淀物和纯水混合，在100～120℃、0.1～0.3MPa的条件下热压处理，冷却后加入中性蛋白酶，在45℃～55℃的温度下酶解处理1.5～2.5h，灭酶冷却后，收集酶解清液；

六、将二次滤液和酶解清液混合，调节混合液的pH＝8～9，加入碱性蛋白酶，在50℃～60℃的温度下酶解1～2h，灭酶冷却后，离心收集提取液；

七、采用截留分子量为3～5KDa的滤膜对提取液进行超滤处理，得到骨多肽提取液；

其中步骤二中控制酶底比为2000～2500U/g；步骤五中控制酶底比为4000～4500U/g。

本实施方式步骤六中测定混合液中蛋白质及多肽的含量，碱性蛋白酶的加入量占蛋白质及多肽的含量的10％～15％。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中所述的动物肢骨为猪肢骨或者牛肢骨。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中热压处理时间为2～3h。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二中在40℃的温度下酶解1.5h。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤三中通过浓度为2mol/L的HCl调节上清液的pH，步骤四中通过浓度为5mol/L的NaOH调节一次滤液的pH。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤三中在3℃～4℃的温度下静置16h。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤五中在50℃的温度下再酶解处理2h。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤六中在50℃的温度下酶解1.5h。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤六中采用截留分子量为5KDa的滤膜。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是所述的灭酶是以100℃灭酶处理10min。

实施例一：本实施例骨多肽提取液的制备方法按照以下步骤实施：

一、剔除猪肢骨上的残肉，断开肢骨去脂，用水冲洗后粉碎成骨粉，将骨粉加入到纯水中，在120℃、0.2MPa的条件下热压处理2h，冷却后得到骨粉混合液；

二、调节骨粉混合液的pH＝2.5，加入胃蛋白酶，在40℃的温度下水浴酶解1.5h，灭酶冷却后，离心分离处理，分别收集酶解沉淀物和上清液；

三、调节上清液的pH＝3.5，在4℃的温度下静置16h，过滤后收集一次滤液；

四、调节一次滤液的pH＝8.5，在4℃的温度下静置16h，过滤后收集二次滤液；

五、将步骤二得到的酶解沉淀物和纯水混合，在120℃、0.2MPa的条件下热压处理，冷却后体系的pH＝7，加入中性蛋白酶，在50℃的温度下水浴酶解处理2h，灭酶冷却后，收集酶解清液；

六、将二次滤液和酶解清液混合，调节混合液的pH＝9.0，加入碱性蛋白酶，在55℃的温度下水浴酶解1.5h，灭酶冷却后，离心收集提取液；

七、采用截留分子量为5KDa的滤膜对提取液进行超滤处理，得到骨多肽提取液；

其中步骤二中控制酶底比为2500U/g；步骤五中控制酶底比为4600U/g。

本实施例步骤一中骨粉的粒径为300～600微米。

本实施例步骤六中先测定混合液中蛋白质及多肽的含量，碱性蛋白酶的加入量占蛋白质及多肽的含量的10％。

(一)采用高效液相色谱仪对骨多肽提取液中的多肽分子质量分布进行测试，色谱柱的流动相中乙腈的体积浓度为40％，水的体积浓度为60％，流速为每分钟0.5mL。

骨多肽提取液中分子质量在600D～1.2KD区间的多肽占多肽物总质量的50％～60％，分子质量在1.2D～2KD区间的多肽占多肽物总质量的15％～20％，分子质量在600D以下的多肽占多肽物总质量的10％～25％。可知本实施例通过多种酶处理得到的骨多肽提取液中以低分子量多肽为主，低分子量多肽更利于消化吸收。

(二)稳定性测试：

将本实施例得到的骨多肽提取液在高温(50℃)和低温(5℃)条件下各放置30天，骨多肽提取液中的多肽含量、颜色密度均无变化，说明该骨多肽提取液的稳定性良好。

(三)制备口服骨瓜提取物多肽组合物

按照公开号为CN107595924，专利名称为《一种骨瓜提取物注射液制备方法及相应的药物组合物》中公开的方法制备甜瓜籽多肽提取液。

按照骨多肽提取液中的多肽与甜瓜籽多肽提取液中的多肽质量比为4∶1混合，然后加入乳酸钙，乳酸钙为骨瓜混合液的3wt％最后加入乳糖，得到口服骨瓜提取物多肽组合物。

软骨细胞增殖细胞因子的测试实验：

空白组：20只四肢活动正常的大鼠，用ELISA法检测关节液中IL-1β细胞因子的含量，IL-1β平均含量为58.3±5.3pg/ml。

实验组：20只大鼠膝关节注射4％木瓜蛋白酶形成膝骨关节炎模型，实验组大鼠关节肿胀，关节液呈淡黄色、粘稠状，关节液中IL-1β细胞因子的平均含量为125.6±12.5pg/ml。实验组给予甜瓜籽多肽提取液。剂量为0.02kg/d/只大鼠，每日3次，实验30天，30天后实验组大鼠的IL-1β的平均含量降低至67.5±10.3pg/ml。

可知经过骨瓜提取物多肽组合物口服治疗后，能够明显降低大鼠关节液IL-1β细胞因子的水平。