一种柠檬酸酯琼脂的制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及琼脂领域，尤其涉及一种柠檬酸酯琼脂的制备方法及其用途。

背景技术

琼脂，又称琼胶、冻粉，是一种从海洋红藻(主要是江蓠菜属与石花菜属)细胞壁基质中提取出的多糖类物质。琼脂是一种以半乳糖为基本组成单位的多糖聚合物，主要由硫琼脂与琼脂糖两部分组成。由于无毒且具有优良的凝胶性能、稳定性能与增稠性能，琼脂被作为胶凝剂、稳定剂、分散悬浮剂广泛的应用于食品行业；由于其具有滞后性、抗细菌酶降解、抗剪切力等性质，在制药、化妆品、组织工程等领域有着重要的应用；此外，由于琼脂具有良好的成膜性、可降解性，近年来也被用作薄膜与胶囊的优质原料。

然而作为主要应用的海藻胶之一，琼脂粘度高、水溶性低、生物利用度低的特点，极大限制了琼脂的高附加值应用范围。为突破其在商业领域的局限性，人们往往通过生物改性、物理改性与化学改性的方法对琼脂的性能进行改善。Ye等人采用马来酸酐改性琼脂，成功提高了琼脂的透明度，然而根据最新一版食品添加剂使用标准GB 2760-2014，马来酸酐不允许被添加在食品中。另外目前的琼脂需要加热使溶解后才能在乳液中使用。

发明内容

基于此，为有效提高反应活性，本发明采用螺杆挤压的手段对琼脂进行处理使其暴露更多活性位点，并以琼脂柠檬酸作为酯化剂制备柠檬酸酯化琼脂，使其疏水性有效提高。并用柠檬酸酯化琼脂制备了具有广泛pH耐受的琼脂基乳液凝胶与热可逆琼脂基乳液凝胶，有效拓宽了琼脂的应用范围。

本发明提供一种柠檬酸酯琼脂的制备方法，其特征在于，将琼脂经过一次机械活化后与柠檬酸反应得到柠檬酸酯琼脂，包括以下步骤：

A1.将琼脂进行螺杆挤压处理得到螺杆挤压琼脂粉；

A2.将柠檬酸溶解在去离子水中，调节溶液pH值后加入螺杆挤压琼脂粉；

A3.静置过夜后干燥；

A4.高温固相酯化，水洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。

进一步，所述A1中，螺杆挤压条件为加工温度110-130℃，水料比为1：10-2：5，螺杆转速100 -200rpm/min，出料压力2-6Mpa；

任选的，柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1：20-1：4。

进一步，所述A2中，溶液的pH值为3.5-5.5。

进一步，所述A3中，干燥温度为35-40℃，干燥时间为36-48h。

进一步，所述A4中，酯化温度为100-130℃，酯化时间为1h-6h。

本发明还保护所述制备方法制备得到的柠檬酸酯琼脂。

本发明还保护所述柠檬酸酯琼脂在乳液中的应用。

进一步，包括如下步骤，

B1.配置酯化琼脂溶液，冰浴冷却形成凝胶后加入去离子水，进行高速剪切，得到凝胶悬浮液；

B2.调节凝胶悬浮液的pH,与油相混合高速剪切混合后高压均质后得到pH稳定乳液或热可逆乳液凝胶。

进一步，所述B1中，酯化琼脂溶液的重量百分浓度为2％-5％，

任选的，去离子水与凝胶悬浮液重量比例为4：1-10：3；

任选的，使用高速剪切机10000-32000rpm下处理3～7min。

进一步，所述B2中，凝胶悬浮液的pH为3-11，凝胶悬浮液质量与油相质量比为9：1-3：2；

任选的，油相为大豆油、菜籽油、玉米油中的任意一种；

任选的，高速剪切转速为8000-30000rpm，处理时间为1-3min；高压均质压力为2-5Mpa，高压均质循环次数为1-3次，得到pH稳定乳液；

或者高速剪切转速为8000-30000rpm，处理时间为3-5min。高压均质压力为8-15Mpa，高压均质循环次数为3-6次，得到热可逆乳液凝胶。

发明人验证了按照本发明的处理方法琼脂进行了酯化，也对酯化前后琼脂进行了对比，酯化后的琼脂应用于油相可制备稳定的乳液，且稳定性能保持30天。包封率，留存率均明显高于未酯化琼脂。

附图说明

图1是不同柠檬酸添加量对柠檬酸酯化琼脂性能的影响图。

图2是添加不同pH值柠檬酸对柠檬酸酯化琼脂性能的影响图。

图3是不同高温酯化反应温度对柠檬酸酯化琼脂性能的影响图。

图4是不同高温酯化反应时间对柠檬酸酯化琼脂性能的影响图。

图5是反应不同时间的柠檬酸酯化琼脂的红外光谱图。

图6是对比例2的结果图。其中(A

图7的(A)琼脂与不同取代度柠檬酸酯化琼脂基乳液贮藏稳定性；(B)琼脂与DS＝0.145的柠檬酸酯化琼脂基乳液在不同pH条件下的贮藏稳定性。

图8的(A)琼脂与不同取代度柠檬酸酯化琼脂基乳液离心稳定性；(B)琼脂与DS＝0.145的柠檬酸酯化琼脂基乳液在不同pH条件下的离心稳定性。

图9的(A)琼脂与不同取代度柠檬酸酯化琼脂基乳液乳化活性；(B)琼脂与DS＝0.145的柠檬酸酯化琼脂基乳液在不同pH条件下的乳化活性。

图10是实施例8和对比例5的效果对比图。

图11是实施例9和对比例6-7的效果对比图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

一种柠檬酸酯琼脂的制备方法，其特征在于，将琼脂经过一次机械活化后与柠檬酸反应得到柠檬酸酯琼脂，包括以下步骤：

A1.将琼脂进行螺杆挤压处理得到螺杆挤压琼脂粉；

A2.将柠檬酸溶解在去离子水中，调节溶液pH值后加入螺杆挤压琼脂粉；

A3.静置过夜后干燥；

A4.高温固相酯化，水洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。

进一步，所述A1中，螺杆挤压条件为加工温度110-130℃，水料比为1：10-2：5，螺杆转速100 -200rpm/min，出料压力2-6Mpa；

任选的，柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1：20-1：4。

进一步，所述A2中，溶液的pH值为3.5-5.5。

进一步，所述A3中，干燥温度为35-40℃，干燥时间为36-48h。

进一步，所述A4中，酯化温度为100-130℃，酯化时间为1h-6h。

实施例1：

A1.螺杆挤压琼脂粉制备：将琼脂粉与蒸馏水按照重量比5：1的比例混合后搅拌均匀，缓慢加入至螺杆挤压机，设定加工温度为120℃、螺杆转速为150rpm/min、出料压力为5Mpa，出口冷却至室温后干燥、粉碎得到螺杆挤压琼脂粉，作为原料备用。

A2.柠檬酸溶液配制：固定螺杆挤压琼脂粉质量为20g，按照柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1:5称取柠檬酸并将其溶解在75mL去离子水中，用10mol/L NaOH调节溶液pH为4.0后将溶液用去离子水定容至80mL。

A3.静置过夜：将螺杆挤压琼脂粉与柠檬酸溶液混合均匀，并在室温下静置过夜。随后将混合物在35℃的热风循环烘箱中干燥48h并粉碎过筛。

A4.高温酯化：将粉碎后的混合物粉末置于120℃的烘箱中反应1～3h，反应后使用蒸馏水清洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂(CA)。测定其取代度(DS)和溶解温度。

实施例2柠檬酸添加量对柠檬酸酯化琼脂性能的影响实验

柠檬酸溶液配制：固定螺杆挤压琼脂粉质量为20g，按照柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1:20～1:4称取柠檬酸并将其溶解在75mL去离子水中，用10mol/L NaOH调节溶液pH为3.5后将溶液用去离子水定容至80mL。

静置过夜：将螺杆挤压琼脂粉与柠檬酸溶液混合均匀，并在室温下静置过夜。随后将混合物在35℃的热风循环烘箱中干燥48h并粉碎过筛。

高温酯化：将粉碎后的混合物粉末置于110℃的烘箱中反应3h，反应后使用蒸馏水清洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。测定其取代度(DS)和溶解温度。取代度(DS)的测定：将1.0g干燥琼脂样品分散在50mL的蒸馏水中，然后加入三滴1％(w/v)的酚酞作为指示剂。加入0.1mol/L的NaOH溶液直到悬浮液从无色变为粉红色，以完全去除游离的羧酸。随后，向混合物中加入5.0mL 0.5mol/L NaOH溶液，在50℃下震荡皂化1h。最后，使用0.5mol/L标准盐酸溶液滴定，并记录滴定终点消耗的盐酸溶液的量。经由同样程序的NA样品作为空白。使用公式计算DS。A％＝(V

结果见图1。可以看出，当所添加柠檬酸的pH为3时，随着柠檬酸添加量从5％(W/W)增加到25％，制备得到的柠檬酸酯化琼脂的取代度也是逐渐增加，从0.05逐渐提高到近0.14；而溶解温度则由85℃下降到69℃左右。

实施例3添加不同pH值柠檬酸对柠檬酸酯化琼脂性能的影响实验

柠檬酸溶液配制：固定螺杆挤压琼脂粉质量为20g，按照柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1:5称取柠檬酸并将其溶解在75mL去离子水中，用10mol/L NaOH调节溶液pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5后将溶液用去离子水定容至80mL。

静置过夜：将螺杆挤压琼脂粉与柠檬酸溶液混合均匀，并在室温下静置过夜。随后将混合物在35℃的热风循环烘箱中干燥48h并粉碎过筛。

高温酯化：将粉碎后的混合物粉末置于110℃的烘箱中反应3h，反应后使用蒸馏水清洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。测定其取代度(DS)和溶解温度。

结果见图2。可以看出，当柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1:5时，随着柠檬酸pH值从3.5到5.5，制备得到的柠檬酸酯化琼脂的取代度逐步降低，当pH从4升到4.5时，取代度下降幅度最大；从0.11降到近0.03；当pH从原始柠檬酸pH值调到3.5时，溶解温度从近85℃大幅度下降到70℃，之后随着pH值升高，溶解温度逐渐上升，pH值为5.5时，溶解温度为84℃左右。

实施例4高温酯化温度对柠檬酸酯化琼脂性能的影响实验

柠檬酸溶液配制：固定螺杆挤压琼脂粉质量为20g，按照柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1:5称取柠檬酸并将其溶解在75mL去离子水中，用10mol/L NaOH调节溶液pH为4.0后将溶液用去离子水定容至80mL。

静置过夜：将螺杆挤压琼脂粉与柠檬酸溶液混合均匀，并在室温下静置过夜。随后将混合物在35℃的热风循环烘箱中干燥48h并粉碎过筛。

高温酯化：将粉碎后的混合物粉末置于90～130℃的烘箱中反应3h，反应后使用蒸馏水清洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。测定其取代度(DS)和溶解温度。

结果见图3。可以看出，随着高温酯化温度从90到130℃，制备得到的柠檬酸酯化琼脂的取代度也是逐渐增加，从近0逐渐提高到超过0.2；溶解温度则先下降再上升：高温酯化温度从90℃到120℃时，溶解温度从85℃降到70℃；高温酯化温度从120℃到130℃时，溶解温度从70℃快速升到约93℃。

实施例5高温酯化时间对柠檬酸酯化琼脂性能的影响实验

柠檬酸溶液配制：固定螺杆挤压琼脂粉质量为20g，按照柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1:5称取柠檬酸并将其溶解在75mL去离子水中，用10mol/L NaOH调节溶液pH为4.0后将溶液用去离子水定容至80mL。

静置过夜：将螺杆挤压琼脂粉与柠檬酸溶液混合均匀，并在室温下静置过夜。随后将混合物在35℃的热风循环烘箱中干燥48h并粉碎过筛。

高温酯化：将粉碎后的混合物粉末置于120℃的烘箱中反应1h、2h、3h、4h、5h、6h，反应后使用蒸馏水清洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。测定其取代度(DS)与溶解温度。

结果见图4-5。从图4可以看出，随着高温酯化时间从1h到6h，制备得到的柠檬酸酯化琼脂的取代度也是逐渐增加，从约0.06逐渐提高到超过0.178；溶解温度则先下降再上升：高温酯化时间从0h到3h时，溶解温度从85℃降到72℃；高温酯化时间从3h到6h时，溶解温度从70℃快速升到超过90℃。

从图5可以看出，从图5可以看出，改性琼脂在1738cm-1处显示了一个明显的吸收峰，其强度随着反应时间的增加而增加，说明柠檬酸与琼脂成功反应，形成了酯基。

对比例1

柠檬酸溶液配制：固定琼脂粉(未经螺杆挤压)质量为20g，按照柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为1:5称取柠檬酸并将其溶解在75mL去离子水中，用10mol/L NaOH调节溶液pH为4.0后将溶液用去离子水定容至80mL。

静置过夜：将未经螺杆挤压琼脂粉(未经螺杆挤压)与柠檬酸溶液混合均匀，并在室温下静置过夜。随后将混合物在35℃的热风循环烘箱中干燥48h并粉碎过筛。

高温酯化：将粉碎后的混合物粉末置于120℃的烘箱中反应1～3h，反应后使用蒸馏水清洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。测定其取代度(DS)和溶解温度。

结果见表1。

表1不同琼脂处理后的效果比较表

对比例2

柠檬酸溶液配制：固定未螺杆挤压琼脂粉质量为20g，按照柠檬酸的用量与琼脂粉的重量比为3：10，称取柠檬酸并将其溶解在75mL去离子水中，用10mol/L NaOH调节溶液pH为3.0后将溶液用去离子水定容至80mL。

静置过夜：将螺杆挤压琼脂粉与柠檬酸溶液混合均匀，并在室温下静置过夜。随后将混合物在35℃的热风循环烘箱中干燥48h并粉碎过筛。

高温酯化：将粉碎后的混合物粉末置于140℃的烘箱中反应3h，反应后使用蒸馏水清洗、烘干、粉碎，得到柠檬酸酯化琼脂。该制备得到的柠檬酸酯化琼脂焦化，在140℃下被柠檬酸强烈分解。

结果见图6的(A

实施例6不同取代度酯化琼脂凝胶基乳液稳定性

配置5％(w/w)不同取代度的酯化琼脂(DS＝0.071，0.091，0.102，0.122，0.145，0.148)溶液，冰浴冷却形成凝胶后，再加入去离子水，去离子水与凝胶质量比例为4：1。使用高速剪切机10000下处理3min，得到水相1％(w/w)凝胶悬浮液。

调节凝胶悬浮液pH为7，将40g凝胶悬浮液与10g大豆油混合高速剪切10000rpm下处理3min后以2Mpa高压均质循环3次后得到不同取代度酯化琼脂凝胶基乳液CAGE-1(对应DS＝0.071的酯化琼脂)、CAGE-2(对应DS＝0.091的酯化琼脂)、CAGE-3(对应DS＝0.102的酯化琼脂)、CAGE-4(对应DS＝0.122的酯化琼脂)、CAGE-5(对应DS＝0.145的酯化琼脂)和CAGE-6(对应DS＝0.148的酯化琼脂)。储藏稳定性：25℃储藏30d。离心稳定性：25℃在10000×g离心30min。乳化活力指数(EAI)：取新鲜的乳液(20μL)样品，用5mL的0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液稀释。利用紫外-可见分光光度计在500nm处测量震荡后0分钟(A

结果见图7的(A),图8的(A)和图9的(A)。

对比例3

配置5％(w/w)未酯化琼脂溶液，冰浴冷却形成凝胶后打碎，再加入去离子水，去离子水与凝胶质量比例为4：1。使用高速剪切机10000下处理3min，得到水相1％(w/w)凝胶悬浮液。

调节凝胶悬浮液pH为7，将40g凝胶悬浮液与10g大豆油混合高速剪切10000rpm下处理3min后以2Mpa高压均质循环3次后得到未酯化琼脂凝胶基乳液NAGE

结果见图7的(A),图8的(A)和图9的(A)。经过实施例6和对比例3的对比，可以看出，NAGE

实施例7乳液在不同pH下的稳定性

配置5％(w/w)酯化琼脂(DS＝0.145)溶液，冰浴冷却形成凝胶后，再加入去离子水，去离子水与凝胶质量比例为4：1。使用高速剪切机10000下处理3min，得到水相1％(w/w)凝胶悬浮液。

调节凝胶悬浮液pH为1，3，5，7，9和11，将40g凝胶悬浮液与10g大豆油混合高速剪切10000rpm下处理3min后以2Mpa高压均质循环3次后得到乳液CAGE-5

结果见图7的(A),图8的(A)和图9的(A)。

对比例4

配置5％(w/w)未酯化琼脂溶液，冰浴冷却形成凝胶后，再加入去离子水，去离子水与凝胶质量比例为4：1。使用高速剪切机10000下处理3min，得到水相1％(w/w)凝胶悬浮液。

将40g凝胶悬浮液与10g大豆油混合高速剪切10000rpm下处理3min后以2Mpa高压均质循环3次后得到乳液NAGE。储藏稳定性：25℃储藏30d。离心稳定性：25℃在10000×g离心30min。乳化活力指数(EAI)：取新鲜的乳液(20μL)样品，用5mL的0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)溶液稀释。利用紫外-可见分光光度计在500nm处测量震荡后0分钟(A

结果见图7的(A),图8的(A)和图9的(A)。经过实施例7和对比例4的对比，可以看出，NAGE在储存第一天出现了明显的分层，且随着储存时间的增加NAGE的分层逐渐明显；在不同的pH值条件下，CAGE-5

实施例8

将0.1％(w/w)的维生素D3溶解在大豆油中，并在pH值为9的条件下，将水相1％(w/w)酯化琼脂(DS＝0.145)的凝胶悬浮液与溶解了维生素D3的大豆油制备成乳液，并在第0，3，7天测量包封效率。

将50mg/L的姜黄素溶解在大豆油中，在pH值为5的情况下，将水相1％(w/w)酯化琼脂(DS＝0.145)的凝胶悬浮液与溶解了姜黄素的大豆油制备成乳液，并在第0，3，7天测量保留率。

结果见图10。

对比例5

将0.1％(w/w)的维生素D3溶解在大豆油中，并在pH值为9的条件下，将水相1％(w/w)原琼脂的凝胶悬浮液与溶解了维生素D3的大豆油制备成乳液，并在第0，3，7天测量包封效率。

将50mg/L的姜黄素溶解在大豆油中，在pH值为5的情况下，将水相1％(w/w)原琼脂的凝胶悬浮液与溶解了姜黄素的大豆油制备成乳液，并在第0，3，7天测量保留率。

结果见图10。经过实施例8和对比例5的对比，可以看出，在pH值为9的条件下，随着时间的增加，NAGE与CAGE-5的包封效率均有所降低：NAGE的包封效率从75.95％降低到67％，CAGE-5的包封效率从99.46％降低到94.9％，但CAGE-5中维生素D3的包封效率始终高于NAGE的维生素D3包封效率；在pH值为5的条件下，随着时间的增加，NAGE与CAGE-5的姜黄素留存率均降低：NAGE的留存率从90.04％降低到86％，CAGE-5的留存率从96.44％降低到93％，但CAGE-5中姜黄素的留存率始终高于NAGE的姜黄素留存率。

实施例9

配置5％(w/w)酯化琼脂(DS＝0.122)溶液，冰浴冷却形成凝胶后打碎，再加入去离子水，去离子水与凝胶的质量比例为4：1、3：1和10：3。使用高速剪切机10000下处理3min，得到水相1％(w/w)、1.25％(w/w)和1.5％(w/w)凝胶悬浮液(即1％(w/w)CA，1.25％(w/w)CA，1.5％(w/w)CA)。

调节凝胶悬浮液pH为7，将40g凝胶悬浮液与10g大豆油混合高速剪切10000rpm下处理4min后以10Mpa高压均质循环5次后得到热可逆乳液。

对比例6

配置5％(w/w)酯化琼脂(DS＝0.122)溶液，冰浴冷却形成凝胶后打碎，再加入去离子水，去离子水与凝胶的质量比例为20：3。使用高速剪切机10000下处理3min，得到水相0.75％(w/w)凝胶悬浮液(即0.75％(w/w)CA)。

调节凝胶悬浮液pH为7，将40g凝胶悬浮液与10g大豆油混合高速剪切10000rpm下处理4min后以10Mpa高压均质循环5次后得到乳液。

对比例7

配置5％(w/w)未酯化琼脂溶液，冰浴冷却形成凝胶后打碎，再加入去离子水，去离子水与凝胶的质量比例为10：3。使用高速剪切机10000下处理3min，得到水相1.5％(w/w)凝胶悬浮液(即1.5％(w/w)NA)。

调节凝胶悬浮液pH为7，将40g凝胶悬浮液与10g大豆油混合高速剪切10000rpm下处理4min后以10Mpa高压均质循环5次后得到乳液。

结果见图11。经过实施例9与对比例6的对比，可以看出，第一次循环后未酯化琼脂制备的乳液凝胶发生了明显的分层，无法形成稳定的乳液，而1％(w/w)CA、1.25％(w/w)CA和1.5％(w/w)CA制备的乳液凝胶在经历第7次循环后仅有少量油析出。经过实施例9与对比例7的对比，可以看出，0.75(w/w)CA制备的乳液在加热-冷却的循环处理下保持稳定，但无法形成稳定的乳液凝胶，而1％(w/w)CA、1.25％(w/w)CA和1.5％(w/w)CA制备的乳液凝胶在经历第7次循环后仅有少量油析出。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。