一种应用于mNGS法检测病原微生物的去人源宿主试剂盒

技术领域

本申请涉及基因测序领域，具体地，涉及一种应用于mNGS法检测病原微生物的去人源宿主试剂盒。

背景技术

病原微生物感染是全球威胁人类健康的主要原因之一。对于感染性疾病，能否及时、有效的明确致病微生物，是临床抗生素合理用药、感染性疾病的流行性病原学监督与管理、控制感染传播的核心。目前，微生物感染在临床诊疗中的主要问题是不能及时准确的发现病原微生物以及经验性用药。感染性疾病相似的临床特征表现、复杂病原微生物以及免疫抑制宿主的增加，使微生物感染的临床治疗形势越来越严峻。因此，能否快速、准确的找出微生物感染的病原体成了目前感染性疾病治疗方面所面临的首要问题，它对于精准用药、缩短患者住院时间、减少住院费用、降低严重并发症及死亡发生率都发挥着举足轻重的作用。

目前，临床常规病原学诊断方法主要有培养法、镜检法、PCR法、免疫学法(包括荧光法、ELISA法、层析法)、质谱法等。培养法作为临床公认的病原微生物检验的“金标准”，可适应较大样本体积、价格低廉，但是检测敏感度受限于培养时抗生素的使用，检测范围无法覆盖所有微生物及病毒，操作复杂、检测周期长且阳性率低，不适于临床广泛应用。镜检法，优势在于具有快速性、低成本，可检测多种微生物类型，包括细菌、真菌、寄生虫和病毒等，临床上适于初步鉴定。但检测结果易受到样本质量与操作者技能和经验的影响，对于数量较少的微生物可导致假阴性结果，仅能检测可观察的微生物。一代PCR法流程简单、快速、价格低，且可定量检测、准确性高，但是主观假设较强，仅能检测已知的微生物，扩增引物可靠性不稳定、只能检测微生物基因组的个别片段。免疫学法检测周期短，仅需1-3天，价格便宜，操作简单，检测范围包括支原体、衣原体、病毒等，但是敏感性和特异性差，并不是所有病原微生物都有相应抗体，存在窗口期，假阳性率高。质谱法流程简单、特异性强、准确性高，可进行高通量分析，但是需要基于已培养的阳性菌落，依赖培养法，且仅能检测细菌和真菌约1000种已知微生物，部分微生物不能鉴定到种，只能定性不能定量。因此，寻找新兴的、更快速、更灵敏和更准确的病原学检测技术成为临床诊断的核心环节。

高通量测序技术(next generation sequencing，NGS)以高输出量和高解析度为主要特色，其在病原微生物检测中的应用越来越普遍，可同时对数百万甚至数千万个感染性疾病病原体的DNA/RNA基因组进行序列读取，特别是在未知病原体引起疾病的情况下能够对病原微生物进行高通量测序，快速而精准地区分和鉴定病原微生物，从而指导临床用药和预后评估。其中，NGS技术中的宏基因组测序技术(metagenomics next generationsequencing，mNGS)可以有效地检测复杂微生物群落中的病原微生物，以起到感染病原初筛及用药指导的作用。随着创新分子检测技术在临床转化及应用，mNGS因具有耗时短、检测范围广且能提高病原微生物的检出率，受到临床检验的广泛关注。mNGS相关应用规范及专家共识的相继出台，也推荐mNGS方法对感染性疾病的诊断。

无论使用何种测序技术，都需要从所采集的样本中去除人源宿主，同时避免损伤病原体遗传物质，从而在测序时获得更多的病原体序列。目前常用的去宿主方法通过差异裂解法，先去除人源细胞DNA，再将病原微生物细胞进行DNA提取。常用的去宿主试剂组分过多，成分复杂，配制过程容易引入更多的外源DNA，高浓度的盐离子对病原微生物也会造成损伤。处理的温度过高或时间过长，会造成目标病原微生物的DNA破坏，反之，会导致去宿主不充分。

人源细胞较多的肺泡灌洗液和痰液样本，试剂与样本无法充分接触，需要实施样本液化。目前常用的液化方法有：(1)使用NaOH溶液，反应剧烈，对核酸破坏较大；(2)酶解法反应时间较长，且无差别酶解，导致部分病原微生物被裂解而去除，影响病原微生物核酸的提取效率；(3)用二硫苏糖醇(DTT)作为反应还原剂，但反应效率低，样本液化效果差，且DTT稳定性较差，不利于长期保存，配制耗时较长。

发明内容

本申请提出了一种去人源宿主试剂盒，包括去宿主试剂，所述去宿主试剂含有体积浓度2.5％的聚乙二醇辛基苯基醚和质量浓度5％的皂素。

作为优选，所述试剂盒还包括消化缓冲液，所述消化缓冲液含有0.8M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15-0.17M氯化镁和0.1M二硫苏糖醇。其中氯化镁溶液浓度可以进一步优选为0.16M。所述消化缓冲液的体积为所述去宿主试剂的8-10倍。

作为优选，所述试剂盒还包括DNase I酶。

作为另一种优选，所述试剂盒还包括样本液化试剂，所述样本液化试剂为0.5％胰蛋白酶溶液。

作为优选的一种实施方式，所述试剂盒中包括一个或多个基础套装，每个基础套装含有30μL去宿主试剂，330μL消化缓冲液，9U的DNase I酶。

本申请还提供一种去除人源宿主的方法，包括以下步骤：

步骤1，液化待测样本，液化完成后，离心收集沉淀；

步骤2，PBS重悬沉淀，加入去宿主试剂、消化缓冲液和DNase I酶，所述去宿主试剂含有体积浓度2.5％的聚乙二醇辛基苯基醚和质量浓度5％的皂素，所述消化缓冲液含有0.8M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15-0.17M氯化镁和0.1M二硫苏糖醇。其中氯化镁溶液浓度可以进一步优选为0.16M。所述消化缓冲液的体积为所述去宿主试剂的8-10倍，混匀后于37℃孵育；

步骤3，加热至80℃保温1min，冷却至室温，离心，弃上清。

作为优选，所述步骤1中，使用所述待测样本对于每400-600μL的样本，使用750μL的0.5％胰蛋白酶溶液，在37℃下液化20min，完成待测样本的液化。

作为优选，所述步骤2中试剂的用量为，所述步骤2中试剂的用量为，对于每400-600μL的样本，使用0.03mL的去宿主试剂，0.33mL的消化缓冲液和9U的DNase I酶。

作为优选，所述步骤2中37℃孵育时间为20min。

本申请还提供所述的试剂盒的用途，所述用途为在mNGS法检测微生物病原体中去除人源宿主。

本申请中的样本，为医院检测病原微生物时采样的样本，根据感染部位的不同，可以为痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、尿液等。

本申请中的Triton X-100为聚乙二醇辛基苯基醚，Saponin为皂素，Tris-HCl为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，DTT为二硫苏糖醇，均有市售试剂。本申请中的试剂，如无特别说明，均使用市售试剂。本申请中的溶液，胰蛋白酶溶液使用PBS作为溶剂，其他溶液如无特别说明，溶剂为去核酸水。

本申请对体积、时间、浓度等参数进行限定的数值，并不局限于特定的点值，如四舍五入后与本申请数值相同的，应视为落入本申请保护范围。例如，2.5％实质上涵盖了≥2.45％且＜2.55％的范围，5％则实质上涵盖了≥4.5％且＜5.5％的范围。

本申请中表示单位的M，含义为mol/L，mM含义为mmol/L，即10

本申请技术方案的优点在于，通过人源宿主的去除，提高病原微生物基因组在样本总基因组中的比例。提高目的病原微生物的检出，保障检测结果的准确性，为临床医生快速诊断感染性疾病提供有效依据。

在一种优选的实施方式中，通过改进样本液化处理试剂和方法，使得样本中病原微生物得到分散，有利于后续的消化。

在另一种优选的实施方式中，通过对现有的去宿主试剂进行调整，减少试剂的组分以避免引入更多的外源DNA，避免高浓度的盐离子的使用对样本核酸的损伤，调整各组份的用量及比例，优化DNase消化酶用量，优化人源宿主去除效果。

在另一种优选的实施方式中，通过优化人源宿主去除处理温度，避免去宿主方法的处理温度过高，会造成目标病原微生物的DNA破坏；同时也避免去宿主的温度过低，会导致去宿主不充分。

在另一种优选的实施方式中，通过优化人源宿主去除处理时间，避免去宿主方法的处理时间过长，会造成目标病原微生物的DNA破坏；同时也避免去宿主的时间过短，会导致去宿主不充分。

具体实施方式

为了更好地理解本申请，将对本申请的技术方案做出更详细的说明。应理解，这些详细说明只是对本申请的示例性实施方式的描述，而非旨在以任何方式限制本申请的范围。在说明书全文中，表述“和/或”包括相关联的所列项目中的一个或多个项目的任何组合或全部组合。

如在本文中使用的，用语“大致”“大约”以及类似的用语用作表近似的用语，而不用作表程度的用语，并且旨在说明将由本领域普通技术人员认识到的测量值或计算值中的固有偏差。

还应理解的是，诸如“包括”“包括有”“具有”“包含”和/或“包含有”等表述在本说明书中是开放性而非封闭性的表述，其表示存在所陈述的特征、元件和/或部件，但不排除一个或多个其它特征、元件、部件和/或它们的组合的存在。此外，当诸如“...中的至少一个”的表述出现在所列特征的列表之后时，其修饰整列特征，而非仅仅修饰列表中的单个特征。此外，当描述本申请的实施方式时，使用“可”表示“本申请的一个或多个实施方式”。并且，措辞“示例性的”旨在指代示例或举例说明。

除非另外限定，否则本文中使用的所有措辞(包括工程术语和科技术语)均具有与本申请所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。还应理解的是，除非本申请中有明确的说明，否则在常用词典中定义的词语应被解释为具有与它们在相关技术的上下文中的含义一致的含义，而不应以理想化或过于形式化的意义解释。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施方式及实施例中的特征可以相互组合。另外，除非明确限定或与上下文相矛盾，否则本申请所记载的方法中包含的具体步骤不必限于所记载的顺序，而可以任意顺序执行或并行地执行。下面将结合实施方式来详细说明本申请。

实施例1，试剂盒的准备。

制备包含以下试剂的基础套装。

(1)30μL去宿主试剂(2.5％聚乙二醇辛基苯基醚+5％皂素)；

(2)330μL消化缓冲液(消化缓冲液：800mM Tris-HCl、160mM MgCl

(3)9U的DNase I酶。

制备含有单个基础套装的小型试剂盒。

制备含有50个基础套装的大型试剂盒。

每个基础套装中，还可以包含750μL的0.5％胰蛋白酶溶液。

实施例2，使用实施例1试剂盒，基于mNGS法检测病原体微生物。

本实施例和后续对比例中待测样本来自广东省某医院收治并经病理证实的12名病原初筛患者的临床阳性样本(4例肺泡灌洗液、4例痰液和4例脑脊液)，分别已检测出目标病原微生物鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肺炎链球菌、新生隐球菌、人腺病毒B型、鹦鹉热衣原体；金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、粘质沙雷氏菌、新生隐球菌、人类疱疹病毒1型(HSV1)、肺炎支原体；肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、热带念珠菌、BK多瘤病毒、沙眼衣原体；星座链球菌、无乳链球菌、大肠埃希菌、烟曲霉、人类疱疹病毒2型、恙虫病东方体；以高通量测序技术分析待测样本中病原微生物的检测结果，以评估本申请技术方案的技术效果。

1.样本液化处理：

将3例临床样本分别取500μL，加入到作好标记的2mL离心管中，加入750μL 0.5％胰蛋白酶试剂，振荡混匀，37℃孵育，反应时间20min；使2mL离心管中混合液体呈透明澄清，且吸打无拉丝状粘稠状态，液化完成后，12000rpm离心5min收集沉淀。

2.人源宿主去除：

2.1往沉淀加入300μL PBS，吹打混匀；

2.2加入30μL去宿主试剂，本实施例直接使用实施例1试剂盒，也可以使用市售的Triton X-100和Saponin试剂配制去宿主试剂，还可以使用聚乙二醇辛基苯基醚和皂素直接配制；

2.3加入330μL消化缓冲液；

2.4加入9U DNase I酶，充分混匀，于37℃孵育20min；

2.5加热至80℃保温1min，冷却至室温，12000rpm离心2min，弃上清。

3.样本物理破壁。

3.1往沉淀加入400μL PBS，吹打混匀；

3.2天根1mm氧化锆珠；不加溶壁酶；研磨物理破壁；

3.3调节离心机转速，8000rpm离心1min，转移上清至新的1.5ml离心管，进行提取；

4.核酸提取：

4.1往离心管中分别加入200μL Buffer GA+200μL Buffer GB+20μL PK，56℃孵育10min；

4.2短暂离心，加入500μL无水乙醇，摇匀后室温静置5min；

4.3将所有液体过柱，12000rpm，离心1min；

4.4加入500μL Buffer GD，12000rpm离心1min，弃废液；

4.5加入600μL Buffer PW，12000rpm离心1min，弃废液；

4.6重复操作(4.5)一次；

4.7调节离心机转速，12000rpm离心2min，弃废液，室温干燥5min；

4.8将吸附柱转干净的1.5ml离心管，加25μL Buffer TE，室温放置5min；

4.9调节离心机转速，12000rpm离心2min收集核酸。

5.片段化及末端修复：

5.1根据提取的核酸Qubit浓度，以投入量100ng为标准，每个样本分别取样至0.2μL PCR管；

按照表1和表2中的条件进行片段化及末端修复。

表1片段化及末端修复反应体系

表2片段化及末端修复反应条件

5.2按照表3和表4中的条件进行接头连接。

表3接头连接反应体系

表4接头连接反应条件

5.3接头连接产物纯化：

加入80μL(0.8X)XP beads进行纯化，加入22μL水进行洗脱，吸20μL上清进行下一步反应。

5.4按照表5和表6中的条件进行文库扩增。

表5文库扩增反应体系

表6文库扩增反应条件

5.5文库扩增产物纯化。

加入45μL(0.9X)XP beads进行纯化，加入22μL TE进行洗脱，吸20μL上清。

5.6Qubit4.0测定文库浓度：

文库制备产物检测：文库制备完成后，进行Agilent 2100检测，合格文库主峰片段为300bp，无接头及大片段污染，且文库浓度>1ng/μL。

6.高通量测序。

利用基于滚环扩增原理的高通量测序平台对合格的测序文库进行测序，将测序文库稀释至等物质的量比等于目标数据量比，然后经转化、环化以及DNB制备，经滚环扩增将每个环状单链DNA分子富集成为一个DNB，使用MGISEQ-200测序，测序模式为插入片段加双barcode测序。

7.数据分析。

测序数据使用fastqc去除低质量及过短序列；过滤后剩余序列使用blast与病原微生物数据库比对分析，并对分析结果进行解读。

为说明本申请技术方案的优越效果，设置对比试验1-4。因样本量有限，对比试验中的本申请方案，为本申请实施例2；对比方案中除专门作说明的区别外，其余试剂和操作均按照本申请实施例2进行。因医院送检的样本含量有限，因此，不同对比试验使用的样本不同。

对比试验1，去人源试剂组分的优化。

方案1：5％ Triton X-100、10％ Saponin、15U DNase I、1000mM Tris-HCl、320mMMgCl

方案2：4％ Triton X-100、8％ Saponin、12U DNase I、900mM Tris-HCl、240mMMgCl

方案3：1％ Triton X-100、2.5％ Saponin、3U DNase I、500mM Tris-HCl、80mMMgCl

与方案1-3相比较，本申请方案(2.5％ Triton X-100、5％ Saponin、9U DNase I、800mM Tris-HCl、160mM MgCl

表7：去人源试剂对检测结果的影响(仅列出样本中主要病原体)

对比试验2，去除人源宿主处理温度的影响。

与现有常见的处理温度方案1(30℃)、方案2(56℃)相比较，本申请方案(37℃)对人源宿主去除处理温度进行优化后，可使人源宿主去除效果达到最佳，同时在最适处理温度下，有效避免目标病原微生物核酸的破坏，不同方案处理后，三例临床样本的检出效果进行比较，本申请方案中的金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、粘质沙雷氏菌、新生隐球菌、人类疱疹病毒1型(HSV1)、肺炎支原体这六种病原微生物检出结果均为最佳。六种病原微生物检出结果如下表8。

表8：去除人源宿主处理温度对检出结果的影响(仅列出样本中主要病原体)

对比试验3，去除人源宿主处理时间的优化。

与现有常见的处理时间方案1(10min)、方案2(15min)、方案3(25min)相比较，本申请方案(20min)对人源宿主去除处理时间进行优化后，可使人源宿主去除效果达到最佳，同时在最适处理时间下，有效避免目标病原微生物核酸的破坏，优化后三例临床样本的检出效果进行比较，不同方案处理后，三例临床样本的检出效果进行比较，本申请方案中的肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、热带念珠菌、BK多瘤病毒、沙眼衣原体这六种病原微生物检出结果均为最佳。六种病原微生物检出结果如下表9。

表9：去除人源宿主处理时间对检出结果的影响(仅列出样本中主要病原体)

对比试验4，样本液化处理对检出结果的影响。

方案1：1％胰蛋白酶、液化处理10min、液化温度30℃，参见《一种痰液液化及核酸保护试剂》CN108949748A实施例1；

方案2：0.1％胰蛋白酶、液化处理30min、液化温度56℃，参见《胰蛋白酶消化液、制备方法及即用型痰消化装置》CN104531659A实施例1；

方案3：DTT、液化处理20min、液化温度37℃，参见《一种痰液液化试剂、含有其的试剂盒及其应用》CN108414313A权利要求3；

方案4：NaOH、液化处理20min、液化温度37℃，参见《一种痰液自动液化仪及其痰液液化方法》CN105571930A权利要求3。

与方案1-4相比较，本申请方案(0.5％胰蛋白酶、液化处理20min、液化温度37℃)使用胰蛋白酶进行样本液化处理的优化后，液化时间得到优化，液化处理温度得到优化，反应过程较为温和，液化效果较佳，对目标病原微生物的检出更为有利；不同方案处理后，三例临床样本的检出效果进行比较，本申请方案中的星座链球菌、无乳链球菌、大肠埃希菌、烟曲霉、人类疱疹病毒2型、恙虫病东方体这六种病原微生物检出结果均为最佳。六种病原微生物检出结果如下表10。

表10：液化条件对病原微生物检出结果的影响(仅列出样本中主要病原体)

以上描述仅为本申请的实施方式以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的保护范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离所述技术构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。